孕婦外周血中游離胎兒DNA富集與分離方法及在無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

楊麒巍，于 杉 綜述，張桂珍審校

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130033）

在我國(guó)，每年新生兒出生缺陷多達(dá)80萬(wàn)至120萬(wàn)，盡早進(jìn)行產(chǎn)檢篩查和診斷是最有效的應(yīng)對(duì)措施，然而目前常規(guī)的診斷方法皆為有創(chuàng)性方法，對(duì)胎兒和孕婦都有一定的危險(xiǎn)性，因此發(fā)展新的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷具有重要的臨床意義。1997年Lo等[1]發(fā)現(xiàn)在孕婦血漿中存在著少量的游離胎兒DNA（Cellfree fetal DNA，cffDNA），為無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法提供了新的途徑。孕婦從懷孕第7周開(kāi)始即可檢測(cè)到cffDNA，在最初3個(gè)月內(nèi)cffDNA含量每周增加約21%，在隨后的3個(gè)月進(jìn)入平臺(tái)期，在分娩前又迅速增加，分娩后2小時(shí)內(nèi)迅速消失。cffDNA的這一特點(diǎn)使其可以早期、特異地進(jìn)行產(chǎn)前篩查和診斷，且不易受到以往妊娠的干擾，由此可見(jiàn)，孕婦血漿中的cffDNA是進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的理想材料。目前，cffDNA已經(jīng)應(yīng)用于胎兒性別鑒定、常染色體遺傳病如β地中海貧血、軟骨發(fā)育不全、RhD血型鑒定、非整倍體遺傳病如21（18／13）－三體綜合征等、性染色體連鎖性疾病如X染色體連鎖的血友病、脆性X綜合征等遺傳性疾病的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中。

然而孕婦外周血中cffDNA含量極少，僅為血漿總游離DNA的19%左右，并且與大量的母體血漿游離DNA混雜在一起，給cffDNA的檢測(cè)和分析造成了極大的困難，如何從孕婦外周血中高效富集cffDNA已經(jīng)成為研究的焦點(diǎn)。目前，根據(jù)cffDNA分子與母體血漿游離DNA的差異分離cffDNA的方法主要可以歸納為cffDNA高效富集法和cffDNA特異性分離法，本文將對(duì)于以上幾種方法與其相關(guān)研究以及在無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)要概述。

1 cffDNA高效富集法

1.1 凝膠電泳法

2004年，Chan等[2]發(fā)現(xiàn)，血漿中大多數(shù)cffDNA分子片段長(zhǎng)度小于313bp，而大多數(shù)母體DNA分子片段長(zhǎng)度大于313bp，根據(jù)這一重要特點(diǎn)，可以依據(jù)DNA分子片段長(zhǎng)度的差異，特異性富集片段長(zhǎng)度小于300bp的DNA分子，從而達(dá)到高效富集cffDNA的目的。

將DNA分子按照片段長(zhǎng)度分開(kāi)，最簡(jiǎn)單有效的方法就是凝膠電泳法。Li等[3]利用從孕婦血漿中提取到的游離DNA進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，然后參照DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)分別切取DNA分子量為90－23，000bp等部位的凝膠，并回收其中的DNA片段，利用實(shí)時(shí)PCR（real－time PCR）方法測(cè)定其回收的DNA含量及來(lái)源。該實(shí)驗(yàn)首次利用瓊脂糖凝膠電泳的方法分離出孕婦血漿中游離的小片段DNA，并且進(jìn)一步證明了Chan等[2]關(guān)于孕婦血漿中cffDNA片段大多小于300bp，而母體游離DNA片段大多大于300bp這一結(jié)論，同時(shí)證明了大片段游離DNA（例如＞20kb）中不含有cffDNA。利用瓊脂糖凝膠電泳富集cffDNA雖然存在分離不精確、回收效率低、容易引入外源性污染等缺點(diǎn)，但是可以有效地降低母體游離DNA背景的干擾。

此后，研究者們分別結(jié)合不同的檢測(cè)方法，支持了利用瓊脂糖凝膠電泳分離孕婦血漿中小片段DNA的可行性。Jorgez等[4]利用凝膠電泳法分離孕婦血漿中10－2，000bp長(zhǎng)度的DNA片段，并對(duì)其進(jìn)行全基因組擴(kuò)增（Whole Gene Amplification，WGA），首次證明了凝膠電泳法分離的cffDNA可以通過(guò)WGA進(jìn)行擴(kuò)增富集，從而獲得足夠量的cffDNA用于進(jìn)一步的基因檢測(cè)。Li等[5]在Ding等[6]關(guān)于應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix－assisted laser desorption／ionization timeof－flight mass spectrometry，MALDI－TOF MS）技術(shù)研究孕婦血漿中總游離DNA單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）的基礎(chǔ)上，應(yīng)用凝膠電泳富集后的cffDNA進(jìn)行MALDI－TOF MS，極大地提高了 MALDI－TOF MS的靈敏度，同時(shí)基于此方法優(yōu)化了單等位基因位點(diǎn)延伸反應(yīng)（Single allele base extension reaction，SABER），克服了應(yīng)用孕婦血漿總游離DNA進(jìn)行SABER或同質(zhì)質(zhì)量延伸（homogenous MassEXTEND，hME）檢測(cè)時(shí)靈敏度低導(dǎo)致無(wú)法檢出的難題，極大地提高了利用cffDNA檢測(cè)SNP位點(diǎn)的靈敏度，并且應(yīng)用此方法成功進(jìn)行了兩例軟骨發(fā)育不全嬰兒的產(chǎn)前診斷，在軟骨發(fā)育不全胎兒的cffDNA中檢測(cè)到G1138A基因的突變，同時(shí)證明了應(yīng)用經(jīng)過(guò)尺寸分選后的小片段cffDNA與不經(jīng)過(guò)尺寸分選方法比較，診斷的靈敏度和特異性顯著提高，這一研究結(jié)果為單基因點(diǎn)突變的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了新的方法，但是應(yīng)用這種方法的成本十分昂貴，并不適用于大規(guī)模的臨床推廣以及普通實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。Li等[7]利用real－time PCR－肽核酸鉗制（Peptide－Nucleic－Acid Clamp）技術(shù)結(jié)合電泳富集cffDNA，應(yīng)用序列特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Allele－Specific Real－Time PCR）檢測(cè)IVSI－1，IVSI－6，IVSI－110 以 及codon 39等基因的點(diǎn)突變，進(jìn)行β－珠蛋白生成障礙性貧血的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，采用較為簡(jiǎn)單的方法，降低了檢測(cè)的成本，并且有利于利用cffDNA進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷面向臨床的推廣。

除了上述方法之外，為了提高DNA分離的準(zhǔn)確性、效率以及減少外源性污染，研究者們也在不斷嘗試應(yīng)用一些基于電泳原理的更有效的方法，例如毛細(xì)管電泳[8]、陰離子交換高性能液體色譜（anion exchange HPLC）[9]、凝膠過(guò)濾純化柱[10]、等速電泳（Isotachophoresis，ITP）[11]等方法，進(jìn)行cffDNA 的分離，同時(shí)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real－time quantitative PCR，Real－time qPCR）技術(shù)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，從而進(jìn)行胎兒性別鑒定、常染色體遺傳病胎兒血型鑒定等多種無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。

1.2 磁性分離法

根據(jù)磁性納米微粒可以吸附DNA的原理，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開(kāi)發(fā)出很多商品化的試劑盒，可以從血液或其他樣品中提取出痕量的DNA分子。瑞特等[12]通過(guò)優(yōu)化磁性微粒吸附過(guò)程中反應(yīng)體系的異丙醇及其他鹽離子濃度，控制磁珠特異性吸附孕婦血漿中的小片段DNA分子，從而達(dá)到高效富集cffDNA的作用，發(fā)明了一種利用磁性微粒法富集cffDNA的新方法?；诖判晕⒘Ｎ皆恚糠衷噭┕疽呀?jīng)生產(chǎn)出高效富集cffDNA的試劑盒，但仍無(wú)法完全去除樣品中的母體DNA干擾。目前，磁性分離法幾乎應(yīng)用于cffDNA無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的所有領(lǐng)域。

1.3 甲醛預(yù)處理法

以往的研究認(rèn)為，孕婦血漿中的母體DNA來(lái)自于凋亡的外周血細(xì)胞，基于這一理論，Dhallan等[13]將收集到的孕婦外周血用甲醛進(jìn)行預(yù)處理，穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，防止外周血中細(xì)胞破壞，然后利用常規(guī)方法提取血漿中的總游離DNA，從而有效地減少母體DNA背景的干擾。應(yīng)用PCR法進(jìn)行13號(hào)染色體、21號(hào)染色體上SNP位點(diǎn)的擴(kuò)增，通過(guò)計(jì)算拷貝數(shù)變化進(jìn)行13／21號(hào)染色體數(shù)量異常的診斷，進(jìn)而，應(yīng)用這一技術(shù)成功進(jìn)行了21－三體綜合征的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷[14]。遺憾的是雖然這一方法在發(fā)現(xiàn)初期得到了部分研究人員的驗(yàn)證[15]，但是在此后重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有得到滿意的結(jié)果[16]。

2 cffDNA特異性分離法

2.1 甲基化DNA免疫沉淀法

2002年，Poon等[17]通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，母體血細(xì)胞內(nèi)DNA甲基化水平與胎盤(pán)細(xì)胞內(nèi)DNA甲基化水平存在某些差異，而這種差異可以用來(lái)區(qū)分母體游離DNA和cffDNA。隨后，Chim等[18]利用亞硫酸氫鹽測(cè)序法分別對(duì)母體血細(xì)胞DNA及胎盤(pán)細(xì)胞DNA內(nèi)的18號(hào)染色體上的maspin基因甲基化水平進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)其在胎盤(pán)細(xì)胞內(nèi)呈低甲基化狀態(tài)，而在母體血細(xì)胞內(nèi)呈高甲基化狀態(tài)。Tong等[19]利用這一結(jié)論，聯(lián)合亞硫酸鹽預(yù)處理及甲基化特異性PCR方法，成功對(duì)18－三體綜合征進(jìn)行了診斷。然而這種方法需要大量的初始cffDNA樣本，并且在檢測(cè)過(guò)程中破壞了cffDNA的結(jié)構(gòu)，使檢測(cè)結(jié)果存在一定誤差，這些缺點(diǎn)阻礙了這種技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。

2009年，Papageorgiou等[20]利用甲基化 DNA免疫沉淀法（methylated DNA immunoprecipitation，MeDiP）聯(lián)合高通量寡核苷酸隊(duì)列分析技術(shù)，分別對(duì)于全血DNA和胎盤(pán)DNA的21、18、13、X和Y染色體進(jìn)行了系統(tǒng)的比較，共發(fā)現(xiàn)2000多個(gè)甲基化差異區(qū)域（differentially methylated regions，DMRs），為非整倍體疾病的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了大量的生物學(xué)標(biāo)志資料。MeDiP是通過(guò)DNA甲基化位點(diǎn)特異性抗體與cffDNA中的高甲基化位點(diǎn)結(jié)合，將cffDNA中含有高甲基化狀態(tài)而母血游離DNA呈低甲基化狀態(tài)的區(qū)域特異性沉淀，從而在大量母體游離DNA中特異性分離出cffDNA。隨后，研究人員應(yīng)用MeDiP分離孕婦血漿中cffDNA，并利用Real－time qPCR針對(duì)21號(hào)染色體上優(yōu)選的12個(gè)DMRs進(jìn)行擴(kuò)增并計(jì)算其拷貝數(shù)的比值，通過(guò)21號(hào)染色體DMR與內(nèi)參基因拷貝數(shù)比值的差異進(jìn)行21號(hào)染色體非整倍體疾病的診斷，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用MeDiP結(jié)合qPCR技術(shù)進(jìn)行多個(gè)DMRs的聯(lián)合檢測(cè)，并將擴(kuò)增結(jié)果通過(guò)加權(quán)計(jì)算公式計(jì)算，可以準(zhǔn)確的進(jìn)行21－三體綜合征的診斷，其靈敏度和特異度均可達(dá)到100%，并可以進(jìn)一步應(yīng)用到13－三體綜合征、18－三體綜合征、X或Y染色體數(shù)量異常等非整倍體性遺傳病的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷[21]。MeDiP具有靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)單且節(jié)約成本等諸多優(yōu)點(diǎn)，并且在懷孕早期即可進(jìn)行診斷。

2.2 擴(kuò)增測(cè)序法

Fan等[22]利用配對(duì)末端測(cè)序法（Paired－end sequencing），利用單堿基分解技術(shù)直接測(cè)量孕婦血漿中cffDNA的長(zhǎng)度分布情況，并且可以直接選取小片段的DNA分子進(jìn)行測(cè)序和分離，但是通過(guò)這種分子計(jì)數(shù)方法并沒(méi)有提高對(duì)于非整倍體遺傳病診斷的靈敏性。同時(shí)該課題組基于配對(duì)末端測(cè)序法開(kāi)發(fā)了一種基于長(zhǎng)度差異研究DNA分子特征的新方法[23]。

Lun等[24]在以往研究的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)出一種數(shù)字化核酸尺寸選擇方法（digital nucleic acid size selection，digital NASS），Digital NASS是在數(shù)字PCR的基礎(chǔ)上，利用基因擴(kuò)增原理，通過(guò)設(shè)置特定的雜交探針或擴(kuò)增引物，特異性將共軛DNA中較短的DNA分子擴(kuò)增，而較長(zhǎng)片段的DNA分子則不能被擴(kuò)增。Lun等用這種方法結(jié)合數(shù)字化相對(duì)突變劑量法（digital relative mutation dosage，digital RMD）和數(shù)字化相對(duì)染色體數(shù)量法（digital relative chromosome dosage，digital RCD），有效地提高了這兩種方法的檢出效率?？朔艘酝芯恐衃6]胎兒從母系遺傳的基因突變無(wú)法被檢測(cè)的限制。

2.3 微晶片法

Hahn等[25]設(shè)計(jì)了一種能夠從孕婦血漿中提取cffDNA的微型裝置，這個(gè)裝置是利用等速電泳技術(shù)（ITP）結(jié)合聚乙烯對(duì)苯二酰酯（polyethylene terephthalate，PET）膜和電動(dòng)捕集（Electrokinetic trapping，EKT）技術(shù)原理制作的微晶片，可以達(dá)到高載量、自動(dòng)化提取孕婦血漿中cffDNA的效果，并可以在低鹽的環(huán)境下進(jìn)行DNA的富集，有效避免了高鹽條件對(duì)于后續(xù)PCR反應(yīng)的影響，同時(shí)易于操作，成本較低，適用于臨床推廣。

孕婦血漿中cffDNA的發(fā)現(xiàn)為無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷開(kāi)辟了一條全新的途徑，然而cffDNA僅占血漿總游離DNA的4%－19%，并且尚未發(fā)現(xiàn)其特異性的遺傳標(biāo)志物，大量的母體血漿游離DNA背景使得cffDNA的應(yīng)用受到很大限制。目前針對(duì)cffDNA的研究，主要使用的仍是母體血漿總游離DNA，而分離cffDNA的方法又各有其優(yōu)缺點(diǎn)（見(jiàn)表1）。因此，如果能發(fā)展一種更加特異、高效地從孕婦血漿總游離DNA中富集分離cffDNA的方法，則可以極大地提高利用cffDNA進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的特異性與敏感性，擴(kuò)展適用范圍，促進(jìn)其診斷技術(shù)的發(fā)展與臨床的推廣應(yīng)用。

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