毛菍莖段離體培養(yǎng)

伍成厚，鄭慈真，代色平，孫砥柱，劉 文，黃春燕

(廣州市園林科學(xué)研究所，廣東 廣州 510405)

毛菍Melastoma sanguineumSims為野牡丹科野牡丹屬大灌木，分布于長江以南各省區(qū)，為海拔400m以下酸性土壤中常見植物[1]，全株或葉入藥，具解毒止痛、生肌止血等功效[2]。毛菍高1.5～3.0m，全株被長粗毛，葉卵狀披針形，開花期長，花朵碩大，花瓣粉紅色或紫紅色，果杯狀球形，密被紅色長硬毛，是優(yōu)良的觀花和觀果植物，可作庭園孤植樹、群植或行道樹[3-6]。

關(guān)于毛菍的研究當前主要集中在藥效成分分析[7]、形態(tài)學(xué)觀察[8-9]和傳粉生物學(xué)[10]等方面，有關(guān)其組織培養(yǎng)的研究僅限于種子培養(yǎng)[11]。文中采用毛菍枝條進行離體培養(yǎng)，以期探索出一條高效的無性繁殖途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自廣州市園林科學(xué)研究所培育的2年生毛菍容器袋苗，植株生長健壯、無病蟲危害，已經(jīng)開花結(jié)實。在2012年4～5月剪取當年生新梢作為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料消毒與接種

將枝條剪除葉片后浸泡在加有洗潔精的洗滌液中10～20min，用軟毛刷洗凈附著的塵土，再用自來水沖洗30min。在超凈工作臺上，將沖洗干凈的枝條用75％酒精浸潤30s，然后轉(zhuǎn)入0.1％的HgCl2溶液中消毒10min，再用無菌水沖洗5～6次后將枝條切成單芽帶節(jié)莖段，并迅速接到培養(yǎng)基上。啟動培養(yǎng)基為MS＋6-BA0.5mg/L＋NAA0.01mg/L，培養(yǎng)基添加精制白砂糖3％、卡拉膠0.51％，pH值5.8，121℃蒸汽滅菌20min。

1.2.2 芽的增殖

以離體萌發(fā)的腋芽進行芽的增殖試驗。增殖培養(yǎng)基為MS添加不同質(zhì)量濃度的細胞分裂素(6-BA)、生長素(NAA或IBA)和活性炭，精制白砂糖3％、卡拉膠0.51％，pH值5.8。每個培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種5株，45d后觀察芽的增殖效果。新芽的標準為芽點萌發(fā)并長出葉片。

新增芽數(shù)＝總芽數(shù)-接種芽數(shù)；

新芽增殖倍數(shù)＝新增芽數(shù)/接種芽數(shù)。

1.2.3 不定根的誘導(dǎo)

切取長度大于1cm的毛菍芽苗在1/2MS培養(yǎng)基上進行不定根的誘導(dǎo)。1/2MS培養(yǎng)基即MS基本培養(yǎng)基中大量元素質(zhì)量濃度降低50％，添加不同質(zhì)量濃度的NAA、IBA和活性炭，以及精制白砂糖2％、卡拉膠0.52％，pH值5.8。每個培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種5株。接種后30d觀察試管苗的生長狀況，并計算生根率和平均根數(shù)。長度在0.2cm以上且直接從芽苗基部長出的根才計數(shù)，而從這些根上分化出來的側(cè)根統(tǒng)一不計數(shù)。

生根率＝(生根苗數(shù)/接種苗數(shù))×100％；

平均根數(shù)＝根的總條數(shù)/長根苗數(shù)。

1.2.4 試管苗的移栽

試管苗在水簾溫室經(jīng)過15～20d煉苗，用自來水沖洗干凈根部的培養(yǎng)基后移到72孔穴盤中栽植，基質(zhì)采用進口泥炭，栽完后澆1次水，然后在水簾溫室內(nèi)常規(guī)管理。移栽30d后觀察試管苗成活情況，計算移栽成活率。

移栽成活率＝(成活苗數(shù)/觀察苗數(shù)) ×100％。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛菍芽的誘導(dǎo)和增殖

毛菍莖段離體培養(yǎng)后，切口處會產(chǎn)生輕微褐變，經(jīng)過20～30d培養(yǎng)莖段腋芽和頂芽均可以萌發(fā)，在培養(yǎng)基MS＋6-BA0.5mg/L＋NAA 0.01mg/L上可以獲得無菌芽(見圖1A)。

圖1 毛菍莖段離體培養(yǎng)Fig.1 Stem segment in vitro culture in M.sanguineum

無菌芽經(jīng)繼代培養(yǎng)后，在基部腋芽區(qū)域由于萌發(fā)眾多不定芽而形成芽叢(見圖1B),也有在基部切口處形成叢芽的(見圖1C)。芽的增殖方式除形成不定芽外，還可通過節(jié)間腋芽的萌發(fā)即誘導(dǎo)毛菍每個節(jié)間的2個腋芽萌發(fā)而得以實現(xiàn)(見圖1D)。

2.2 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和活性炭對毛菍芽增殖的影響

毛菍無根苗在不加生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和活性炭的MS培養(yǎng)基(對照)上，新芽增殖較少，增殖倍數(shù)僅為0.5，新芽全部為莖節(jié)腋芽萌發(fā)而來，且有18.0％的芽苗長根(見表1)。

培養(yǎng)基添加細胞分裂素和生長素后，芽的增殖數(shù)量明顯增加。當NAA質(zhì)量濃度為0.01mg/L時，隨著6-BA質(zhì)量濃度從0.1mg/L提高到2.0mg/L芽的增殖倍數(shù)也相應(yīng)地從1.4倍增至6.5倍，即芽的增殖倍數(shù)與6-BA的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性。6-BA與IBA0.01mg/L搭配使用也取得類似的培養(yǎng)效果(見表1)。雖然6-BA的質(zhì)量濃度越高芽的增殖倍數(shù)也越大，但當6-BA質(zhì)量濃度達到2.0mg/L時新增的芽苗葉片和莖細小，出現(xiàn)玻璃化苗，其形成的有效芽苗比率明顯降低。在MS＋6-BA1.0mg/L＋NAA0.01mg/L培養(yǎng)基上芽的增殖倍數(shù)為5.9，而MS＋6-BA1.0mg/L＋NAA0.01mg/L＋AC300mg/L培養(yǎng)基上增殖倍數(shù)僅為0.1，比對照的0.5倍還低，且有68.0％的無根苗長根，顯示培養(yǎng)基添加活性炭300mg/L，可以抵消6-BA對芽增殖的誘導(dǎo)效果。

表1 生長調(diào)節(jié)劑和活性炭對毛菍離體培養(yǎng)芽增殖的影響?Table 1 Effect of growth regulators and activated carbon on multiplication of buds in M.sanguineum

2.3 毛菍不定根的誘導(dǎo)

毛菍無根苗在MS基本培養(yǎng)基上有18.0％的芽苗長根，在1/2MS培養(yǎng)基上不定根的誘導(dǎo)率達到54.0％(見表2)，表明降低培養(yǎng)基鹽分濃度有利于毛菍不定根的誘導(dǎo)。

在1/2MS培養(yǎng)基添加生長素可以顯著提高不定根的誘導(dǎo)率。由表2可以看出，在添加了NAA0.1～0.5mg/L的培養(yǎng)基中毛菍不定根的誘導(dǎo)率均達到100％，平均根數(shù)也達到4～5條，并有較多側(cè)根的形成(圖1E)。IBA的誘導(dǎo)效果較NAA差，在添加了IBA0.1mg/L的培養(yǎng)基上生根率僅86.0％，根條數(shù)3.6，略低于NAA0.1mg/L處理中的3.9條。

在1/2MS＋NAA0.3mg/L培養(yǎng)基上添加活性炭300mg/L后，不定根的誘導(dǎo)率從100％降至46.0％，表明活性炭抑制了毛菍莖段根的誘導(dǎo)。但在MS＋6-BA1.0mg/L＋NAA0.01mg/L＋AC 300mg/L培養(yǎng)基上68.0％的毛菍無根苗長根(見表1)，顯示活性炭對毛菍長根有很好的誘導(dǎo)作用。前后2次試驗相互矛盾的結(jié)果揭示，活性炭對毛菍不定根的誘導(dǎo)之所以產(chǎn)生促進或抑制作用是因為活性炭吸附了培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，并不是活性炭本身對根的誘導(dǎo)有抑制或促進的作用，即在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入300mg/L AC后由于活性炭吸附了生長素從而不利于不定根的誘導(dǎo)。

2.4 毛菍試管苗的出瓶移栽

毛菍試管苗根系發(fā)達，在水簾溫室內(nèi)只需常規(guī)管理，移栽成活率超過95％(見表3)。試管苗移栽成活后，苗莖和葉柄由綠色變成紫紅色，葉片舒展，顯示旺盛的生命力(見圖1F)。

表2 生長素和活性炭對毛菍不定根誘導(dǎo)的影響?Table 2 Effect of auxins and activated carbon on adventitious root induction in M.sanguineum

表3 毛菍試管苗的移栽成活情況Table 3 Survival status of transplanted test-tube plantlets in M.sanguineum

3 討 論

野牡丹科植物全世界約240個屬，3 000余種，主要分布于世界各大洲熱帶或亞熱帶地區(qū)，本科植物中許多種類除可作藥用、食用外，多個屬種已被選育用于城市的園林綠化[12]。隨著其園林開發(fā)應(yīng)用的發(fā)展，野牡丹科植物的組織培養(yǎng)日益受到人們的重視。利用帶芽莖段進行快速繁殖，因組培苗發(fā)生變異少，能保持野牡丹植株的開花性狀，對優(yōu)良母株的快繁具有其它繁殖方式不可取代的優(yōu)越性。野牡丹屬Melastoma的野牡丹M.candidum[13]、地 稔M.dodecandrum[13-15]、細葉野牡丹M.intermedium[16]、印度野牡丹M.malabathricum[17]、展毛野牡丹M.normale[18]和紫毛野牡丹M.penicillatum[19]，以及金錦香屬Osbeckia的朝天罐O.opipara[20]、肉穗草屬Sarcopyramis的肉穗草S.nepalensis[21]和蒂牡花屬Tibouchina的角莖野牡丹T.granulosa[22]等植物莖段離體培養(yǎng)研究已獲得成功，而毛菍尚未見此類報道。毛菍為異花授粉植物，長期異花授粉導(dǎo)致毛菍的基因型高度雜合，使毛菍實生苗個體表現(xiàn)型之間產(chǎn)生差異，可以從中篩選性狀優(yōu)良的單株，本試驗中建立的莖段培養(yǎng)技術(shù)對于毛菍優(yōu)株的快繁并實現(xiàn)無性系化具有很好的應(yīng)用前景。

本試驗中毛菍芽的增殖有2種方式，一是在莖節(jié)基部腋芽區(qū)域或切口處形成不定芽并發(fā)育成叢生芽(見圖1B、C)；另一種方式是節(jié)間腋芽萌發(fā)，即每個莖節(jié)的2個腋芽萌發(fā)實現(xiàn)芽的增殖(見圖1D)。誘導(dǎo)節(jié)間腋芽萌發(fā)需要的激素質(zhì)量濃度較低，在低質(zhì)量濃度的6-BA(0～0.3mg/L)條件下即可誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，其增殖倍數(shù)在添加了BA 0.3mg/L和NAA0.01mg/L的培養(yǎng)基上達到3.7，在添加BA0.3mg/L和IBA0.01mg/L的培養(yǎng)基上為3.6倍。誘導(dǎo)莖節(jié)基部不定芽形成需要較高質(zhì)量濃度的6-BA(0.5～2.0mg/L)，在高質(zhì)量濃度6-BA條件下節(jié)間腋芽也基本萌發(fā)，并由此獲得較高的增殖倍數(shù)。由于低質(zhì)量濃度水平的6-BA可能發(fā)生變異的概率很低，從保持母株優(yōu)良特性的角度出發(fā)在芽增殖階段盡可能降低細胞分裂素質(zhì)量濃度是非常必要的。在BA0.3mg/L時芽的增殖達到3倍以上，已經(jīng)基本可以滿足快繁對芽增殖倍數(shù)的要求，因此毛菍芽的增殖方式以選擇誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)較為適宜。

在木本植物組織培養(yǎng)中常使用到活性炭以減輕褐變。在荔枝Litchi chinensis[23]、核桃[24]的莖段離體培養(yǎng)中，添加活性炭對抑制褐變有一定效果，在樟子松Pinus sylvestrisvar.mongolica[25]的成熟胚培養(yǎng)中附加活性炭對不定芽的生長與伸長有良好的促進作用。在油茶Camellia oleifera組培試驗中添加活性炭有利于幼苗的生長[26]，但不利于小孢子的離體發(fā)育[27]。在肉穗草長根試驗[21]中培養(yǎng)基添加1％活性炭時生根率達到90％以上，在本試驗中，添加活性炭對毛菍不定芽的增殖和不定根的分化均產(chǎn)生不利影響，因此毛菍組織培養(yǎng)中活性炭應(yīng)謹慎使用。

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