珍貴闊葉樹種刺楸離體繁殖技術(shù)

張麗杰，趙麗蒙，韓冬雪，白雪嬌，周永斌

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

刺楸Kalpanax septemlobus(Thunb.) Koidz，又名茨楸，為五加科Araliaceae刺楸屬Kalopanax落葉闊葉喬木[1]。刺揪是東北地區(qū)的珍貴闊葉樹種[2]，具有生長快、材質(zhì)優(yōu)良、根蘗能力強等特點，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值[3]、藥用價值[4]和觀賞價值，是一種多用途的樹種資源，已被列為國家二級珍貴保護(hù)樹種[5]。刺楸在我國分布廣泛，但由于多來年經(jīng)營管理不善，只砍不育以及濫砍盜伐現(xiàn)象較

為普遍，使刺楸存量資源逐年減少，導(dǎo)致該樹種瀕臨絕跡，目前僅存的刺楸資源零星散生于各分布區(qū)內(nèi)。因此，在保護(hù)現(xiàn)有野生刺楸資源的同時，應(yīng)加大人工繁殖力度，擴(kuò)大刺楸種群生長范圍，對刺楸野生種質(zhì)資源加大保護(hù)力度。國內(nèi)外關(guān)于刺楸的研究主要集中在種子休眠[6-10]、催芽技術(shù)[11]、種子繁育技術(shù)[12]、播種育苗技術(shù)[13-15]、營養(yǎng)繁殖[16-18]、組織培養(yǎng)[19-20]、人工林培育技術(shù)[21]、抗寒性[22]、材性[23]、系統(tǒng)發(fā)育[24]以及刺楸化學(xué)成分及生物活性[25-26]等方面。但由于刺楸成年樹體高大，取材不易，且種子休眠期長，發(fā)芽困難，發(fā)芽率僅在35％左右，常規(guī)的人工繁殖難以滿足林業(yè)生產(chǎn)的實際需要，因此，為了掌握刺楸的人工繁育技術(shù)，開發(fā)一整套適合于刺楸離體再生體系，提高繁殖速度，更好地開發(fā)利用和保護(hù)野生刺楸資源，緩解林業(yè)苗木危機，達(dá)到快繁的目的，本研究中以刺楸的成熟胚、休眠芽、幼嫩莖段為試驗材料，探索適合刺楸離體組織的滅菌、消毒和激素處理的方法，篩選適合其離體組織培養(yǎng)的滅菌劑、消毒時長和植物激素種類和濃度。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為成熟的刺楸種子、休眠芽和幼嫩莖段。分別于2012年12月初、3月初采取刺楸休眠枝，在實驗室進(jìn)行水培，每天換1次水，選取萌發(fā)的帶腋芽或頂芽的莖段作為外植體。

1.2 方 法

1.2.1 外植體的消毒和預(yù)處理

將成熟的種子提前浸泡2～3d，然后置于燒杯中，反復(fù)用流水沖洗，再用蒸餾水沖洗4～5次(不斷振蕩燒杯)，然后在超凈工作臺上用70％的酒精預(yù)消毒30s，再以0.1％HgCl2消毒8、10、12、14min后，立即用無菌水沖洗6～8次，備用。

將幼苗及采回的休眠枝條于室內(nèi)水培待腋芽萌發(fā)時，取帶腋芽或頂芽莖段于自來水下沖洗干凈，并剪成長2～3cm小段，置于燒杯中，反復(fù)用流水沖洗，再用蒸餾水沖洗4～5次，然后在超凈工作臺上用70％的酒精預(yù)消毒30s，再以0.1％HgCl2為消毒試劑消毒8、10、12、14min后，立即用無菌水沖洗5～7次，備用。

1.2.2 培養(yǎng)基及激素種類的選擇

本次試驗中共采用2種基本培養(yǎng)基：C2D、1/2MS(大量元素減半)。C2D培養(yǎng)基用于刺楸休眠芽接種培養(yǎng)的對比中，其余培養(yǎng)均使用1/2MS培養(yǎng)基。

1.2.3 初代培養(yǎng)

(1)休眠芽初代培養(yǎng)

為研究基本培養(yǎng)基對休眠芽分化成芽的影響，分別以C2D、1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加相同質(zhì)量濃度的激素6-BA 1.5mg/L、NAA 0.1mg/L，蔗糖質(zhì)量濃度為30g/L，瓊脂6.5g/L。將滅菌后的休眠芽接種到初代培養(yǎng)基上，每組處理7瓶，每瓶3個外植體，以相同的條件進(jìn)行培養(yǎng)。接種15d后，觀察統(tǒng)計腋芽離體萌發(fā)的情況，篩選適合刺楸休眠芽的培養(yǎng)基。

(2)幼嫩莖段初代培養(yǎng)

為了研究不同激素及其配比質(zhì)量濃度對刺楸幼嫩莖段萌芽的影響，以帶腋芽或頂芽的幼嫩莖段為外植體，進(jìn)行相同時間的消毒，以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)置4組激素配比試驗(見表1)，每組20瓶，每瓶中放置1個外植體。供試激素為細(xì)胞分裂素6-BA和生長素NAA，蔗糖質(zhì)量濃度為30g/L，瓊脂6.5g/L。將滅菌后的帶芽莖段接種到初代培養(yǎng)基上。每3～5d觀察1次，記錄萌發(fā)率及萌發(fā)芽高度和生長狀態(tài)等，篩選適合刺楸腋芽增殖的初代培養(yǎng)方法。

表1 幼嫩莖段初代培養(yǎng)激素質(zhì)量濃度設(shè)計Table 1 Design of mass concentrations of hormones in primaryculture of tender stem segments mg/L

1.2.4 繼代培養(yǎng)

根據(jù)上述外植體在滅菌方法及基本培養(yǎng)基方面的誘導(dǎo)結(jié)果，將初代培養(yǎng)中由腋芽萌發(fā)形成的枝條切割下來轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)其腋芽再萌發(fā)出新枝或從基部產(chǎn)生叢生芽。篩選出萌發(fā)情況好的外植體，進(jìn)一步進(jìn)行增殖培養(yǎng)。以1/2MS為基本培養(yǎng)基，供試細(xì)胞分裂素有6-BA，生長素NAA，其質(zhì)量濃度和配比為初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)芽萌發(fā)和生長作用效果最好的，蔗糖質(zhì)量濃度為30g/L，瓊脂6.5g/L，pH為5.8。

1.2.5 生根培養(yǎng)

將通過腋芽萌發(fā)繼代芽產(chǎn)生的發(fā)育完整的枝條切割下來，經(jīng)壯苗培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，將不定芽放入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。生根誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，供試生長素為NAA(0.1mg/L)、IAA(0.1mg/L)，同時附加蔗糖質(zhì)量濃度為20、30g/L，瓊脂為6.5g/L，pH為5.8，具體配比方式見表2。觀察生根情況，記錄生根率及根的狀況，15d后統(tǒng)計各處理中的生根率。

1.2.6 煉苗與移栽

移栽前1周左右的時間，將繼代苗從培養(yǎng)室中移到溫室苗床上，去掉瓶蓋，進(jìn)行煉苗，使小苗逐漸適應(yīng)外界的環(huán)境。鍛煉3～5d后進(jìn)行移栽，移栽基質(zhì)為草炭土＋細(xì)沙(體積比1∶1)和草炭土＋珍珠巖(1∶1)2種基質(zhì)的混合物?；|(zhì)先進(jìn)行滅菌，放入塑料杯中。移栽時，先用鑷子將生根的試管苗從瓶中輕輕夾出，注意保護(hù)根系，用清水洗凈粘在根部的培養(yǎng)基，植入基質(zhì)中，要讓根系盡量舒展，隨栽隨噴霧以保持濕度，移栽時將水澆透。移栽完畢將苗床罩透明塑料薄膜，保持相對濕度在80％以上。2周后逐漸揭去薄膜，1周后調(diào)查移栽狀況。

表2 生根培養(yǎng)基激素和蔗糖質(zhì)量濃度設(shè)計Table 2 Design of mass concentration of hormone and sucrose in rooting medium

2 結(jié)果與分析

2.1 初代培養(yǎng)中腋芽離體培養(yǎng)的影響因素

2.1.1 不同消毒時長對外植體離體培養(yǎng)的影響

選擇0.1％HgCl2作為消毒試劑。對成熟胚、休眠芽以及幼嫩莖段均采用8、10、12、14min的消毒時長梯度，觀察統(tǒng)計污染的情況(見圖1)。培養(yǎng)15d后不同消毒時長處理中外植體的狀況見表3。

圖1 不同消毒時長的污染狀況Fig.1 Pollution status of different sterilization duration

表3 培養(yǎng)15天后不同消毒時長對外植體的影響Table 3 Effects of different sterilization duration on cultured explants after 15 days

為了研究不同消毒時長對不同外植體污染率和成活率的影響，選用3種外植體，即成熟胚、休眠芽、幼嫩莖段，在相同的消毒時長梯度(8、10、12、14min)下，探索最佳的消毒時長。對不同外植體類型及消毒時長處理中的污染率進(jìn)行方差分析和多重比較，結(jié)果分別見表4和表5。

從表4、表5可以看出：成熟胚相對于休眠芽、幼嫩莖段的污染情況是極顯著的，消毒時長為8min處理的污染情況極顯著高于其它處理。成熟胚的消毒成功率為0，隨著消毒時長的增加，染菌率降低，同時褐化率升高。在對種子消毒處理過程中，污染率較大的原因可能是種皮木質(zhì)堅硬，使得消毒試劑難以做到全面消毒。同時，在自然狀態(tài)下，五加屬的部分植物存在種子發(fā)芽率低、需要經(jīng)過種胚生理后熟的問題，刺揪種子先天種胚發(fā)育不完全，也存在上述問題，其成活率較低，發(fā)芽率僅在35％左右。

表4 外植體類型及消毒時長處理中外植體污染情況的方差分析Table 4 Variance analysis of polluted explants situation in explants type and sterilization duration treatments

表5 外植體類型及消毒時長處理中外植體污染情況的試驗結(jié)果?Table 5 Test result of polluted explants situation in explants type and sterilization duration treatments

對于莖段消毒試劑的選擇上，根據(jù)同科的刺五加的試驗結(jié)果：用75％的酒精浸泡40s，后用0.1％的升汞消毒8min，污染率較低，成活率最高，效果理想[27]。

由表3可知，幼嫩莖段相對于休眠芽消毒處理成活率較高。對于帶芽的木質(zhì)化莖段而言，只有在水平3，即在0.1％升汞消毒12min的處理時，污染率稍低，成活率高；而在水平1、2中，污染率較高；在水平4中，褐化率較高(見圖2)。對于幼嫩莖段而言，水平2，即10min的消毒試劑處理污染率低、褐化率低、成活率高，生長狀況相對較好(見圖2)。

圖2 休眠芽和幼嫩莖段的初代培養(yǎng)Fig.2 Status of a dormant bud and a tender stem segment during original culture

通過成熟胚、休眠芽和幼嫩莖段3種外植體的消毒效果比較可知：相對于成熟胚和休眠芽而言，幼嫩莖段消毒相對容易，污染率低，而且褐化率低，生長狀況較好。這主要是由于幼嫩的莖段在一定程度上避免了因生長時間長而使莖段與腋芽夾角造成的高污染率。所以對于刺楸而言，應(yīng)選擇幼嫩的莖段進(jìn)行試驗。

2.1.2 不同基本培養(yǎng)基對休眠芽萌發(fā)的影響

不同基本培養(yǎng)基對休眠芽萌發(fā)影響的具體結(jié)果如表6所示。由表6可以看出，使用1/2MS作為基本培養(yǎng)基較有利于休眠芽的萌發(fā)，萌發(fā)率可達(dá)66.7％以上，且死亡率相對于C2D培養(yǎng)基較低。造成上述情況的原因可能是：在特定時期和特定環(huán)境條件下采集的休眠芽外植體的生理狀況和內(nèi)源激素水平適合特定的基本培養(yǎng)基，1/2MS培養(yǎng)基所含的元素和濃度較適合此時采集的休眠芽生長，使之細(xì)胞分裂加強，表現(xiàn)為發(fā)芽時間短，植株粗壯，長勢快，發(fā)葉翠綠。因此休眠芽在相同的培養(yǎng)條件和消毒條件下產(chǎn)生了不同的表現(xiàn)，所以選用1/2MS基本培養(yǎng)基進(jìn)行刺楸休眠芽快繁較為理想。

2.1.3 不同激素濃度對幼嫩莖段萌芽的影響

不同濃度激素對刺楸腋芽萌發(fā)率的影響具體情況見表7，其方差分析及多重比較結(jié)果分別見表8和表7。由表7和表8可以看出：培養(yǎng)基所添加的激素水平對腋芽萌發(fā)有顯著影響，處理4和處理2中萌發(fā)率極顯著高于處理1和處理3。同時對比處理1、4(NAA質(zhì)量濃度不變，6-BA質(zhì)量濃度升高)，結(jié)果顯示：隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，腋芽的萌發(fā)率表現(xiàn)上升趨勢，表明6-BA對芽的萌發(fā)有促進(jìn)作用。比較處理2、4(6-BA質(zhì)量濃度不變，NAA質(zhì)量濃度升高)，結(jié)果顯示：當(dāng)NAA的質(zhì)量濃度明顯提高時，腋芽的萌發(fā)率有所降低，表明NAA抑制腋芽的萌發(fā)。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度達(dá)到2.0mg/L，NAA為0.1mg/L時，刺楸的腋芽萌發(fā)率最高(85％)，而且萌發(fā)芽的長勢好，腋芽綠色，生長健壯(見圖3)。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度達(dá)到2.0mg/L，NAA為0.2mg/L時，在誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)時，其基部形成膨大，產(chǎn)生愈傷組織明顯(見圖4)。

表6 不同基本培養(yǎng)基對休眠芽萌發(fā)的影響Table 6 Effect of different basic media on germination of dormant buds

表7 不同質(zhì)量濃度激素對刺楸腋芽萌發(fā)率的影響Table 7 Effect of different mass concentrations of hormones on germination rate of axillary buds in K.septemlobus

表8 不同質(zhì)量濃度激素處理中刺楸腋芽萌發(fā)狀況的方差分析?Table 8 Variance analysis of germination rate of axillary buds in K.septemlobus in different mass concentrations treatments of hormones

圖3 刺楸腋芽的離體萌發(fā)Fig.3 Germination in vitro of axillary buds in K.septemlobus

圖4 不同激素組合對刺楸莖段基部腋芽萌發(fā)的影響Fig.4 Effect of different hormone combinations on germination of axillary buds from the base of stem sections in K.septemlobus

通過以上分析，篩選出對于刺楸腋芽萌發(fā)的激素質(zhì)量濃度和配比以1/2MS＋2.0mg/L 6-BA＋0.1mg/L NAA是最適培養(yǎng)基。

2.1.4 培養(yǎng)物的褐化

消毒時長和外植體類型對褐變的影響具體情況見表9，其方差分析及多重比較結(jié)果分別見表10和表9。從表9、表10和圖5可以看出：對于外植體類型而言，成熟胚褐化程度最高，相對未木質(zhì)化的幼嫩莖段而言休眠芽褐變的程度更高，說明刺楸幼嫩的外植體褐變的程度較輕。而對于消毒時長為14min和以種子作為外植體對褐化情況影響顯著。對于消毒時長而言，消毒時長越長，外植體褐變程度越嚴(yán)重。

表9 消毒時長和外植體類型對外植體褐變的影響Table 9 Effect of sterilization duration and explants types on explants browning ％

表10 消毒時長和外植體類型處理中褐變狀況的方差分析Table 10 Variance analysis of explants browning status in explants type and sterilization duration treatments

圖5 不同消毒時長對不同外植體褐化的影響Fig.5 Effect of different sterilization durations on browning of different explants

2.2 腋芽的繼代培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)基直接選用在初代腋芽萌發(fā)試驗中效果最好的1/2MS＋2.0mg/L 6-BA＋0.1mg/L NAA培養(yǎng)基，觀察芽的萌發(fā)和生長表現(xiàn)。將2cm以上的無菌萌發(fā)芽從誘導(dǎo)成功的原莖段上切下，再分別將其切成1cm左右的帶1～2個腋芽的莖段，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中。15d后，增殖芽的生長普遍良好(見圖6)，幾乎無污染情況發(fā)生，可適時進(jìn)行生根培養(yǎng)。

2.3 生根培養(yǎng)

對于木本植物的組織培養(yǎng)，試管苗的生根問題一直是一個難點。一般認(rèn)為，6-BA是植物的生根抑制物質(zhì)，而生長素是生根所必須物質(zhì)。經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)無菌苗培養(yǎng)15d時，在無菌苗的基部有的產(chǎn)生了愈傷組織(見圖7)。在水平3中，有的在無菌苗基部的愈傷組織上長出了較短的不定根。因此，刺楸生根培養(yǎng)中以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加0.1mg/LNAA、20g/L蔗糖，效果最佳。

圖6 無菌苗增殖培養(yǎng)Fig.6 Proliferation culture of aseptic seedlings

2.4 煉苗與移栽

試管苗的移栽要經(jīng)過移栽前的準(zhǔn)備、移栽和移栽后的養(yǎng)護(hù)管理等環(huán)節(jié)。經(jīng)過煉苗可以使葉表面的顏色由翠綠變?yōu)樯罹G，有光澤[28]。試管苗從試管內(nèi)移到試管外，由異養(yǎng)轉(zhuǎn)為自養(yǎng)，由原來的恒溫、高溫、弱光變?yōu)樽匀蛔儨?、低溫、強光，環(huán)境條件由無菌變?yōu)橛芯?，變化是很劇烈的。因此，在移栽?周左右的時間，將根系生長良好的三角瓶封口膜打開，進(jìn)行3～5d煉苗(見圖8)，使小苗逐漸適應(yīng)外界的環(huán)境。然后將已經(jīng)生根的無菌苗移栽至盛有草炭土＋細(xì)沙(體積比1∶1)和草炭土＋珍珠巖(1∶1)2種基質(zhì)的混合物[29]的容器中。剛開始幾天要用保鮮膜保水和遮蔭，以防止外界強烈的光照和水分的散失。觀察移栽苗生長情況，然后逐漸揭去薄膜，5d后，觀察移栽效果，生長正常，長勢良好(見圖8)。

圖7 無菌苗的生根培養(yǎng)Fig.7 Rooting culture of aseptic seedlings

圖8 試管苗煉苗與移栽Fig.8 Hardening and transplanting of a test-tube seedling

3 討 論

培養(yǎng)基是外植體賴以生存的營養(yǎng)物質(zhì)源泉，是決定外植體生長發(fā)育方向的基礎(chǔ)，而培養(yǎng)基中所加入的外源激素則是最敏感的因素[30]。不同物種對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求有所不同，在白蠟樹的腋芽離體培養(yǎng)試驗中，添加了適量細(xì)胞分裂素6-BA的WPM培養(yǎng)基就可以獲得增生的腋芽[31]；而水曲柳腋芽增殖的離體培養(yǎng)在MS培養(yǎng)基中是不適合的，這是由于MS培養(yǎng)基具有較高的無機鹽含量，導(dǎo)致效果不佳[32]。而刺楸的腋芽離體繁殖也只有在1/2MS培養(yǎng)基中才能獲得。在選擇外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)過程中，最重要的是控制外植體的污染，若想達(dá)到離體快繁的目的，最佳的外植體就是帶腋芽或頂芽的莖段，而滅菌時間及試劑的選擇影響了試驗效果，在桃的腋芽離體繁殖試驗中選用0.1％HgCI2滅菌3min效果最好[33]；因此，滅菌時間對腋芽離體培養(yǎng)有較大的影響，滅菌時間長可能會導(dǎo)致材料本身褐化，時間短滅菌效果不好，導(dǎo)致大面積污染。對于刺楸幼嫩莖段而言，選擇0.1％ HgCI2滅菌8min效果最好。

在植物愈傷組織培養(yǎng)中，外源激素起著傳遞遺傳物質(zhì)的脫分化、再分化等發(fā)育信號的作用，而外源激素的效果與外植體以及愈傷組織本身內(nèi)源激素的種類和水平有密切關(guān)系[34-36]。在水曲柳腋芽離體繁殖中，選用了6-BA 8mg/L配合生長素2iP進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，促進(jìn)了腋芽原基的形成，產(chǎn)生了較高的繁殖系數(shù)[31]；李琰等在對雷公藤的離體培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，隨著NAA質(zhì)量濃度的增加愈傷組織的增長量也有所增加[33]。在本研究中選擇了2種培養(yǎng)基C2D、1/2MS及3種外植體進(jìn)行了離體培養(yǎng)，在2種培養(yǎng)基中分別附加了6-BA(1.0～2.0mg/L)、NAA(0.05～0.20mg/L)，同時附加了碳源及固化劑，在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)在1/2MS培養(yǎng)基中，隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，腋芽的萌發(fā)率有上升趨勢，表明6-BA對芽的萌發(fā)有促進(jìn)作用。而當(dāng)NAA質(zhì)量濃度明顯提高時，腋芽的萌發(fā)率有所降低，表明NAA質(zhì)量濃度過高可以抑制腋芽的萌發(fā)。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度達(dá)到2.0mg/L，NAA為0.1mg/L時，刺楸的腋芽萌發(fā)率可以達(dá)到最高(85％)，而且萌發(fā)芽的長勢好，腋芽綠色，生長健壯。在選擇成熟胚進(jìn)行離體培養(yǎng)時，由于刺楸屬于胚乳性種子，在培養(yǎng)過程中受消毒時長等因素的影響，導(dǎo)致成熟胚全部污染；在休眠芽的離體培養(yǎng)過程時，隨著培養(yǎng)時間的延長，逐漸出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，最后導(dǎo)致死亡。因此本試驗中篩選出刺楸離體快繁最適的外植體為幼嫩的腋芽莖段，最適培養(yǎng)基和激素組合為1/2MS＋2.0mg/L 6-BA＋0.1mg/L NAA。

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