煙葉唇柱苣苔的高溫半致死溫度及其對高溫脅迫的生理響應

趙 偉 ，鄧 敏 ，戴錫玲 ，李謙盛

(1.上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院，上海 200234；2.上海辰山植物園 中國科學院上海辰山植物科學研究中心，上海 201602；3上海應用技術學院 生態(tài)技術與工程學院，上海 201418)

煙葉唇柱苣苔Chirita heterotrichaMerr.為苦苣苔科Gesneriaceae唇柱苣苔屬Chirita的一種多年生草本植物，為我國海南省特有種，分布于瓊中、瓊海、保亭、三亞、白沙、東方等地，生于海拔400～600m的山谷林中或溪邊石上[1]。煙葉唇柱苣苔株高葉大，花色多樣(有藍紫色和白色)而艷麗，具有較高的觀賞價值[2-3]；同時全株可入藥，具有補腎虛、止血、止咳、除濕等功效[4]。人類活動的干擾及森林資源的破壞導致了苦苣苔科植物生境的破壞；同時因為該植物資源存在藥用價值，故存在掠奪性挖掘，這又使得其種群數(shù)量減少、分布區(qū)域變窄[5]，因此，開展引種和人工繁殖栽培可有效保護和利用這一珍貴的植物資源。

目前，對苦苣苔科植物的研究主要集中于分類、系統(tǒng)進化、花粉形態(tài)和發(fā)育和活性成分分析等方面[6-7]，而對其繁育和生理、引種和栽培等方面的研究報道卻有限。近年來，苦苣苔科植物已成為新興的觀賞植物資源，其觀賞價值逐漸為人們所認識，有關其人工繁殖栽培等方面的研究工作也日益被人們關注。唇柱苣苔屬主要通過組織培養(yǎng)和扦插進行無性繁殖，已有包括唇柱苣苔屬在內的多種苦苣苔科植物的組織培養(yǎng)快速繁殖技術研究獲得了成功，這為苦苣苔科植物的繁育和可持續(xù)利用奠定了技術基礎[8]；也有多種關于利用唇柱苣苔屬植物葉片進行扦插繁殖的研究報道[9-10]；而利用種子繁殖的研究僅見于線葉唇柱苣苔C.linearifoliaW.T.Wang[11]。但是，有關唇柱苣苔屬植物生理學方面的研究報道卻很少，僅有菱葉唇柱苣苔C.subrhomboideaW.T.Wang[12]和桂林唇柱苣苔C.gueilinensisW.T.Wang的光合特性[13]和牛耳朵C.eburneaHance的低溫脅迫生理響應[14]的研究報道。目前，已有對煙葉唇柱苣苔的組培快繁技術[15]、藥用價值[16]和花的發(fā)育機理[17-18]等方面的研究報道，卻未見有對其栽培生理方面的研究報道。多數(shù)苦苣苔科植物喜生于巖壁中性和酸性土壤，在栽培中需要選擇60％～70％遮陰的溫暖濕潤環(huán)境，最適于其生長的溫度條件一般為夜間16～18℃、白天27～30℃[19]。為了探明煙葉唇柱苣苔的高溫半致死溫度和高溫脅迫對其生理代謝的影響情況，本文利用組培繁殖得到的煙葉唇柱苣苔幼苗為材料，測定離體條件下煙葉唇柱苣苔葉片組織在系列高溫脅迫處理下電解質滲出率的變化曲線，利用Logistic方程擬合并計算出煙葉唇柱苣苔的高溫半致死溫度(LT50)，并以LT50作為脅迫溫度處理煙葉唇柱苣苔植株，然后分析了葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性以及脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)含量等生理指標的變化趨勢，旨在為煙葉唇柱苣苔的園藝栽培提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

將野外采集于海南昌江(19°06′44″N、109°10′48″E，海拔 876m，樣本編號為DM2209)的煙葉唇柱苣苔活體植株引種栽培于上海辰山植物園的溫室內，引種成活后取其葉片作為外植體進行組織培養(yǎng)，當組培苗長至3cm高時，將其移栽至長與寬均為7cm、高為8cm的方形塑料花盆中，在加蓋保濕的育苗盒內馴化成活后，置于上海辰山植物園科研中心的溫室中栽培5個月后選取長勢大小基本一致的植株進行試驗。

1.2 高溫半致死溫度的測定方法

選取長勢良好的植株，選取從其基部數(shù)起的第3片完全展開的成熟葉片，用去離子水洗凈，并用吸水紙吸干其表面的水滴，然后用直徑為6mm的打孔器避開葉脈取葉圓片，隨機取4個葉圓片放入盛有10mL去離子水(電導率＜0.1 μS/cm)的試管中，于真空干燥器中用真空泵抽氣8min，使葉圓片沉入水中，并使其分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70℃的恒溫水浴鍋中保持20min，取出靜置冷卻2h；用電導率儀測定電導率(REC1)后再全部放入100℃沸水浴中15min，殺死植物組織，取出冷卻后在室溫下測定電導率(REC2)[20]，重復3次。電解質滲出率的計算公式如下：

電解質滲出率＝REC1/REC2×100％。

使用統(tǒng)計軟件SPSS19.0擬合logistic方程：

式中：y表示電解質滲出率(％)，x表示處理溫度，e為自然對數(shù)函數(shù)的底數(shù)，r為相對電導率飽和值，為100％，故取固定值100；a、b均為方程參數(shù)。

拐點即半致死溫度LT50＝ (lna)/b[21-22]。

1.3 高溫脅迫處理

將植株澆水充分后放進光合有效輻射為40μmol·m-2s-1、溫度為25℃、濕度為70％、光照時間為16h的人工氣候箱內進行適應性培養(yǎng)，培養(yǎng)7d后，將溫度調為按上述方法測定的高溫半致死溫度LT50，其余條件不變，每隔8h澆水1次，分別處理0、8、16、24、32、40、48、60h后，選取自基部數(shù)起的第3和第4片葉子進行各項生理指標的測定，每個處理重復5次。

1.4 生理指標的測定方法

采用抑制氮藍四唑(NBT)光化還原法[23]測定超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用愈創(chuàng)木酚法[24]測定過氧化物酶(POD)活性；采用硫代巴比妥酸法[25]測定丙二醛(MDA)含量；采用酸性茚三酮比色法[26]測定游離脯氨酸(Pro)含量。

2 結果和分析

2.1 煙葉唇柱苣苔的高溫半致死溫度

不同溫度處理下煙葉唇柱苣苔的電解質滲出率如圖1。由圖1可知，電解質滲出率隨著溫度的升高逐漸增加，于60℃下處理后其增幅趨于平緩。曲線擬合得到的logistic方程為：

y＝100/(1＋17.967e-0.068x)，擬合度R2＝0.962，高溫半致死溫度LT50＝42.3℃。

圖1 不同溫度處理下煙葉唇柱苣苔的電解質滲出率Fig.1 Electrolyte leakage rates in C.heterotricha under different temperatures

2.2 不同LT50處理時間對煙葉唇柱苣苔葉片SOD活性的影響

不同LT50處理時間后煙葉唇柱苣苔SOD活性的變化曲線如圖2所示。在LT50溫度下，SOD活性呈先上升后下降的變化趨勢，在以LT50溫度處理0～8h后快速上升，而處理8～16h又趨于平緩，SOD活性達到最大，處理16h后SOD活性卻明顯快速下降。

2.3 不同LT50處理時間對煙葉唇柱苣苔葉片POD活性的影響

不同LT50處理時間后煙葉唇柱苣苔POD活性的變化曲線如圖3所示。在LT50脅迫下，POD活性在以LT50溫度處理0～24h時快速上升，處理24h時達到最大值，而后又急劇下降，且在處理48h后降到低于處理前的水平。

2.4 不同LT50處理時間對煙葉唇柱苣苔葉片MDA含量的影響

不同LT50處理時間后煙葉唇柱苣苔MDA含量的變化曲線如圖4所示。在LT50脅迫下，隨著處理時間的延長，MDA含量呈持續(xù)上升的變化趨勢，在以LT50溫度處理0～8h時其平緩上升，處理8～24h時卻急劇上升，而在處理24～48h后又平緩上升，處理48h后又加速升高。處理60h時MDA含量分別是處理0 與48h時MDA含量的2.3和1.39倍。

圖2 不同LT50處理時間后煙葉唇柱苣苔SOD活性的變化曲線Fig.2 Change of SOD activity in C.heterotricha for different durations at LT50

圖3 不同LT50處理時間后煙葉唇柱苣苔POD活性的變化曲線Fig.3 Change of POD activity in C.heterotricha for different durations at LT50

2.5 不同LT50處理時間對煙葉唇柱苣苔葉片Pro含量的影響

不同LT50處理時間后煙葉唇柱苣苔脯氨酸含量的變化曲線如圖5所示。在LT50脅迫下，Pro含量也隨處理時間的延長而呈持續(xù)上升的變化趨勢，在以LT50溫度處理0～24h時其呈近似線性的增加趨勢。在處理24～40h時Pro的增幅相對平緩，處理40h時Pro含量是處理前的18.5倍，處理48h時的含量是處理前的33.5倍。處理60h時，Pro含量達到最大值，是處理前的36.3倍。

圖4 不同LT50處理時間后煙葉唇柱苣苔MDA含量的變化曲線Fig.4 Change of MDA content in C.heterotricha for different durations at LT50

圖5 不同LT50處理時間后煙葉唇柱苣苔脯氨酸含量的變化曲線Fig.5 Change of proline content in C.heterotricha for different durations at LT50

3 討 論

溫度對于植物的形態(tài)、分布、代謝以及生長發(fā)育起著重要作用。在高溫脅迫下，一般先直接誘發(fā)植物脫水，在細胞逐漸失水萎縮過程中，膜透性增大，電解質外滲，細胞受到傷害[27]。利用系列溫度梯度下植物組織電解質的滲出率求得的半致死溫度(LT50)是評價植物耐性較為靈敏和準確的指標[28-29]。本試驗用電解質滲出率配合logistic方程測得煙葉唇柱苣苔的半致死溫度LT50為42.3℃。電解質滲出率隨著溫度的升高而增大，其變化曲線近似S型，logistic方程擬合度高。以42℃的高溫處理煙葉唇柱苣苔8h，其葉片便失水下垂，處理16h葉片繼續(xù)下垂，至處理40h葉片便已經(jīng)灼傷而有局部變干，處理48和60h后葉柄下垂，植株萎蔫。

SOD酶是存在于植物體內的一種重要的保護酶，它能清除體內的氧自由基，從而保護質膜不受超氧陰離子自由基的破壞。SOD是一種典型的誘導酶，植物在遭到逆境脅迫時，會啟動自我保護機制，先通過增加SOD活性來清除超氧陰離子自由基，提高對高溫的耐受性，減少對自身的傷害[30]。植物遭受逆境脅迫的主要特征是活性氧代謝的失調，最主要的傷害是對內酶的破壞，造成細胞的正常代謝受阻，導致生長發(fā)育中止或死亡[31]。研究中發(fā)現(xiàn)，高溫LT50脅迫下SOD活性隨著脅迫時間的延長先升高，在脅迫24h時達到最大值，然后再下降。該變化趨勢與低溫脅迫下唇柱苣苔屬牛耳朵以及菲油果屬的菲油果的SOD活性的變化趨勢一致[14,32]。在短時間內，植物可通過提高酶活性來清除氧自由基以保護自身，但在長時間脅迫后，酶逐漸變性失活，同時生理代謝受到抑制，酶的產(chǎn)生量也減少。

POD酶是植物體在逆境下清除羥自由基的酶促防御系統(tǒng)中的重要酶之一。本研究結果表明，與SOD相似，隨著脅迫時間的延長，POD活性先升高后降低，在LT50脅迫24h時其活性達到最大，在此處理階段，POD活性隨脅迫時間的延長而增加，其清除羥自由基的能力較強，對細胞未造成明顯的傷害，能通過酶促系統(tǒng)減輕自身在逆境下的傷害。在LT50脅迫24h之后，POD活性快速下降，而羥自由基的積累增加，導致膜脂過氧化程度加深，對植物細胞造成損傷，影響植物的正常代謝[32-33]。

MDA是植物在逆境條件下或衰老時發(fā)生膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，通常用其表示植物膜脂過氧化程度和膜系統(tǒng)傷害程度[34]。本研究結果表明，MDA含量呈上升趨勢，與灰?guī)r皺葉報春在高溫45℃處理下MDA含量的變化趨勢相同[35]。在LT50脅迫0～8h時MDA緩慢積累，脅迫8～24h積累速率加快，而后又平緩積累，在脅迫48h后MDA急劇增加，說明植物隨著脅迫時間的延長其膜脂過氧化程度加重。

脯氨酸(Pro)作為一種重要的滲透調節(jié)物質，普遍存在于植物體內，當植物受到非生物因素的脅迫時，都會直接或間接地發(fā)生水分脅迫。為了適應逆境脅迫，植物通常會在短時間內通過迅速大量地合成和積累脯氨酸等滲透調節(jié)物質來增強其對滲透脅迫的抵抗能力。脯氨酸也是多種自由基的清除劑，還可激發(fā)植物體內POD、CAT、SOD等酶的活性[36]。本研究結果表明，Pro含量在高溫脅迫下接近線性積累，急劇升高，Pro對高溫脅迫的響應是迅速而敏感的，通過提高脯氨酸含量來進行滲透調節(jié)，保護細胞膜的穩(wěn)定性，提高對高溫脅迫的耐性[37]。在LT50脅迫下，隨著脅迫時間的延長，煙葉唇柱苣苔植株形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，在脅迫40h時葉片已經(jīng)嚴重失水，且有灼傷跡象，處理48和60h后其已萎蔫，說明脅迫對植物已造成了不可逆的傷害。

綜上所述，通過電導率法配合logistic方程可以簡便、準確地測定煙葉唇柱苣苔的高溫半致死溫度，再結合生理生化指標評價其高溫脅迫下的生理響應，可以有效評估其高溫適應性，從而為煙葉唇柱苣苔設施栽培的溫度調控提供了理論依據(jù)。

[1] 李振宇,王印政.中國苦苣苔科植物[M].鄭州:河南科學技術出版社,2005.

[2] 溫 放,張啟翔,王 越.廣西唇柱苣苔屬和小花苣苔屬植物的觀賞性狀評價與篩選[J].園藝學報,2008,35(2):239-250.

[3] 史佑海,徐世松,黃覺武.海南苦苣苔科野生植物資源及其觀賞特性評價[J].北方園藝,2011,(11):79 -82.

[4] 田建平,胡遠艷,張俊清,等.海南特有維管植物的藥用資源[J].海南醫(yī)學院學報,2008,14(2):122-125.

[5] 王玉兵,梁宏偉,陳發(fā)菊,等.廣西特有植物瑤山苣苔的瀕危原因及保護對策[J].生態(tài)環(huán)境,2008,17(5):1956-1960.

[6] 溫 放,李湛東.苦苣苔科(Gesneriaceae)植物研究進展[J].中國野生植物資源,2006,25(1):1-6.

[7] 鄭曉珂,李 軍,馮衛(wèi)生,等.苦苣苔科植物研究進展[J].中國新藥雜志,2003,12(4):261-263.

[8] 李 翠,凌征柱,姚紹嫦,等.苦苣苔科植物組織培養(yǎng)研究進展[J].安徽農業(yè)科學,2010,38(31):17387-17388,17390.

[9] 溫 放,張啟翔.5種唇柱苣苔屬植物葉插繁殖方式研究[J].北方園藝,2007,(12):103-105.

[10] 周太久,黃仕訓,鄧 濤,等.6種唇柱苣苔屬植物葉插繁殖試驗[J].南方農業(yè)學報,2012,43(3):356-359.

[11] 潘春柳,呂惠珍,彭玉德,等.外源激素處理對線葉唇柱苣苔種子萌發(fā)的影響[J].種子,2011,(1):24-27.

[12] 鄧 濤,莫 丹,周太久,等.菱葉唇柱苣苔光合特性日變化的初步研究[J].江蘇農業(yè)科學,2010,(4):195-197.

[13] 鄧 濤,周太久,盤 波,等.影響桂林唇柱苣苔光合速率日變化的因子分析[J].江蘇農業(yè)科學,2012,(6):154-156.

[14] 孫國勝,鄧 敏,李謙盛,等.牛耳朵幼苗對低溫脅迫的生理響應[J].南方農業(yè)學報,2013,43(6):918-923.

[15] Tang Z H,Shi L,Chen W,et al.In vitro propagation ofChirita heterotrichaMerr[J].Propagation of Ornamental Plants,2007,7(1):43-48.

[16] 李家美,常 穎,夏 至.唇柱苣苔屬5種藥用植物的考證[J].河南農業(yè)大學學報,2010,(1):103-105.

[17] Gao Q,Tao J H,Yan D,et al.Expression differentiation of CYC-like floral symmetry genes correlated with their protein sequence divergence inChirita heterotricha(Gesneriaceae)[J].Development genes and evolution,2008,218(7):341-351.

[18] Yang X,Cui H,Yuan Z L,et al.Significance of consensus CYC-binding sites found in the promoters of both ChCYC and ChRAD genes inChirita heterotricha(Gesneriaceae)[J].Journal of Systematics and Evolution,2010,48(4):249-256.

[19] 代正福,羅冠勇.中國熱帶特有野生苦苣苔科觀賞植物資源[J].貴州農業(yè)科學,2009,37(1):13-15.

[20] 趙亞洲,卓麗環(huán),張 琰.2種紅楓的高溫半致死溫度與耐熱性[J].上海農業(yè)學報,2006,22(2):51-53.

[21] 朱根海,劉祖棋,朱培仁.應用Logistic方程確定植物組織低溫半致死溫度的研究[J].南京農業(yè)大學學報,1986,(3):11-16.

[22] 董江水.應用SPSS軟件擬合Logistic曲線研究[J].金陵科技學院學報,2007,23(1):21-24.

[23] Beauchamp C,Fridovich I.Superoxide dismutase:improved assays and an assay applicable to acrylamide gels[J].Anal Biochem,1971,44 (1):276-287.

[24] Flurkey W H,Jen J J.Peroxidase and polyphenoloxidase activities in developing peaches [J].Journal of Food Science,1978,43:1826-1828,1831.

[25] Heath R L,Packer L.Photoperoxidation in isolated chloroplasts I Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation[J].Arch Biochem Biophys,1968,125:189-190.

[26] Chinard F P.Photometric estimation of proline and ornithine [J].J Biol Chem,1952,199:91-95.

[27] Hafeezur R,Saeed A M,Saleem M.Heat tolerance of upland cotton during the fruiting stage evaluated using cellular membrane thermostability [J].Field Crops Research,2004,85:149-158.

[28] He X Y,Ye H,Ma J L,et al.Semi-lethal high temperature and heat tolerance of eightCamelliaspecies[J].Phyton,2012,81:177-180.

[29] 馬錦林,張日清,葉 航,等.香花油茶的半致死溫度與耐寒耐熱性[J].經(jīng)濟林研究,2013,31(1):150-152,175.

[30] 李鐵華,張 偉,文仕知,等.貯藏溫度與時間對櫸樹種子活力以及抗氧化特性的影響[J].中南林業(yè)科技大學學報,2012,32(9):1-5.

[31] 唐 麗,張 瑜,袁德義.人工低溫脅迫條件下菲油果各項生理指標的變化[J].中南林業(yè)科技大學學報,2013,33(11):8-13.

[32] 陳培琴,郁松林,詹妍妮,等.植物在高溫脅迫下的生理研究進展[J].中國農學通報,2006,(5):223-227.

[33] 張桂蓮,陳立云,張順堂,等.高溫脅迫對水稻劍葉保護酶活性和膜透性的影響[J].作物學報,2006,32(9):1306-1310.

[34] 陳 貴,胡文玉,謝甫綈.提取植物體內 MDA 的溶劑及 MDA作為衰老指標的探討[J].植物生理學通訊,1991,27(1):44-46.

[35] 張 路,張啟翔.高溫脅迫對灰?guī)r皺葉報春生理指標的影響[J].西南農業(yè)學報,2011,24(5):1728-1732.

[36] 焦 蓉,劉好寶,劉貫山,等.論脯氨酸累積與植物抗?jié)B透脅迫[J].中國農學通報,2011,27(7):216-221.

[37] 廖飛雄,潘瑞熾.熱脅迫下菜心脯氨酸含量變化及其在耐熱中的作用[J].華南師范大學學報:自然科學版,2001,(2):45-49.