復(fù)合酸化劑體外模擬消化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

■王 彤 劉顯軍 陳 靜

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866）

對(duì)于幼齡動(dòng)物(如仔豬），由于自身消化系統(tǒng)發(fā)育不健全，導(dǎo)致胃液和各種消化酶分泌不足，需要依靠外界提供一定的酸化環(huán)境以利于改善腸道微生物區(qū)系、提高內(nèi)源酶活性，從而維持動(dòng)物健康生長(zhǎng)。雖然酸化劑具有無(wú)污染、無(wú)殘留，在體內(nèi)吸收迅速等特點(diǎn)，但各種酸化劑在動(dòng)物體內(nèi)的作用程度各異。研究最佳的酸化劑配合比例，從而達(dá)到最佳的酸化效果尤為重要。因此，如何科學(xué)做好酸化劑體外模擬消化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)復(fù)合酸化劑的應(yīng)用與發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的意義

動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)︼暳纤峄瘎I(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行評(píng)定，但這些方法往往耗時(shí)、費(fèi)力，很難在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量的飼料酸化劑樣品進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。主要有以下幾方面原因造成：一是試驗(yàn)動(dòng)物本身個(gè)體存在差異造成試驗(yàn)產(chǎn)生誤差，比如很難選擇相同品種、體重和遺傳性同時(shí)具備的試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分組試驗(yàn)；二是因不同的飼養(yǎng)方式、飼養(yǎng)員的投食喜好、圈舍條件采光、溫度、濕度等飼養(yǎng)管理因素產(chǎn)生試驗(yàn)結(jié)果差異；三是大量的試驗(yàn)往往不能在自然環(huán)境相同的條件下同期內(nèi)完成，造成不同時(shí)期試驗(yàn)結(jié)果存在差異；四是試驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體的原因，無(wú)法確定其是否由于疾病還是由于技術(shù)操作造成試驗(yàn)結(jié)果誤差。所以，用動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行酸化劑使用效果評(píng)價(jià)，會(huì)因生物學(xué)影響因素多、結(jié)果變異大、重復(fù)性差等因素而限制其的應(yīng)用性。隨著動(dòng)物消化生理研究的深入和技術(shù)手段的創(chuàng)新，利用動(dòng)物體外消化模擬技術(shù)來(lái)研究飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值已經(jīng)成為可能。因此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)本著可重復(fù)和試驗(yàn)條件一致性原則，嚴(yán)格控制各種干擾因素，做好復(fù)合酸化劑動(dòng)物體外模擬試驗(yàn)設(shè)計(jì)，最大可能控制好活體生物自身生長(zhǎng)等非試驗(yàn)因素的影響，科學(xué)統(tǒng)計(jì)、分析試驗(yàn)結(jié)果并做出結(jié)論，從而提高試驗(yàn)可靠度。如果試驗(yàn)設(shè)計(jì)不合理、考慮不周全、不可控影響因素過(guò)多，不僅不能得到預(yù)期結(jié)果，而且可能造成整個(gè)試驗(yàn)的失敗。因此，做好體外模擬試驗(yàn)設(shè)計(jì)是研究復(fù)合酸化劑體外模擬消化試驗(yàn)工作成功與否的關(guān)鍵。

2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本方法

體外模擬試驗(yàn)分為[1-5]單酶法（一步法）和多酶法，單酶法主要測(cè)定pH值及養(yǎng)分消化率法，其中測(cè)定pH值又包括了pH值變化幅度法和pH值恒定法；多酶法主要分為兩段法、三段法及其它（消化道食糜）。隨著對(duì)畜禽消化生理的深入研究，單胃動(dòng)物體外消化模擬技術(shù)也得到了發(fā)展，已由過(guò)去的單一酶法發(fā)展為現(xiàn)代的多酶法。多酶法不但對(duì)胃消化過(guò)程進(jìn)行模擬，而且還對(duì)胰腺分泌消化酶、小腸消化以及大腸微生物消化等過(guò)程進(jìn)行模擬，即由幾種消化酶同時(shí)完成畜禽體內(nèi)消化過(guò)程。相比之下，三段法明顯優(yōu)于二段法和一步法，其原因主要在于酶成分更復(fù)雜、測(cè)定結(jié)果更精確、測(cè)定成分及種類更多，它不但可以用來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的消化率，而且可以用來(lái)預(yù)測(cè)淀粉、脂肪、鈣、磷、粗灰分、粗纖維等消化率；使可評(píng)價(jià)的指標(biāo)范圍變寬，應(yīng)用更加廣泛；而且測(cè)定環(huán)境易于標(biāo)準(zhǔn)化，穩(wěn)定性高；實(shí)驗(yàn)室之間可比性強(qiáng)。不但可以測(cè)定某一時(shí)間點(diǎn)的降解率，還可以測(cè)定飼料動(dòng)態(tài)降解率。

Boisen等[7]利用胃蛋白酶-胰酶-碳水化合物酶法測(cè)定的90個(gè)飼料樣品和30種配合飼料的體外有機(jī)物質(zhì)消化率與豬體內(nèi)消化能之間存在線性相關(guān)(R2=0.94)。這兩種方法所獲得的干物質(zhì)和能量消化率結(jié)果表現(xiàn)出很強(qiáng)的一致性。這表明利用胃蛋白酶-胰酶-碳水化合物酶三步法能夠預(yù)測(cè)豬飼料的消化能。

3 體外模擬試驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.1 試驗(yàn)一

根據(jù)不同比例調(diào)配出不同類型的復(fù)合型酸化劑，測(cè)定加入不同復(fù)合型酸化劑之后日糧的pH值、系酸力、電解質(zhì)平衡、緩沖能力、緩釋能力，采用均勻設(shè)計(jì)方法，通過(guò)逐步回歸方程計(jì)算出復(fù)合型酸化劑的最佳配方。復(fù)合型酸化劑最優(yōu)配比試驗(yàn)技術(shù)路線見(jiàn)圖1。

3.2 試驗(yàn)二

通過(guò)打孔法測(cè)量復(fù)合型酸化劑的抑菌直徑，研究復(fù)合型酸化劑在體外對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌的抑制作用，測(cè)定抑菌圈直徑。采用二倍稀釋法測(cè)定復(fù)合型酸化劑的最小抑菌濃度。體外模擬消化試驗(yàn)測(cè)定消化后食糜內(nèi)的微生物菌群、消化酶活性、食糜上清液中揮發(fā)性脂肪酸的含量。測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率，包括干物質(zhì)消化率、能量消化率、粗蛋白消化率、Ca和P吸收率、氨基酸(AA)消化率。

圖1 復(fù)合型酸化劑最優(yōu)配比試驗(yàn)技術(shù)路線

3.3 試驗(yàn)三

根據(jù)求得的最佳配比配置復(fù)合型酸化劑，分別設(shè)定三個(gè)濃度梯度進(jìn)行體外模擬消化試驗(yàn)，每個(gè)濃度梯度三個(gè)重復(fù)。通過(guò)三段法（即胃蛋白酶-胰酶-碳水化合物酶法），體外模擬動(dòng)物消化，綜合測(cè)定日糧中添加復(fù)合型酸化劑后，食糜的微生物菌群、消化酶活性的影響、食糜上清液中揮發(fā)性脂肪酸的含量以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率，包括干物質(zhì)消化率、能量消化率、粗蛋白消化率、Ca和P吸收率、AA消化率，為生產(chǎn)實(shí)踐提供依據(jù)。

4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

不同酸的比例采用均勻設(shè)計(jì)的方法，研究出復(fù)合型酸化劑的最佳配方，在實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)對(duì)常見(jiàn)細(xì)菌的抑菌試驗(yàn)、飼料酸結(jié)合力和動(dòng)物體外模擬消化試驗(yàn)來(lái)證明這幾種酸化劑的抑菌效果和最佳配比及添加濃度，用來(lái)在生產(chǎn)中指導(dǎo)實(shí)踐。數(shù)據(jù)先用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)初步分析，SPSS 10.0中的One-Way ANOVA進(jìn)行方差分析和Duncan's法多重比較，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。體外模擬復(fù)合型酸化劑的抑菌試驗(yàn)及消化試驗(yàn)技術(shù)路線見(jiàn)圖2。

5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)注意的問(wèn)題

為保證體外模擬試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和精確性，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意以下事項(xiàng)。

①在實(shí)驗(yàn)室做抑菌試驗(yàn)時(shí)，全程需在無(wú)菌操作臺(tái)上工作，避免雜菌干擾抑菌效果，保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，因個(gè)人操作和儀器設(shè)備等因素，偶然性很大，需重復(fù)多做來(lái)避免誤差。

圖2 體外模擬復(fù)合型酸化劑的抑菌試驗(yàn)及消化試驗(yàn)技術(shù)路線

②體外消化模擬方法中的各項(xiàng)消化參數(shù)可能只是部分參數(shù)與體內(nèi)實(shí)際情況相吻合，如消化道pH值、溫度、消化酶種類與水平、消化時(shí)間等。而一些參數(shù)則相差較遠(yuǎn)，如胃腸道內(nèi)微生物群、黏膜脫落細(xì)胞、消化產(chǎn)物的相互作用、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝水平等。因此，需要多次進(jìn)行試驗(yàn)，將可控制因素標(biāo)準(zhǔn)化，不可控因素力求準(zhǔn)確，提高試驗(yàn)準(zhǔn)確度。

③體外模擬會(huì)因個(gè)人操作不同而有差異，極大程度上受溫度、反應(yīng)時(shí)間、酶濃度的影響，最佳解決方案就是大量重復(fù)試驗(yàn)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)方案中的不足，并加以改正。

④為避免可能存在的消化產(chǎn)物對(duì)酶促反應(yīng)的抑制作用，消化終產(chǎn)物應(yīng)盡快與未消化物質(zhì)分離，最大程度模擬畜禽消化。

⑤注意試驗(yàn)樣品重量和粒度、粉碎程度等物理因素對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響，試驗(yàn)飼料應(yīng)選用基礎(chǔ)日糧，避免其它飼料添加劑干擾試驗(yàn)結(jié)果，提高營(yíng)養(yǎng)成分消化率的準(zhǔn)確程度。