沼澤紅假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化研究

■ 劉德海 陳國參 解復(fù)紅 胡宜亮 周伏忠 馬 煥 龐向宇

（1.河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州 450008；2.河南省工業(yè)酶工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450008；3.河南省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450008）

沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）是光合細(xì)菌（Photosynthetic Bacteria,簡稱PSB）的代表菌株之一。在生物學(xué)分類中，按照東秀珠（2001）《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》分類[1]，屬于原核生物，真細(xì)菌中的光合細(xì)菌將不產(chǎn)氧光合細(xì)菌分為著色桿菌科（Chromatiaceae）、外硫紅螺菌科（Ectothiorhodospiraceae）、紫色非硫細(xì)菌（purple nonsulfur bacteria）、綠色硫細(xì)菌（green sulfur bacteria）、多細(xì)胞絲狀綠細(xì)菌（multicellular filamentous green bacteria）、螺旋桿菌科（Helicobacteraceae）含細(xì)菌葉綠素的專性好氧菌（bacteriochlorophylla-containing aerobic bacteria）等七大類群，沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)屬于紫色非硫細(xì)菌（purple nonsulfur bacteria）、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)中的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2045號公布的允許使用的飼料添加劑品種目錄中，飼料級微生物添加劑有34種，允許使用的飼料級微生物中，沼澤紅假單胞菌就在其內(nèi)。目前，沼澤紅假單胞菌作為養(yǎng)殖水質(zhì)凈化劑，早已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，可有效降低對蝦養(yǎng)殖廢水中的COD，并取得了顯著效果。沼澤紅假單胞菌其菌體含有較高含量的蛋白質(zhì)、維生素、類胡蘿卜素等營養(yǎng)物質(zhì)，可作為飼料添加劑用于經(jīng)濟(jì)動物的養(yǎng)殖；用于魚、蝦、貝的培育，作為動物性餌料的餌料，具有防病、治病作用等多方面的應(yīng)用價值[2-5]。

近年來，杜冰等（2007）對沼澤紅假單胞菌的生長條件進(jìn)行了研究[6]，發(fā)現(xiàn)pH值、溫度、接種量等因素影響沼澤紅假單胞菌的生長，并且它們之間又相互影響。夏冰冰等（2010）對沼澤紅假單胞菌發(fā)酵條件進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化研究[7]。全亞玲等（2012）對沼澤紅假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究[8]，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計分別對本實(shí)驗(yàn)室保藏的沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)的接種量、pH值、溫度、光照強(qiáng)度四種因素的不同水平進(jìn)行比較試驗(yàn)，確定其各自最佳試驗(yàn)水平；確定了最佳培養(yǎng)基組成配方。本試驗(yàn)旨在對實(shí)驗(yàn)室保藏的沼澤紅假單胞菌R1菌株的培養(yǎng)基配方以及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，簡化生產(chǎn)配方，降低生產(chǎn)成本，以期為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)沼澤紅假單胞菌R1菌劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

沼澤紅假單胞菌R1：由河南省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種保藏培養(yǎng)基(ATYP瓊脂)：K2HPO41.0 g、CaCl20.1 g、NaHCO33.0 g、CH3COONa 1.0 g、MgCl20.5 g、NH4Cl 1.0 g、NaCl 1.0 g、微量元素溶液1.0 ml、維生素溶液1.0 ml、琥珀酸鈉1.0 g、酵母抽提物0.5 g、蛋白胨0.5 g、瓊脂12 g、蒸餾水1 000 ml，pH值6.8。

其中，微量元素溶液：FeCl2·4H2O 1.8 g、CoCl2·6H2O 0.25 g、NiCl2·6H2O 0.01 g、CuCl2·2H2O 0.01 g、MnCl2·4H2O 0.70 g、ZnCl20.1 g、H3BO30.5 g、Na2MoO4·2H2O 0.03 g、Na2SeO3·5H2O 0.01 g、蒸餾水1 000 ml。

維生素溶液：生物素0.1 g、煙酸0.35 g、鹽酸硫胺素0.3 g、對氨基苯甲酸0.2 g、鹽酸吡多胺0.1 g、泛酸鈣0.1 g、維生素B120.05 g、蒸餾水1 000 ml。

基本培養(yǎng)基：K2HPO41.0 g、CaCl20.1 g、NaHCO33.0 g、CH3COONa 1.0 g、MgCl20.5 g、NH4Cl 1.0 g、Na-Cl 1.0 g、微量元素溶液1.0 ml、維生素溶液1.0 ml、琥珀酸鈉1.0 g、酵母抽提物0.5 g、蛋白胨0.5 g、蒸餾水1 000 ml，pH值6.8。

雙層平板計數(shù)培養(yǎng)基：NH4Cl 1.0 g、K2HPO40.2 g、CH3COONa 3.0 g、NaHCO31.0 g、酵母膏 0.2 g、NaCl 1.0 g、MgCl20.20 g、T.M.儲液1.5 ml、蒸餾水1 000 ml，pH值6.8。

其中T.M.儲液：FeCl35.0 mg、CuSO4·5H2O 0.05 mg、H3BO31.0 mg、MnCl2·5H2O 0.05 mg、ZnSO4·7H2O 1.0 mg、Co(NO3)2·6H2O 0.5 mg、蒸餾水1 000 ml。

雙層平板計數(shù)培養(yǎng)基中底層平板培養(yǎng)基添加0.8%瓊脂，上層平板培養(yǎng)基添加1.0%瓊脂。

1.1.3 主要試劑

蛋白胨、酵母膏購自于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；蔗糖、K2HPO4、NaHCO3、CH3COONa、（NH4）2SO4、NH4Cl、DL-蘋果酸、檸檬酸、丁二酸鈉、甘油、尿素等主要試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器

YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、T6新世紀(jì)紫外可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、PHSJ-3F酸度計（瑞士Mettler Toledo公司）、T8-1磁力攪拌器（金壇市華峰儀器有限公司）、SW-CT-ICU超凈工作臺（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）、YP2102電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）、LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、DRP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信試驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沼澤紅假單胞菌液體菌種的制備

無菌操作條件下提取沼澤紅假單胞菌R1菌種2～3環(huán)接入裝有200 ml液體培養(yǎng)基的250 ml具塞磨口三角瓶中，30℃、40 W白熾燈距離20 cm處照射靜置厭氧光照條件下培養(yǎng)14 d，用作沼澤紅假單胞菌液體種子備用。

1.2.2 沼澤紅假單胞菌R1培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計，分別對沼澤紅假單胞菌R1進(jìn)行所需碳源試驗(yàn)。選擇7種不同碳源（蔗糖、碳酸氫鈉、乙酸鈉、DL-蘋果酸、檸檬酸、丁二酸鈉、甘油）。所需氮源試驗(yàn)，選擇5種不同氮源（蛋白胨、酵母膏、氯化銨、尿素、硫酸銨），然后根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果，選擇適宜碳源、適宜氮源、磷酸氫二鉀為磷源、微量元素溶液、維生素溶液培養(yǎng)基成分作為5種因素，每個因素設(shè)計4個水平，設(shè)計正交試驗(yàn)L16（45）。每250 ml具塞磨口三角瓶中裝有200 ml液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入10.0 ml液體菌種，30℃、40 W白熾燈距離20 cm處照射厭氧光照條件下靜置培養(yǎng)72 h，分析優(yōu)化出沼澤紅假單胞菌R1較佳的培養(yǎng)基配方。

1.2.3 沼澤紅假單胞菌R1培養(yǎng)條件試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計，分別對沼澤紅假單胞菌R1優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行接種量試驗(yàn)，按照體積比分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基（2%、4%、6%、8%、10%）的液體種子；pH值試驗(yàn)，分別調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；裝液量試驗(yàn)，250 ml具塞磨口三角瓶中分別裝入液體培養(yǎng)基50、100、150、200 ml，滅菌冷卻后接入體積比5%液體菌種；培養(yǎng)溫度試驗(yàn)（25、30、35、40 ℃）；光照試驗(yàn)，分別選擇不同白熾燈（25、40、60、100 W）距離20 cm處照射培養(yǎng)。接種量試驗(yàn)、pH值試驗(yàn)、培養(yǎng)溫度試驗(yàn)、裝液量試驗(yàn)、光照試驗(yàn)，每250 ml具塞磨口三角瓶中裝有200 ml液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入體積比5%，即10.0 ml液體菌種，白熾燈距離20 cm處厭氧光照條件下靜置培養(yǎng)72 h，分析出沼澤紅假單胞菌R1較佳的培養(yǎng)條件。

1.2.4 生長量的測定

發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)充分振蕩搖勻后，采用T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計，以培養(yǎng)初期剛接入菌種的液體培養(yǎng)基為空白對照，于660 nm處測定發(fā)酵培養(yǎng)液OD660值。

沼澤紅假單胞菌R1菌數(shù)含量的測定采用孫軍德等（2001）光合細(xì)菌雙層平板計數(shù)方法進(jìn)行[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 沼澤紅假單胞菌R1發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

2.1.1 不同碳源試驗(yàn)

ATYP瓊脂培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，氯化銨為供試氮源，磷酸氫二鉀為磷源，加入1.0 g/l氯化銨、1.0 g/l磷酸氫二鉀、1.0 ml/l微量元素溶液、1.0 ml/l維生素溶液，再分別加入1.0 g/l的蔗糖、碳酸氫鈉、乙酸鈉、DL-蘋果酸、檸檬酸、丁二酸鈉、甘油制作培養(yǎng)基，接種沼澤紅假單胞菌R1培養(yǎng)7 d后，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1可知，沼澤紅假單胞菌R1較適宜的碳源為甘油。

2.1.2 不同氮源試驗(yàn)

以甘油為碳源，磷酸氫二鉀為磷源，加入1.0 ml/l微量元素溶液，1.0 ml/l維生素溶液，再分別加入蛋白胨、酵母膏、氯化銨、尿素、硫酸銨為唯一氮源配制培養(yǎng)基,接種沼澤紅假單胞菌R1培養(yǎng)7 d后，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可知，沼澤紅假單胞菌R1較適宜的氮源為酵母膏，其次為蛋白胨，但考慮到酵母膏、蛋白胨使生產(chǎn)成本高，營養(yǎng)豐富易造成染菌等因素，因此本試驗(yàn)選擇氯化銨為氮源。

圖1 不同碳源對沼澤紅假單胞菌R1生長的影響

圖2 不同氮源對沼澤紅假單胞菌R1生長的影響

2.1.3 沼澤紅假單胞菌R1培養(yǎng)基的優(yōu)化

以甘油為碳源，氯化銨為氮源，磷酸氫二鉀為磷源，添加微量元素溶液、維生素溶液，設(shè)計正交試驗(yàn)L16（45），試驗(yàn)設(shè)計見表1，其培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，對沼澤紅假單胞菌R1的生長的影響因素為C＞B＞D＞A＞E，因素C磷源磷酸氫二鉀為主要影響因素，其它依次為因素B氮源氯化銨、因素D復(fù)合微量元素、因素A碳源甘油、因素E復(fù)合維生素。其適宜的培養(yǎng)基配方為A2B2C3D1E3，即甘油1.0 g、氯化銨1.0 g、磷酸氫二鉀0.3 g、微量元素溶液0.05 ml、維生素溶液0.15 ml、蒸餾水1 000 ml。

2.2 沼澤紅假單胞菌R1培養(yǎng)條件的優(yōu)化

表1 L16（45）正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計

表2 沼澤紅假單胞菌R1正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 接種量對沼澤紅假單胞菌R1生長的影響

沼澤紅假單胞菌R1分別按照體積比的2%、4%、6%、8%、10%接入液體菌種于優(yōu)化后的培養(yǎng)基200 ml中，于30℃、40 W白熾燈距離20 cm處下靜置培養(yǎng)72 h，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著接種量的增加，沼澤紅假單胞菌R1菌數(shù)OD660值不斷增加，當(dāng)接種量為6%時達(dá)到最大值，再加大接種量則OD660值呈現(xiàn)逐步下降趨勢，分析原因可能為隨著接入沼澤紅假單胞菌菌數(shù)的增加造成培養(yǎng)基營養(yǎng)的匱乏造成的，其適宜的接種量為6%（V/V）。

圖3 不同接種量對沼澤紅假單胞菌R1生長的影響

2.2.2 初始pH值對沼澤紅假單胞菌R1生長的影響

分別調(diào)整優(yōu)化后的培養(yǎng)基初始pH值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，滅菌冷卻后，接入6%的沼澤紅假單胞菌R1液體菌種，于30℃、40 W白熾燈距離20 cm處照射靜置培養(yǎng)72 h，結(jié)果見圖4。由圖4可知，沼澤紅假單胞菌R1較適宜的pH值范圍為6.0～8.0，pH值7.0時達(dá)到最大值，偏酸、偏堿均不利于其生長。

圖4 不同pH值對沼澤紅假單胞菌R1生長的影響

2.2.3 溫度對沼澤紅假單胞菌R1生長的影響

將優(yōu)化后的培養(yǎng)基初始pH值調(diào)整為7.0，滅菌冷卻后，接入6%的沼澤紅假單胞菌R1液體菌種，分別置于培養(yǎng)溫度25、30、35、40℃，40 W白熾燈距離20 cm處靜置培養(yǎng)72 h，結(jié)果見圖5。由圖5可知，沼澤紅假單胞菌R1在設(shè)置的溫度下均能生長，較適宜的培養(yǎng)溫度為30～35℃，30℃時達(dá)到最大值，40℃時菌數(shù)OD660值下降較多。

2.2.4 光照強(qiáng)度對沼澤紅假單胞菌R1生長的影響

將優(yōu)化后的培養(yǎng)基初始調(diào)整為pH值7.0，滅菌冷卻后，接入6%的沼澤紅假單胞菌R1液體菌種，30℃，分別置于25、40、60、100 W白熾燈下距離20 cm處照射靜置培養(yǎng)72 h，結(jié)果見圖6。由圖6可知，較適宜的為40 W白熾燈下照射，隨著白熾燈功率W的增大，菌數(shù)OD660值明顯下降，分析原因可能為沼澤紅假單胞菌R1不需要較強(qiáng)的光照強(qiáng)度。

圖5 不同溫度對沼澤紅假單胞菌R1生長的影響

圖6 不同光照強(qiáng)度對沼澤紅假單胞菌R1生長的影響

2.2.5 裝液量對沼澤紅假單胞菌R1生長的影響

初始pH值7.0，具塞磨口250 ml三角瓶中分別裝入優(yōu)化后液體培養(yǎng)基50、100、150、200 ml，滅菌冷卻后，接入6%的沼澤紅假單胞菌R1液體菌種，30℃、置于40 W白熾燈下距離20 cm處照射靜置培養(yǎng)72 h，結(jié)果見圖7。由圖7可知，250 ml三角瓶中裝入50 ml液體培養(yǎng)基中測定的菌數(shù)OD660值最大，隨著裝液量的增加，菌數(shù)OD660值呈下降趨勢。分析原因可能為在少量氧氣存在的情況下，沼澤紅假單胞菌R1生長更好一些，少量氧氣可以促進(jìn)沼澤紅假單胞菌R1的生長。

圖7 不同裝液量對沼澤紅假單胞菌R1生長的影響

2.2.6 最佳培養(yǎng)條件的確定

優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基調(diào)整初始pH值7.0，250 ml三角瓶中裝入50 ml培養(yǎng)基，接種量為6%（V/V），30℃、置于40 W白熾燈下距離20 cm處照射靜置培養(yǎng)7 d，沼澤紅假單胞菌R1菌數(shù)OD660值可達(dá)2.066，經(jīng)雙層平板計數(shù)法檢測沼澤紅假單胞菌R1菌數(shù)可達(dá)5.6×108個/ml。

3 結(jié)論

①根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際需要，經(jīng)優(yōu)化后沼澤紅假單胞菌R1其適宜的培養(yǎng)基配方為：甘油1.0 g、氯化銨1.0 g、磷酸氫二鉀0.3 g、微量元素溶液0.05 ml、維生素溶液0.15 ml、蒸餾水1 000 ml。

②經(jīng)優(yōu)化后沼澤紅假單胞菌R1其適宜的培養(yǎng)條件為：初始pH值7.0、培養(yǎng)溫度30℃、接種量為6%、裝液量為液體培養(yǎng)基50 ml/250 ml三角瓶、40 W白熾燈下距離20 cm處照射靜置培養(yǎng)。

③采取以上適宜的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，沼澤紅假單胞菌R1菌數(shù)OD660值可達(dá)2.066，經(jīng)雙層平板計數(shù)法檢測沼澤紅假單胞菌R1菌數(shù)可達(dá)5.6×108個/ml。