精子發(fā)生和運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白的研究新進(jìn)展

汪智瓊李紅飛張 玲劉晙玭平光倫張志兵,.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院（武漢 430065）; 2. Departments of Obstetrics and Gynecology and Biochemistry, Virginia Commonwealth University, Richmond, VA 23298

·綜 述·

精子發(fā)生和運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白的研究新進(jìn)展

汪智瓊1李紅飛1張 玲1劉晙玭1平光倫1張志兵1,2*1.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院（武漢 430065）; 2. Departments of Obstetrics and Gynecology and Biochemistry, Virginia Commonwealth University, Richmond, VA 23298

近年來(lái)男性不育癥的發(fā)病率有不斷上升趨勢(shì)，在男性不育的各種原因中，精子發(fā)生障礙是一個(gè)重要因素，其中遺傳因素缺陷導(dǎo)致的精子發(fā)生障礙是一個(gè)重要機(jī)制[1]。男性精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞分化過(guò)程，受到諸多有序表達(dá)基因的調(diào)控，其中任何一個(gè)基因發(fā)生缺失、突變或表達(dá)異常都可能引起精子生成障礙，導(dǎo)致男性不育[2]。近年來(lái)隨著小鼠基因敲除技術(shù)的廣泛運(yùn)用，越來(lái)越多調(diào)節(jié)精子發(fā)生的基因被發(fā)現(xiàn)[3]，據(jù)報(bào)道目前有超過(guò)2300個(gè)基因參與[4]。其中有些蛋白在精子發(fā)生中發(fā)揮重要的功能，如調(diào)控哺乳動(dòng)物精子發(fā)生、精子運(yùn)動(dòng)、精子獲能、頂體反應(yīng)和精卵融合等生物過(guò)程，另外有些精子抗原可能與受精和胚胎的早期發(fā)育有密切關(guān)系 。本文基于目前國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道，綜合論述了幾種重要的蛋白調(diào)節(jié)精子鞭毛運(yùn)動(dòng)的機(jī)制。

一、精子相關(guān)抗原6（Sperm- associated antigen 6，SPAG6）

SPAG6基因表達(dá)蛋白是精子鞭毛支架蛋白的一種，對(duì)維持精子鞭毛結(jié)構(gòu)完整和精子鞭毛活動(dòng)有重要作用。SPAG6最初是用不育男性患者的高滴度抗體血清篩選睪丸基因表達(dá)文庫(kù)而克隆出來(lái)的，SPAG6基因缺失或沉默時(shí),動(dòng)物表現(xiàn)為精子活力損傷、精子畸形和雄性不育[5]。目前對(duì)人類(lèi)和鼠類(lèi)的SPAG6基因的研究發(fā)現(xiàn)，該基因均在睪丸中高度表達(dá)，編碼1.8kb和2.8kb mRNA[6]。此外，具有運(yùn)動(dòng)纖毛的組織，如肺、腦室膜中SPAG6也有少量表達(dá)，另有報(bào)道北京油雞SPAG6基因位于2號(hào)染色體上，共有l(wèi)0個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，基因全長(zhǎng)為32.6 kb,該基因突變影響其精液品質(zhì)和性發(fā)育相關(guān)性狀[7]。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)在激光共聚焦掃描顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，該蛋白在真核細(xì)胞中定位于微管。在運(yùn)動(dòng)纖毛內(nèi)，SPAG6定位于調(diào)節(jié)纖毛運(yùn)動(dòng)的中心軸突上，并且決定其他蛋白（如SPAG16，SPAG17）在中心軸突的定位[8,9]。哺乳動(dòng)物SPAG6的功能非常保守，在低等生物，如雙鞭毛藻類(lèi)中是衣藻PF16（paralysed flagella 16）的同源體，該同源蛋白PF16也位于鞭毛中央軸突的中心管內(nèi)參與調(diào)節(jié)鞭毛的運(yùn)動(dòng)[10]。目前，SPAG6基因敲除小鼠模型已經(jīng)建立，SPAG6缺失小鼠由于運(yùn)動(dòng)纖毛功能障礙而表現(xiàn)出雄性不育。有研究顯示，SPAG6該蛋白在微管及中心體（一種微管組織中心）中表達(dá)，近一半SPAG6缺失小鼠生長(zhǎng)較正常小鼠顯著減慢，提示SPAG6可能和細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)。最近研究表明SPAG6作為新型癌胚抗原，在肺癌等腫瘤組織中表達(dá)顯著增加，表明該基因跟腫瘤形成有關(guān)[11]。因此，SPAG6的功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了維持精子鞭毛結(jié)構(gòu)完整和精子鞭毛活動(dòng)的功能。

二、精子相關(guān)抗原16（Sperm-associated antigen 16，SPAG16）

哺乳動(dòng)物SPAG16是衣藻PF20（paralysed flagella 20）的同源體[12]，對(duì)維持和執(zhí)行“9+2”結(jié)構(gòu)有重要的作用。“9+2”軸絲是在運(yùn)動(dòng)纖毛和鞭毛內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，是由9個(gè)雙峰微管通過(guò)能夠產(chǎn)生協(xié)同力的肌動(dòng)復(fù)合物-肌動(dòng)蛋白臂的機(jī)動(dòng)作用連接到一對(duì)中央微管，是一種細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)[13]。衣藻PF20基因只翻譯一個(gè)蛋白，該蛋白位于衣藻鞭毛中央軸突的中心管內(nèi)以調(diào)節(jié)鞭毛運(yùn)動(dòng)，當(dāng)PF20的表達(dá)缺失時(shí)，鞭毛運(yùn)動(dòng)力喪失。同衣藻PF20不同，小鼠SPAG16基因翻譯兩個(gè)蛋白， 全長(zhǎng)71 kDa 的SPAG16L及35 kDa 的SPAG16S[14]。SPAG16L蛋白被發(fā)現(xiàn)存在于所有鼠類(lèi)的運(yùn)動(dòng)纖毛和鞭毛中，定位于運(yùn)動(dòng)纖毛中心管，同衣藻PF20一樣調(diào)節(jié)鞭毛運(yùn)動(dòng)[15]。SPAG16S同SPAG16L的C 端序列完全相同，表現(xiàn)為SPAG16L的C 端蛋白，該蛋白僅在雄性精子細(xì)胞中表達(dá)，顯著性表達(dá)于核的特殊區(qū)域，有7個(gè)WD重復(fù)序列以介導(dǎo)蛋白相互作用。與SPAG16L不同，SPAG16S除在生精細(xì)胞胞漿中表達(dá)外，還在細(xì)胞核中表達(dá)，該蛋白參與調(diào)節(jié)精子發(fā)生[16]。在純合子小鼠中敲除SPAG16L基因，僅僅表現(xiàn)為雄性不育，但精子發(fā)生過(guò)程無(wú)異常表現(xiàn)。但如果同時(shí)敲除SPAG16L和SPAG16S的表達(dá)，可見(jiàn)在精子發(fā)生過(guò)程中出現(xiàn)了嚴(yán)重的缺失。將SPAG16S轉(zhuǎn)染到鼠精子細(xì)胞和BEAS-2B（人類(lèi)支氣管分泌壁細(xì)胞）中，可增加SPAG16L的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)SPAG16S在精子細(xì)胞的基因表達(dá)系統(tǒng)中起了非常重要的作用。

為了進(jìn)一步檢測(cè)SPAG16L的功能，有學(xué)者建立SPAG16L缺失的基因敲除小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠仍可表達(dá)SPAG16S，基因突變的動(dòng)物發(fā)育正常，未出現(xiàn)纖毛缺失相關(guān)癥狀如腦水腫，腦側(cè)偏癱缺失，鼻竇炎，支氣管炎或多囊腎等。然而，雄性不育個(gè)體的精子在數(shù)量上比正常精子數(shù)低，精子的活動(dòng)力明顯缺失（盡管在結(jié)構(gòu)上的異常沒(méi)有得到證實(shí)）。此外，會(huì)出現(xiàn)少量生精小管中的生精細(xì)胞退化，因此可得出以下結(jié)論：SPAG16可通過(guò)影響精子數(shù)量及活動(dòng)力，對(duì)精子鞭毛的功能起重要的作用。

有文獻(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)[17]，缺乏SPAG16L基因的正常純合小鼠，鞭毛回應(yīng)鈣的能力下降，直接影響了鞭毛接受微管滑動(dòng)動(dòng)力蛋白的作用，使精子鞭毛發(fā)生彎曲，進(jìn)而影響了精子的運(yùn)動(dòng)力。綜上所述可見(jiàn)，SPAG16L是維持正常精子運(yùn)動(dòng)力和男性生育能力必不可少的基因。

三、有絲分裂表達(dá)基因1（ meiosis expressed gene 1，MEIG1）

前面已述SPAG16基因是精子形成的重要調(diào)節(jié)因子。SPAG16S是SPAG16基因的一個(gè)亞型，分子量為35kDa，首先被發(fā)現(xiàn)在精子發(fā)生中扮演著重要角色，酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明，其與減數(shù)分裂表達(dá)基因1（MEIG1）可發(fā)生蛋白間的相互作用。有文獻(xiàn)報(bào)道[18]，當(dāng)MEIG1基因缺失后，突變雄性小鼠在減數(shù)分裂過(guò)程中未見(jiàn)明顯異常，但在精子發(fā)生階段的延長(zhǎng)和濃縮階段出現(xiàn)明顯缺陷。在MEIG1基因缺失小鼠中，通過(guò)透射電子顯微鏡觀察顯示，一種叫精子領(lǐng)的結(jié)構(gòu)是精子頭部和鞭毛形成必不可少的微管細(xì)胞器。MEIG1基因和Parkin基因聯(lián)合調(diào)節(jié)精子，MEIG1基因缺失小鼠同時(shí)在睪丸組織中出現(xiàn)PACRG蛋白表達(dá)減少。MEIG1基因在精子軸絲/鞭毛的裝配以及PACRG缺失基因小鼠模型的生殖表型中發(fā)揮著重要作用。MEIG1/PACRG在精子領(lǐng)（manchette）結(jié)構(gòu)功能和精子控制方面的伙伴關(guān)系提供了關(guān)鍵角色[19]。

MEIG1的功能仍然不明，之前的研究顯示MEIG1與SPAG16S相關(guān)聯(lián)，SPAG16S蛋白是一種精子發(fā)生必不可少的核蛋白。最近的研究還表明，MEIG1可能是精子發(fā)生和纖毛功能形成必不可少的。MEIG1的表達(dá)在熱休克轉(zhuǎn)錄因子2（Hsf2）突變小鼠體內(nèi)大為降低，這可能導(dǎo)致該突變小鼠生精障礙和生育能力下降[20]。生物信息學(xué)分析顯示，MEIG1在鞭毛細(xì)胞豐富的組織中表達(dá)最多，如睪丸、肺、嗅感覺(jué)神經(jīng)元等，因此推斷MEIG1對(duì)鞭毛功能形成有很重要的作用[21]。

為了研究MEIG1基因潛在的功能，有學(xué)者建立了MEIG1的條件基因敲除小鼠模型，并通過(guò)與CMVCre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，使得MEIG1基因在小鼠體內(nèi)完全刪除?；蚯贸∈蟮难芯勘砻骺色@得純合子的小鼠，但雄性小鼠是不育的，僅能產(chǎn)生少數(shù)形態(tài)異常的精子，精子發(fā)生在延伸和濃縮階段大幅減值。這些研究表明，MEIG1是精子形成調(diào)控的關(guān)鍵蛋白。以前的研究認(rèn)為，MEIG1在減數(shù)分裂中可能發(fā)揮著作用。但最新的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示MEIG1非減數(shù)分裂所必需的，但對(duì)于精子形成是必須的。

四、S-SOX5（SRY-related High Mobility Group Transcription Factor）

SOX5來(lái)自成人睪丸的cDNA文庫(kù)，是被發(fā)現(xiàn)的SOX（Sry-type HMG box）基因群的新成員，SOX基因群是人類(lèi)Y染色體性別決定基因中的一類(lèi)基因，該基因是作用于睪丸而非卵巢組織[22]。SOX基因分為10組，由A-J，它們分別調(diào)節(jié)不同組織的發(fā)育過(guò)程。SOX5是SOXD中的成員，含有僅在成人睪丸高表達(dá)2kb的S-SOX5和在其他組織中表達(dá)6kb的L-SOX5，S-SOX5編碼48kDa的蛋白缺乏N-端，分子量是L-SOX5編碼的蛋白的一半[23]。有文獻(xiàn)報(bào)道[24]，SOX5的過(guò)度表達(dá)與前列腺癌的發(fā)生有聯(lián)系。此外，當(dāng)SOX5在12p12.1處單劑量不足，表現(xiàn)出語(yǔ)言發(fā)育遲緩，行為能力問(wèn)題和輕微的變形特征[25]。最先在鼠類(lèi)中被發(fā)現(xiàn)的是S-SOX5，高度同源于SOX5，一直被命名為SOX5出現(xiàn)于許多文獻(xiàn)中，然而，近期證實(shí)人類(lèi)和鼠類(lèi)都被發(fā)現(xiàn)有L-SOX5的存在，但是大多數(shù)作者將這作為SOX5同種型，L-SOX5在軟骨細(xì)胞與條紋肌肉細(xì)胞中高度表達(dá)，與SOX6高度同源[26]，提示可能在人類(lèi)軟骨和肌肉發(fā)展中起作用，有文獻(xiàn)報(bào)道[27]，L-SOX5和SOX6，SOX9共同在人類(lèi)間質(zhì)干細(xì)胞的介導(dǎo)下參與軟骨的形成，調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的形成。Kiselak等的文章指出[28]，S-SOX5是調(diào)節(jié)精子相關(guān)抗原SPAG6的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，之前的研究已經(jīng)表明，SPAG6對(duì)維持精子鞭毛結(jié)構(gòu)完整和精子鞭毛活動(dòng)有重要作用，直接影響了精子的發(fā)生和運(yùn)動(dòng)。經(jīng)過(guò)一系列分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)S-SOX5在BEAS-2B細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)時(shí)，SPAG6的基因表達(dá)就向上調(diào)節(jié)，當(dāng)S-SOX5用RNA干擾，抑制其表達(dá)時(shí)，SPAG6的基因表達(dá)就向下調(diào)節(jié)。由此可見(jiàn)，S-SOX5是調(diào)控SPAG6的一個(gè)重要因子，在調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)鞭毛的形成和維持其功能扮演著重要的角色。S-SOX5的表達(dá)直接影響著SPAG6的表達(dá)，也就間接地影響了精子的發(fā)生和運(yùn)動(dòng)。

五、睪丸特定激酶（TSSK2）

SPAG16L編碼的蛋白對(duì)正常精子的活力和雄性生殖力有著重要的作用，SPAG16L包含許多潛在的磷酸化位點(diǎn)，并且該蛋白已被證實(shí)是在體內(nèi)進(jìn)行磷酸化[29]。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了睪丸特定激酶TSSK2[30]，可能是能與SPAG16L發(fā)生反應(yīng)的重要蛋白。TSSK2和SPAG16L的相互作用是通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)得到進(jìn)一步證實(shí)：這兩種蛋白都取自睪丸和一些能表達(dá)該兩種蛋白的細(xì)胞溶解物，通過(guò)共聚焦顯微鏡顯示，它們共同表達(dá)并定位于CHO細(xì)胞中，在SPAG16L的C-端發(fā)生相互作用，而SPAG16L的N-端包含一個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，不能和TSSK2相互作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，SPAG16L可被TSSK2進(jìn)行磷酸化作用。在大多數(shù)沒(méi)有SPAG16L的老鼠睪丸中，TSSK2表現(xiàn)出缺失和顯著性降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)論表明，SPAG16L是TSSK2的酶作用底物。由此可見(jiàn)，TSSK2直接影響了SPAG16L發(fā)生磷酸化，間接影響了精子的發(fā)生和運(yùn)動(dòng)。

Xu等的研究表明[31]，在鞭毛形成過(guò)程中，減數(shù)分裂后TSSK2集中定位于精細(xì)胞的中心體中，除了定位于中心體中，TSSK2還定位于鼠類(lèi)附睪內(nèi)精子的尾部和頂體部，定位于人類(lèi)精子的赤道段，頸部和中段部。TSSK2/TSKS是第一對(duì)被發(fā)現(xiàn)其定位于精細(xì)胞的中心粒和精細(xì)胞中的激酶/底物。研究結(jié)論是，當(dāng)TSSK2/TSKS單倍劑量不足，將導(dǎo)致雄性不育，由此可見(jiàn)，在精子形成過(guò)程中，特別是鞭毛形成的階段，TSSK2扮演著不可或缺的作用。

精子的生成機(jī)制極其復(fù)雜，參與調(diào)節(jié)精子發(fā)生的基因也很多，其調(diào)節(jié)通路繁多，而且各個(gè)蛋白相互作用，存在交叉點(diǎn)，選取主要的通路或是關(guān)鍵交叉點(diǎn)進(jìn)行研究，研究重要蛋白相互作用（如SPAG6與S-SOX5，Meig1與Parkin，SPAG16L與TSSK2等）是我們今后研究的重點(diǎn)，下一步我們課題組準(zhǔn)備從各通路相互作用入手深入研究精子生成缺陷機(jī)制，為治療精子生成障礙等相關(guān)疾病提供新思路。

致謝：本課題受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金（81172462）、（81300536）、（81302401）及湖北省自然科學(xué)基金（2012FFB04904）、（2013CFB331）資助

不育, 男性; 精子相關(guān)蛋白; 精子發(fā)生

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（2013-11-05收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.04.021

R 698.2