內(nèi)皮祖細(xì)胞在缺血性卒中后血管再生中的作用

謝宸宸，羅勇

卒中是威脅人類健康的三大疾病之一。每年全球約有550萬(wàn)人死于卒中[1]。每年因卒中死亡人數(shù)占全部死亡人數(shù)的9.7%，發(fā)展中國(guó)家卒中患病人數(shù)占全球患病人數(shù)的85%[2]。專家預(yù)測(cè)，如無(wú)有效的臨床和公共衛(wèi)生干預(yù)，2030年初患卒中的人數(shù)將升至2300萬(wàn)，卒中死亡人數(shù)將升至780萬(wàn)。其中，缺血性卒中占卒中的88%[3]。缺血性卒中后血管再生、腦循環(huán)結(jié)構(gòu)與功能的重建是腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能重建的重要基礎(chǔ)、前提及保障[4]。缺血性卒中后的血管重建通過(guò)內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC）增殖、遷移、分化形成新生血管，有效地促進(jìn)腦缺血組織的血管再生[5]。研究提示，EPC可促進(jìn)缺血組織的血管再生和修復(fù)，促進(jìn)缺血性卒中患者的神經(jīng)功能恢復(fù)，同時(shí)也可獨(dú)立預(yù)測(cè)心腦血管疾病患病風(fēng)險(xiǎn)[6]。含EPC的人自體細(xì)胞治療可用于治療心腦血管疾病及其他周圍血管缺血性疾病[7]。目前EPC在缺血性卒中后血管再生中的作用受到廣泛重視。現(xiàn)就近期EPC及其在缺血性卒中后腦內(nèi)血管再生中的作用做一綜述。

1 EPC的生物學(xué)特點(diǎn)

EPC分為造血系統(tǒng)來(lái)源EPC和非造血系統(tǒng)來(lái)源EPC，其中造血系統(tǒng)來(lái)源EPC包括形成集落的EPC、不形成集落的EPC、骨髓源性EPC等，主要存在于骨髓。

EPC表面標(biāo)記有：CD34、VEGFR2、CD133、c-Kit、Sca-1、CD45、CD14、CD11、vWF等。在成血管祖細(xì)胞衍變?yōu)槌墒靸?nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，EC）的過(guò)程中，EPC可能呈現(xiàn)多種細(xì)胞表面標(biāo)記，故通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)記鑒定EPC亦具挑戰(zhàn)性。以往，多認(rèn)為CD34+/VEGFR2+/CD133+細(xì)胞即為EPC，但近來(lái)發(fā)現(xiàn)其更可能是造血干細(xì)胞而非EPC，認(rèn)為其并不能分化為EC[8]。Yang等[9]發(fā)現(xiàn)，與Lin－、c-Kit+、Sca-1+，Lin－、c-Kit+，Lin－、Sca-1+聯(lián)合標(biāo)記相比，僅CD34+標(biāo)記的EPC具有更強(qiáng)的歸巢及成血管能力，認(rèn)為CD34可能更適合用以分選功能性EPC。CD34－細(xì)胞促血管再生能力的喪失，再次突顯了CD34+細(xì)胞的促血管再生作用[10]。Madeddu等[11]認(rèn)為CD34+VEGFR2+細(xì)胞可能占EPC的大部分比例，認(rèn)為更多抗原標(biāo)記結(jié)合雖可能更特異地鑒定EPC，卻會(huì)造成更低的檢出率。因此，如何選擇簡(jiǎn)單而特異的抗原標(biāo)記鑒定EPC是未來(lái)研究的目標(biāo)之一。

至今仍無(wú)特異鑒定EPC的方法，目前主要采用的方法有：細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞集落形成試驗(yàn)；EPC表面抗原標(biāo)記分選EPC亞型。根據(jù)體外培養(yǎng)EPC時(shí)程長(zhǎng)短，可分為4種類型：①早期EPC：主要表達(dá)CD45、CD14、CD11等早期表面標(biāo)志[12]；②內(nèi)皮細(xì)胞集落形成單位（colonyforming units-EC，CFU-EC）：其歸類為EPC目前頗有爭(zhēng)議，有研究認(rèn)為將其命名為循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞更為合適，因其在體內(nèi)可能通過(guò)不分化為EC的方式促進(jìn)血管再生[13]；③晚期EPC：由早期EPC進(jìn)一步長(zhǎng)時(shí)培養(yǎng)而得，更富成熟EC特性[10]；④EC克隆形成細(xì)胞（endothelial colony-forming cells，ECFC）：可不表達(dá)骨髓系和造血系表面標(biāo)志，具有強(qiáng)大的EC分化潛能。ECFC的來(lái)源仍不清楚，有研究者認(rèn)為其可能來(lái)源于血管壁，若此假設(shè)成立，ECFC可能就不是真正的干細(xì)胞，而是具強(qiáng)增殖能力的EC[14]。目前大多認(rèn)為短時(shí)程培養(yǎng)的EPC（如早期EPC、CFU-EC）主要通過(guò)分泌促血管再生因子以促進(jìn)血管的形成，而長(zhǎng)時(shí)程培養(yǎng)的EPC（如晚期EPC、ECFC）則主要通過(guò)分化為EC而促進(jìn)血管再生[15]。目前雖說(shuō)把EPC分為早期和晚期EPC受到了大多學(xué)者的認(rèn)可，但由單核細(xì)胞培養(yǎng)所得細(xì)胞仍比較混雜，這種分類方法是否正確還有待考證。

2 EPC與缺血性卒中

2.1 外周血EPC水平與缺血性卒中后功能恢復(fù)及預(yù)后的關(guān)系 缺血性卒中后外周血EPC水平與腦梗死面積及預(yù)后明顯相關(guān)。Taguchi等[16-17]采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)缺血性卒中已發(fā)作3年及以上患者的外周血EPC數(shù)量，并通過(guò)顱腦磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）計(jì)算梗死面積、腦氧代謝率和正電子發(fā)射斷層掃描評(píng)估患者的腦血管功能情況，對(duì)患者行1年的隨訪后，再次檢測(cè)外周血EPC數(shù)量，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評(píng)價(jià)患者神經(jīng)功能恢復(fù)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD34+EPC數(shù)量與梗死面積、腦血管功能密切相關(guān)，且CD34+細(xì)胞水平可預(yù)測(cè)神經(jīng)功能的恢復(fù)情況。Ghani等[6]采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病程＜4 h的急性缺血性卒中患者的外周血CD31+vWF+EPC數(shù)量，收集患者的患病年齡，吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥等心腦血管疾病危險(xiǎn)因素，并進(jìn)行Framingham風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD31+vWF+EPC數(shù)量與患病年齡、心腦血管疾病危險(xiǎn)因素及Framingham風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分顯著相關(guān)。Brea等[18]采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，分析急性缺血性卒中患者及正常人的外周血EPC的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者EPC的蛋白表達(dá)種類及量不同，考慮這種差異可能與缺血性卒中應(yīng)激對(duì)EPC功能的調(diào)控相關(guān)。EPC不僅可預(yù)測(cè)缺血性卒中的預(yù)后及神經(jīng)功能情況，同時(shí)其對(duì)缺血性卒中的發(fā)作亦有一定保護(hù)作用。如李龍宣等[19]通過(guò)檢測(cè)既往有同側(cè)短暫性腦缺血發(fā)作（transient ischemic attack，TIA）史的缺血性卒中發(fā)作24 h內(nèi)的患者外周血CD34+KDR+EPC數(shù)量，NIHSS評(píng)價(jià)其入院時(shí)的神經(jīng)功能，顱腦計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）測(cè)量腦梗死體積，發(fā)現(xiàn)前期TIA發(fā)作可促進(jìn)循環(huán)EPC的動(dòng)員，而早期外周血EPC數(shù)量可決定急性腦梗死的嚴(yán)重程度，故推測(cè)前期TIA發(fā)作對(duì)EPC的動(dòng)員作用引起的循環(huán)EPC數(shù)量增加可能改善急性腦梗死的嚴(yán)重程度，指出前期TIA發(fā)作引發(fā)的EPC數(shù)量增加對(duì)后繼缺血性卒中發(fā)作具有一定保護(hù)作用?？傊?，外周血EPC數(shù)量與腦缺血發(fā)作及其預(yù)后明顯相關(guān)，其可用于評(píng)估具有血管危險(xiǎn)因素患者的腦缺血發(fā)作可能及其預(yù)后。如何上調(diào)外周血EPC水平以增加腦內(nèi)血管再生及改善缺血性卒中預(yù)后是治療研究的重要靶點(diǎn)。

2.2 EPC移植在缺血性卒中后血管再生中的作用 缺血性卒中后EPC可通過(guò)增殖、遷移、歸巢至腦缺血區(qū)域參與腦內(nèi)血管再生。Moubarik等[20]將臍帶血中分離培養(yǎng)的ECFC通過(guò)股靜脈移植至大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠體內(nèi)并通過(guò)放射性標(biāo)記追蹤，發(fā)現(xiàn)移植24 h后ECFC即可定植到腦缺血區(qū)，增加堿性磷酸酶標(biāo)記的微血管密度，并改善神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分（modified Neurological Severity Score，mNSS）。Hess等[21]靜脈移植綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的骨髓源性細(xì)胞至MCAO大鼠眼眶后竇，發(fā)現(xiàn)缺血后3～7 d即可見GFP標(biāo)記的骨髓源性細(xì)胞參與缺血區(qū)域的血管再生。EPC移植促進(jìn)血管再生的同時(shí)也促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。富奇志等[22]將大鼠分為假手術(shù)組、缺血對(duì)照組、缺血后神經(jīng)干細(xì)胞（neuron stem cell，NSC）移植組（NSC組）、缺血后EPC移植組及NSC+EPC移植組，移植區(qū)域?yàn)榇竽X缺血半暗帶區(qū)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各時(shí)間點(diǎn)NSC+EPC組血管新生數(shù)量明顯多于NSC組、EPC組和缺血對(duì)照組，EPC可以促進(jìn)移植入MCAO模型大鼠缺血半暗帶的NSC增殖，減少其凋亡，2種細(xì)胞共移植可以促進(jìn)缺血半暗帶的血管新生。EPC移植雖可強(qiáng)有力地促進(jìn)缺血性卒中后的血管再生，但外源性的EPC的運(yùn)用目前仍存在多種未解決的問題，如移植途徑、時(shí)間、數(shù)量、細(xì)胞來(lái)源及其安全性均有待進(jìn)一步研究。

2.3 EPC及SDF-1α/CXCR4軸在缺血性卒中后血管再生中的作用 缺血性卒中后腦缺血區(qū)可釋放缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor，HIF-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質(zhì)蛋白衍生因子-1α（stromal derived factor-1α，SDF-1α）、紅細(xì)胞生成素等，激活并動(dòng)員骨髓EPC入血。其中，SDF-1α/CXCR4軸在缺血性卒中后EPC的動(dòng)員、遷移、歸巢中的作用受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)MCAO大鼠側(cè)腦室內(nèi)予以SDF-1α，可增加腦缺血區(qū)血流量，誘導(dǎo)骨髓源性細(xì)胞至腦缺血區(qū)，減少梗死體積[23]。SDF-1α與其受體CXCR4結(jié)合可通過(guò)激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而介導(dǎo)其生物學(xué)行為。CD34+CD133+KDR+EPC可表達(dá)大量CXCR4受體，而SDF-1α能增強(qiáng)其遷移、黏附能力。過(guò)表達(dá)CXCR4的EPC尾靜脈移植可減少腦缺血糖尿病模型小鼠的腦梗死體積，上調(diào)腦缺血區(qū)的微血管密度[24]。Paczkowska等[25]發(fā)現(xiàn)缺血性卒中患者1 d、3 d和7 d的外周血中CD133、CD34和CXCR4表達(dá)的增加均伴隨有血漿SDF-1α表達(dá)的增加，且急性缺血性卒中患者的SDF-1α水平與早期外周血EPC數(shù)量相關(guān)[19]。孫宏毅等[26]采用祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)電針干預(yù)大鼠“合谷穴”，發(fā)現(xiàn)MCAO后大鼠外周血SDF-1α的表達(dá)上調(diào)，骨髓和外周血VEGFR2+EPC、CXCR4+EPC數(shù)量增加，而電針可進(jìn)一步增加外周血EPC數(shù)量及SDF-1α的表達(dá)。同時(shí)，外周血SDF-1α濃度可作為循環(huán)EPC數(shù)量的預(yù)測(cè)指標(biāo)。Xiao等[27]對(duì)Bruneck研究群體的SDF-1α、CXCR4的單核苷酸基因多態(tài)性、外周血血漿SDF-1α和EPC數(shù)量等進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)SDF-1α基因多態(tài)性能夠影響血漿SDF-1α濃度、循環(huán)EPC數(shù)量。綜上所述，SDF-1α可能增強(qiáng)腦缺血后EPC的動(dòng)員、遷移和歸巢至缺血區(qū)域，且這一過(guò)程與SDF-1α/CXCR4軸密切相關(guān)。

EPC不僅可用于評(píng)估和預(yù)測(cè)心血管疾病，亦可用于評(píng)估具有血管危險(xiǎn)因素患者缺血性卒中發(fā)作的可能并評(píng)估其預(yù)后。EPC動(dòng)員、遷移、歸巢參與腦缺血區(qū)血管再生機(jī)制很多，希望可以探索出簡(jiǎn)單有效并可廣泛應(yīng)用于臨床的干預(yù)手段，以達(dá)到改善缺血性卒中患者的治療效果并促進(jìn)患者康復(fù)的目的。近年來(lái)對(duì)缺血性卒中后EPC在血管再生中作用的研究多采取了細(xì)胞移植的手段，而整體水平的研究較少，對(duì)于機(jī)體內(nèi)源性EPC在腦缺血損傷后重要的促血管再生作用研究較少，且外源性EPC的運(yùn)用目前仍存在多種未解決的問題：如如何通過(guò)血腦屏障；如何選擇更為有效的EPC植入途徑；如何克服外源性EPC移植后的衰老、死亡，如何增強(qiáng)其存活能力；EPC最佳移植數(shù)量及最佳移植時(shí)間；如何保持外源性EPC的遺傳穩(wěn)定；如為異體移植，如何克服其免疫排斥反應(yīng)等等。因此，應(yīng)進(jìn)一步增加關(guān)于內(nèi)源性EPC在缺血性卒中后腦內(nèi)血管再生中作用的研究。目前尚無(wú)特異的EPC鑒定方法，因此在一定程度上限制了內(nèi)源性EPC的鑒定及其相關(guān)的研究。如何選擇簡(jiǎn)單且更為特異的抗原標(biāo)記鑒定EPC是未來(lái)研究的目標(biāo)之一。EPC主要存在于骨髓，缺血性卒中應(yīng)激對(duì)機(jī)體自身骨髓EPC的調(diào)動(dòng)能力有限，故有效調(diào)動(dòng)并促進(jìn)EPC歸巢參與血管再生的干預(yù)手段十分必要。總之，EPC的功能及鑒定的不確定性在一定程度上限制著EPC從缺血性卒中的基礎(chǔ)研究向臨床實(shí)踐應(yīng)用的延伸。為精確鑒定EPC，了解其根本生物學(xué)特性，理清其促進(jìn)缺血性卒中后血管再生的作用機(jī)制，探索動(dòng)員內(nèi)源性EPC的有效干預(yù)手段，并應(yīng)用于臨床診療，還需做進(jìn)一步深入的探索。

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【點(diǎn)睛】

內(nèi)皮祖細(xì)胞可通過(guò)增殖、動(dòng)員、遷移、分化為內(nèi)皮細(xì)胞，從而參與缺血性卒中后的腦內(nèi)血管再生。