PCR-電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)診斷人工關(guān)節(jié)感染*

張超凡 湯一葦 林建華 張文明

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，福建福州 350004；2.紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)系與內(nèi)科學(xué)系，美國紐約）

PCR-電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)診斷人工關(guān)節(jié)感染*

張超凡 湯一葦 林建華 張文明

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，福建福州 350004；2.紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)系與內(nèi)科學(xué)系，美國紐約）

人 工 關(guān) 節(jié) 感 染（prosthetic joint infection,PJI）是關(guān)節(jié)置換術(shù)后嚴(yán)重的并發(fā)癥，在初次人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后的發(fā)生率為1%～2%，在人工關(guān)節(jié)翻修術(shù)后的發(fā)生率為 1%～10%[1]。雖然 PJI的總體發(fā)生率不高，但隨著人工關(guān)節(jié)置換術(shù)數(shù)量的增加，PJI的病例也將逐漸增多。PJI的診斷困難、治療方法復(fù)雜、療效不確切，部分患者可發(fā)生關(guān)節(jié)功能的永久喪失，給社會和家庭帶來巨大負(fù)擔(dān)。

國際上現(xiàn)有多種PJI的診斷標(biāo)準(zhǔn)，如美國肌肉骨骼 感 染 協(xié) 會（MSIS）標(biāo) 準(zhǔn)[2]、美 國 骨 科 醫(yī) 師 協(xié) 會（AAOS）標(biāo)準(zhǔn)[3]以及 2013 年 8 月最新于美國 費(fèi) 城 制訂的假體周圍感染的國際共識[4]。PJI的診斷綜合了患者的臨床表現(xiàn)、關(guān)節(jié)液白細(xì)胞計(jì)數(shù)、關(guān)節(jié)液或假體周圍組織細(xì)菌培養(yǎng)、術(shù)中冰凍切片、血清學(xué)檢查（如ESR、CRP等），其中假體周圍組織或關(guān)節(jié)液的細(xì)菌培養(yǎng)陽性是診斷PJI的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法的敏感性為 50%～65%[5,6]，臨床上還有很多診斷為 PJI但細(xì)菌培養(yǎng)陰性的病例[6,7]。另外，PJI的細(xì)菌培養(yǎng)方法還有一些不足之處，如部分患者術(shù)前取材困難、培養(yǎng)時間較長（2 周或更長）[4]，且有一定的假陽性率[7]。

近年來，微生物分子診斷技術(shù)如多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction,PCR）、熒光原位雜交技 術(shù)（flurorescent in situ hybridization,FISH）等 開 始應(yīng)用于 PJI的研究，以PCR技術(shù)應(yīng)用最多。PCR方法多 樣 ，如 針 對 微 生 物 16S rRNA 的 廣 譜 PCR、多 重PCR、逆轉(zhuǎn)錄 PCR（reverse transcription-PCR,RT-PCR）等，可通過設(shè)計(jì)特殊引物擴(kuò)增病原體核酸片段，以檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，從而鑒定微生物[8]。傳統(tǒng) PCR 技術(shù)檢測時間短，可獲得比細(xì)菌培養(yǎng)更高的敏感性，逐漸成為無菌體液感染診斷的“鉑金標(biāo)準(zhǔn)”，但PCR也存在假陽性率偏高、無法獲取待測微生物耐藥基因、操作復(fù)雜 等 缺點(diǎn)[5,9-11]。因 此，一 種將 PCR 與質(zhì) 譜（mass spectrometry,MS）相 結(jié) 合 的 新 型 微 生 物 分 子 診 斷 方 法PCR-MS 也開始逐漸應(yīng)用于PJI診斷的研究，而其中尤以 PCR-電噴霧電離（electrospray ionization,ESI）質(zhì)譜技術(shù)（PCR-ESI/MS）應(yīng)用最為廣泛。

1 PCR-ESI/MS技術(shù)

MS技術(shù)作為一種分析手段已有數(shù)十年的歷史。一臺質(zhì)譜儀主要由離子源、質(zhì)量分析器和離子檢測器三部分組成，其基本原理是使待測樣品在離子源中發(fā)生電離，生成不同質(zhì)荷比的帶電荷離子，經(jīng)加速電場的作用，形成離子束進(jìn)入質(zhì)量分析器。質(zhì)量分析器按不同質(zhì)荷比分離不同質(zhì)量的離子，分離后的離子依次進(jìn)入離子檢測器，經(jīng)信號放大、計(jì)算機(jī)處理，最終繪制成質(zhì)譜圖，并與已有的數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行樣品種類的鑒定[12]。

根據(jù)離子源的不同，用于微生物檢測的MS技術(shù)主要包括 ESI/MS 與基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間 - 質(zhì) 譜（matrix assisted laser desorption ionisationtime of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）兩種。ESI/MS 和上游 PCR 放大耦聯(lián)成為 PCR-ESI/MS技術(shù)，主要通過擴(kuò)增微生物核酸片段、測定擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列檢測病原體。而MALDI-TOF-MS技術(shù)則通過檢測病原體的蛋白萃取物直接識別微生物[13]。有文 獻(xiàn)報(bào)道 ，PCR-ESI/MS 技術(shù) 與 MALDI-TOF-MS 技術(shù)在微生物的鑒定能力上并無明顯區(qū)別[14]；也有文獻(xiàn)認(rèn)為，MALDI-TOF-MS 技術(shù)需要預(yù)先進(jìn)行細(xì)菌分離，檢測時間長；對細(xì)菌菌落形成單位（colony-forming units,CFU）低于 104～105的標(biāo)本，MALDI-TOF-MS 技術(shù)無法檢出，也無法檢測多重細(xì)菌感染和細(xì)菌的抗藥基因[15]。相比之下，PCR-ESI/MS 技術(shù)的優(yōu)勢較為明顯，目前在PJI診斷中的應(yīng)用也最多。

傳統(tǒng) PCR 技 術(shù)單獨(dú)用于 PJI的微生物檢測仍存在諸多缺點(diǎn)：首先，由于使用通用引物擴(kuò)增微生物核酸片段，PCR技術(shù)容易受污染細(xì)菌影響，檢測的假陽性率偏高，其中某些廣譜PCR方法還需加做后續(xù)的基因測序，操作復(fù)雜、費(fèi)時費(fèi)力；其次，目前大部分PCR方法僅能檢測樣本中的單種病原體，無法檢測出多重感染；再次，對于臨床治療至關(guān)重要的微生物藥敏結(jié)果，傳統(tǒng) PCR 技術(shù)也無法測出[5,16]。

與傳統(tǒng) PCR 技術(shù)不同，PCR-ESI/MS 技術(shù)的使用多對嚴(yán)格設(shè)計(jì)的通用性及種屬特異性引物擴(kuò)增病原體DNA的特定區(qū)域。引物設(shè)計(jì)方式的改良不僅減少了污染菌的檢出機(jī)會，還減少了所需的樣本量。此外，PCR-ESI/MS 質(zhì)譜儀從標(biāo)本制備完成到最后得出試驗(yàn)結(jié)果僅需 6 h，且全程自動化，明顯提高了檢測效率；而其讀數(shù)方便，最后結(jié)果還包含了置信區(qū)間，讓研究者對最后結(jié)果的解讀也更具科學(xué)性[17]。

2005 年首次報(bào)道 PCR-ESI/MS 技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病的診斷[18,19]，2008 年以來，其在微生物檢測、流行病調(diào)查、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域均有應(yīng)用[13]。Kevin 等[20]將其用于血培養(yǎng)瓶陽性標(biāo)本的病原體鑒定，可將檢出的微生物精確到“種”水平，此技術(shù)平臺有望直接應(yīng)用于全血標(biāo)本成為快速診斷菌血癥的全新手段[21,22]。在一項(xiàng)納入近千份標(biāo)本的前瞻性對照研究中，該技術(shù)的靈敏度是常規(guī)血培養(yǎng)的兩倍，而檢測時間則縮短至 1 d 以內(nèi)。進(jìn)一步臨床資料分析結(jié)果提示，絕大多數(shù)標(biāo)本血培養(yǎng)陰性，該技術(shù)陽性的患者為臨床敗血癥[23]。Ecker等[24]則將該技術(shù)用于進(jìn)一步分析微生物的基因型。除細(xì)菌病原體外，該技術(shù)還用于檢測鑒定病毒[25,26]、瘧原蟲[27]和真菌病原體[28-31]。在自然界，PCR-ESI/MS 技術(shù)還可檢測多種植物和水生環(huán)境中的病原體[32,33]。目前，使用 PCR-ESI/MS 技術(shù)不僅可檢測超過3400種細(xì)菌和40多種真菌、病毒，還可檢測病原體的抗生素耐藥基因，如 vanA、vanB、blaKPC、mecA等，以指導(dǎo)臨床抗生素使用；此外，對于復(fù)雜的多重細(xì)菌感染，PCR-ESI/MS 技術(shù)也可快速檢出[34]。

2 PCR-ESI/MS技術(shù)在PJI 診斷中的應(yīng)用

2.1 PCR-ESI/MS 的檢測靈敏性與特異性

Ibis T5000 質(zhì)譜儀與 PLEX-ID 質(zhì)譜儀是現(xiàn)有 PJI的研究報(bào)道中應(yīng)用最多的儀器，Ibis T5000 質(zhì)譜儀最初由美國 Ibis生物科學(xué)公司研制，雅培公司于 2009年將 Ibis公司收購，并將 Ibis T5000 升級為 PLEX-ID系統(tǒng)。

一個新診斷方法的敏感性與特異性是臨床醫(yī)師最 關(guān)注 的問 題 。 Jacovides等[35]分 別 使 用 Ibis T5000質(zhì)譜儀與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法對臨床診斷為 PJI的 23例患者的術(shù)中關(guān)節(jié)液標(biāo)本進(jìn)行病原菌檢測，最終Ibis T5000 檢測陽性 22 例，傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)檢測陽性 18例，其中17例通過兩種方法檢出了相同的細(xì)菌，顯示了很好的一致性；Ibis T5000 檢測在傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)陰性的5例中檢出細(xì)菌4例，顯示了更高的敏感性。Rasouli等[16]的 一 項(xiàng)類似研究使用 Ibis T5000 質(zhì) 譜 儀檢測了65例全膝關(guān)節(jié)翻修術(shù)中的關(guān)節(jié)液，術(shù)前診斷為PJI的 21 例患者中的 Ibis T5000 檢測陽性 19 例，而細(xì)菌培養(yǎng)方法僅 10例（陽性率不足 50%），同樣提示Ibis T5000 檢測有更高的敏感性。Greenwood-Quaintance等[36]的最近一項(xiàng)研究分別使用 PLEX-ID 質(zhì)譜儀與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)對431份髖、膝關(guān)節(jié)翻修術(shù)中取出的假體經(jīng)超聲波裂解、離心的液體進(jìn)行檢測，其中152例患者術(shù)前診斷為 PJI，279 例為無菌性松動（aseptic failure,AF）。152 例中 118 例經(jīng) PLEX-ID 檢測到細(xì)菌DNA（敏感性為 77.6%，特異性為 93.5%）；而傳統(tǒng)細(xì)菌 培 養(yǎng) 陽 性 106 例（敏 感 性 為 69.7% ，特異 性 為99.3%），兩者的敏感性與特異性均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。PLEX-ID 檢測陽性的 118 例標(biāo)本中 85 例檢出的細(xì)菌與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)檢出的細(xì)菌完全一致，17例細(xì)菌培養(yǎng)陰性，10例傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)還得到額外的細(xì)菌，4例PLEX-ID 檢出額外細(xì)菌，而另有 2 例用兩種方法檢出完全不同的細(xì)菌。在106例細(xì)菌培養(yǎng)陽性的標(biāo)本中5例并未被 PLEX-ID 檢出。Greenwood-Quaintance等[36]的研究還發(fā)現(xiàn)，35 例術(shù)前 14 d 內(nèi)使用抗生素治療的PJI患者的標(biāo)本中PLEX-ID 檢測的敏感性為85.7%，傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)的敏感性僅為 65.7%（P=0.0196）；61 例術(shù)前 28 d 內(nèi)使用抗生素治療的PJI患者的標(biāo)本中 PLEXID 檢測的 敏感 性為 85.7%，高于傳 統(tǒng)細(xì) 菌培 養(yǎng) 的73.8%（P=0.0348），說明 PJI患者關(guān)節(jié)翻修手術(shù)前使用抗生素治療對細(xì)菌培養(yǎng)的影響較大，對 PCR-ESI/MS技術(shù)的影響小，反映了PLEX-ID 檢測較強(qiáng)的微生物檢測能力。

術(shù)前診斷為人工關(guān)節(jié)AF而行翻修手術(shù)的患者中 ，Jacovides 等[35]使 用 Ibis T5000 質(zhì) 譜儀 檢 測 57 例AF 患者的關(guān)節(jié)液標(biāo)本，其中50例檢出細(xì)菌DNA（陽性率為88%），而傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)只有1例標(biāo)本陽性（陽性率為 1.8%）；Rasouli等[16]使用同樣的儀器與方法，44 例 AF 患者的 Ibis T5000 檢測陽性 17 例（陽性率為38%），其中2例在一期翻修術(shù)后早期即出現(xiàn)了感染，其余15例短期隨訪（12～26個月）未出現(xiàn)感染征象；Greenwood-Quaintance 等[36]使 用 PLEX-ID 質(zhì) 譜儀 檢測了279例AF患者翻修術(shù)中取出的假體經(jīng)超聲裂解后的液體，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌 DNA 陽性 18 例（陽性率為6.5%），但18 例陽性標(biāo)本中 14例無法用其他檢測方法（包括細(xì)菌培養(yǎng)、16SrRNA PCR 測序和 PCR 芯片技術(shù)）加以證實(shí)；9例檢測出水/土壤的細(xì)菌（其中7例經(jīng)最后鑒定是PCR處理過程污染或試劑污染）；3例能用其他分子診斷方法（16SrRNA PCR 測序和 PCR 芯片技術(shù)）檢測出同一種基因型細(xì)菌，但細(xì)菌培養(yǎng)陰性；1 例 PLEX-ID 檢測出細(xì)菌 DNA，但其他方法檢測出不同基因型的細(xì)菌。

上述 3 個研究中 Ibis T5000/PLEX-ID 在 AF 患者中的檢測陽性率差別很大，Greenwood-Quaintance等[36]認(rèn)為標(biāo)本的處理、儀器軟件及硬件的差別可能是主要原因：在他們的研究中，PLEX-ID 檢測的是經(jīng)過超聲裂解和震蕩離心法處理過的標(biāo)本；PLEX-ID 是為臨床應(yīng)用而設(shè)計(jì)，使用更為完善的軟硬件系統(tǒng)和更嚴(yán)格的分析標(biāo)準(zhǔn)，而 Ibis T5000 是較早的儀器，其硬件和軟件都不如 PLEX-ID，且沒有分析標(biāo)準(zhǔn)和閾值設(shè)定（cut off），其檢測準(zhǔn)確性較差。

微生物分子檢測結(jié)果的判讀要比傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)復(fù)雜得多，一個陽性的分子檢測結(jié)果的真正含義僅是在一個臨床標(biāo)本中找到了該微生物特異的核苷酸片段，但這可以是微生物污染（Contamination）、定植（Colonization）或感染（Infection），因而其臨床意義最終 仍 需 結(jié) 合 患 者 的 臨 床 資 料 進(jìn) 一 步 明 確[37]。 Jacovides等[35]的研究應(yīng)用 Ibis T5000 檢測了 7 例初次進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換患者的關(guān)節(jié)液，最終有5例檢測陽性，其中有4例還同時檢出了3種細(xì)菌。他們在后續(xù)的研究中還繼續(xù)使用FISH等微生物檢測方法進(jìn)行輔助驗(yàn)證，結(jié)果顯示這5例接受初次關(guān)節(jié)置換的患者關(guān)節(jié)腔中的確有和 Ibis T5000 檢測結(jié)果一致的微生物存在。然而，作者對于如何解釋這一結(jié)果仍無定論，并開 展 更 多 大 樣 本 的 研 究 ，是 Ibis T5000 檢 測 技 術(shù) 的“高靈敏度”導(dǎo)致的假陽性，還是檢測過程的污染仍需進(jìn)一步研究。

2.2 PCR-ESI/MS 檢測多重感染與耐藥基因

PCR/ESI-MS 技術(shù) 在 多重細(xì)菌 感 染的檢測 上 也具優(yōu)勢。Stoodley 等[17]在 1 例全踝關(guān)節(jié)置換術(shù)后臨床考慮感染，但術(shù)前關(guān)節(jié)腔穿刺培養(yǎng)陰性的患者中使用 Ibis T5000 檢測假體周圍組織標(biāo)本，最終同時檢出了耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA）和表皮葡萄球菌，而傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法僅檢出MRSA，并進(jìn)一步使用FISH等分子診斷方法驗(yàn)證上述結(jié)果的準(zhǔn)確性，減少檢測假陽性的可能。Gallo 等[38]也在 1 例臨床考慮感染但細(xì)菌培養(yǎng)陰性的全髖置換術(shù)后患者中用 Ibis T5000 檢測假體周圍組織標(biāo)本，最終不僅檢出MRSA，還檢出高載量的蠟樣芽孢桿菌，而該例患者術(shù)前還使用了抗生素治療，提示了 Ibis T5000 良好 的檢測敏感性。但 Stoodley 等[17]和 Gallo 等[38]的研究均只納入了 1 名患者，樣本量太小，有一定的局限性。

PCR/ESI-MS 技 術(shù) 同樣可檢測 待測微生物 的 耐藥基因。Stoodley 等[17]、Jacovides等[35]和 Gallo 等[38]的研究中均使用 Ibis T5000 檢出與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法檢 出 的 MRSA 相 對 應(yīng) 的 mecA 耐 藥 基 因 ；Greenwood-Quaintance 等[36]的 152 例 PJI標(biāo) 本 中 ，PLEX-ID在 10 例標(biāo)本中檢出了 mecA 基因，而這 10 份標(biāo)本傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)并未檢出MRSA菌。準(zhǔn)確判別樣本是否為多重細(xì)菌感染并進(jìn)一步獲取微生物的藥敏信息對于 PJI的治療意義重大，PCR/ESI-MS 技術(shù)在這方面顯示了很好的檢測潛力，但仍有待更多研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上，PJI的診斷一直是關(guān)節(jié)外科和微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域的難點(diǎn)，尋找快速、準(zhǔn)確的微生物檢測技術(shù)對于PJI的診斷至關(guān)重要。PCR-ESI/MS 技術(shù)具有敏感性高、可檢測多重微生物感染和微生物的耐藥基因、檢測時間短、操作便捷等優(yōu)點(diǎn)，為 PJI的診斷提供了新的思路。但 PCR-ESI/MS 技術(shù)也有一些缺點(diǎn)，如假陽性率高、儀器及耗材昂貴等。PCR-ESI/MS 技術(shù)能否成為臨床微生物室的常規(guī)工作，仍需進(jìn)一步研究。

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福建省科技廳國際合作重點(diǎn)課題（2013I0002）；福建省臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目

**通信作者：張文明，E-mail:zhangwm0591@163.com