副豬嗜血桿菌的分離與血清型鑒定

于 江，吳家強(qiáng)，張玉玉，陶海英，王金寶＊

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南250100；3.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗室，山東濟(jì)南250100）

副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis，HPS）是定居于健康豬的上呼吸道的常在菌，但在特定條件下可以侵入機(jī)體，引起發(fā)病豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等疾?。?］。近年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化發(fā)展，該病以繼發(fā)的方式存在于各規(guī)?；i場，并呈逐年上升趨勢，增加了斷奶到保育階段仔豬的發(fā)病率及死亡率，對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已逐漸成為世界范圍的重要疾?。?］。

HPS的血清型復(fù)雜多樣，按Kieletein－Rapp－Gabriedson（KRG）瓊脂擴(kuò)散血清分型方法，至少可將副豬嗜血桿菌分為15個血清型［3］。蔡旭旺等［4］研究表明我國以血清4型（24.2%）和5型（19.2%）最為流行，其次為13型（12.5%），14型（7.1%）和12型（6.8%），另外有12.1%的分離菌株不能進(jìn)行血清學(xué)分型［4］。

近幾年，HPS在我國各地豬場引起多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報道屢見不鮮，已從不同地區(qū)分離出該菌，損失相當(dāng)慘重［5］。臧瑩安等［6］對廣東省部分豬場進(jìn)行了HPS流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明不同豬場感染HPS的陽性率是不同的。白剛等［7］對寧夏四個地區(qū)未接種HPS疫苗豬場的403份豬血清進(jìn)行了HPS的血清抗體檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)寧夏不同地區(qū)流行情況各有差異，且4～10周齡的仔豬感染HPS的比率最高。

本研究采用細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)合PCR 檢測的方法，對2008年至2012年送檢的來自山東、河南、河北、湖南、江蘇、上海的多個豬場的186份樣品進(jìn)行HPS的分離鑒定，用瓊脂擴(kuò)散試驗對分離菌株的血清型進(jìn)行鑒定，分析該病的發(fā)生與季節(jié)和豬日齡的關(guān)系，以了解副豬嗜血桿菌病的流行情況，為該病的綜合防控及治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

從2008年至2012年，于山東、河南、河北、湖南、江蘇、上海的多個豬場采集鼻拭子及發(fā)病豬場的疑似病例（包括發(fā)病豬、病死豬或發(fā)病豬的腦、肺臟、關(guān)節(jié)、心臟），共186份。

1.2 主要試劑與儀器

HPS標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存、提供；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）為美國BD 公司產(chǎn)品；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）為Sigma公司產(chǎn)品；新生牛血清購自濟(jì)南勁牛公司；Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000購自大連寶生物工程有限公司。恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司；PTC－2000 型PCR 儀購自美國MJ Research公司。

1.3 PCR 引物

根據(jù)Oliveira等［15］報道，由上海生物工程有限公司合成1對特異引物。

上游引物：5＇－GTGATGAGGAAGGGTGGTGT－3＇；下游引物：5＇－GGCTTCGTCACCCTCTGT－3＇。預(yù)期擴(kuò)增的片段大小為822bp。

1.4 菌株的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

無菌采集多個豬場的鼻拭子及疑似HPS病的發(fā)病豬病料（如腦、肺臟、心包液、心血、關(guān)節(jié)液），劃線接種于含10mg／mL NAD 和5%新生牛血清的TSA 培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36～72h，觀察細(xì)菌菌落特征，挑取圓形、光滑濕潤、無色透明的露珠樣菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，將鏡檢為可疑的菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.5 PCR 擴(kuò)增

采用直接煮沸法從HPS分離株培養(yǎng)物中提取DNA［4］，PCR擴(kuò)增方法按于江等［9］描述的方法進(jìn)行。

1.6 菌株的血清型鑒定方法

根據(jù)蔡旭旺等［4］方法制備各分離菌株的血清學(xué)分型抗原，以各血清型標(biāo)準(zhǔn)血清對各分離株進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗，以確定各分離株的血清型，統(tǒng)計HPS分離的陽性率。陽性率＝（陽性數(shù)／分離株數(shù)）×100%。

1.7 統(tǒng)計處理

各組之間差異用ANOVA 進(jìn)行分析，比較不同時間和不同年齡段豬HPS的感染陽性率，P＜0.05表示差異顯著，分析HPS分離菌株不同血清型流行病學(xué)調(diào)查情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離培養(yǎng)

分離培養(yǎng)獲得57株疑似HPS分菌株，并在含10mg／mL NAD 和5%新生牛血清的TSA 培養(yǎng)基長出較多的圓形、光滑濕潤、無色透明的露珠狀小菌落（圖1A）。取上述菌落涂片革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，細(xì)菌為革蘭氏陰性的細(xì)小桿菌，呈球桿狀、短桿狀、長桿狀、間或絲狀等多種形態(tài)（圖1B）。

2.2 病原菌PCR 擴(kuò)增結(jié)果

用HPS特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)57株疑似HPS分菌株均擴(kuò)增獲得了長度為822bp的DNA 片段，與目的片段大小一致（圖2）。

圖1 HPS分離株在TSA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及顯微鏡下細(xì)菌形態(tài)Fig.1 The colony morphology in TSA and bacteria morphology under microscope of HPS isolated strains

2.3 血清型鑒定

將分離出的57株HPS，采用瓊脂擴(kuò)散試驗進(jìn)行血清學(xué)分型，結(jié)果如表1所示。2株分離株不能確定血清型，而在55 株可以確定血清型的分離株中，血清4型和5 型陽性率相對較高，其次是血清1、12、13型，而血清14型分離到3株，血清2、6、、8、10、11型各分離到2株，血清3、9型各分離到1株，血清7型和15型目前尚未分離到。

2.4 不同時間HPS分離菌株的檢測結(jié)果

從2008～2012年共檢測186 份樣品，其中57份為HPS陽性。該病主要集中于每年的3、4、10、11、12月份（P＜0.05），說明該病春季、秋季、冬季的發(fā)病率要高于夏季。各月份檢測陽性率見表2。

圖2 HPS分離株的PCR 擴(kuò)增結(jié)果M.DL2000 Marker；1.HPS分離菌株；2.陽性對照；3.陰性對照Fig.2 PCR amplification of HPS isolated strainsM.DL2000 Marker；1.HPS isolated strain；2.Positive control；3.Negative control

表1 HPS分離菌株血清型鑒定結(jié)果Table 1 Serotype identification results of HPS isolated strains

表2 不同月份HPS分離菌株的檢出情況Table 2 The detection of HPS isolated strains in different month

2.5 不同日齡豬HPS感染情況

統(tǒng)計57份HPS陽性的樣品的日齡，其中0～30日齡有18例，31～50日齡有28例，51～80日齡有8例，81日齡以上有3例?？梢钥闯觯琀PS主要感染保育舍的3l～50日齡（即4～7周齡）的小豬。

3 討論

HPS是豬上呼吸道的一種常在菌，在特定條件下可以侵入機(jī)體引起全身性疾?。?0］。該菌可以影響2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶后和保育階段發(fā)病，發(fā)病率一般在10%～15%，嚴(yán)重時死亡率可達(dá)50%［11］。

HPS的血清型復(fù)雜多樣，目前已知有15個血清型，但國內(nèi)外各地流行的血清型不盡相同，這給該病的防治帶來了極大的困難。本研究從186份新鮮樣品中共分離鑒定得到57株HPS分離株，血清型鑒定結(jié)果表明，血清4型和5型是該菌流行的優(yōu)勢血清型，其次是血清1、12、13、14 型；這與蔡旭旺等［4］的研究結(jié)果稍有不同，可能是由于地域不同，環(huán)境差異等條件的限制。

盡管江西、湖北等省份的調(diào)查結(jié)果均顯示不同地區(qū)的HPS感染程度不同，但江西省HPS陽性率范圍為15～45%，湖北省HPS 陽性率范圍為0～58%［12－13］。本研究中HPS分離的陽性率為30.6%，與上述兩省的結(jié)果基本一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌病春、秋、冬季的發(fā)病率要高于夏季，且多發(fā)于4～7周齡的保育豬，這與尹秀鳳等［14］的研究結(jié)果是一致的，這為豬場防治本病提供了一定的幫助。了解HPS血清型的流行情況，明確該病多發(fā)的季節(jié)與豬的日齡，為HPS疫苗菌株血清型的篩選及該病的防治提供了重要的參考依據(jù)。

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