可見／近紅外漫反射光譜分析法測定牧草營養(yǎng)成分研究

李 潔，王建福，吳建平，張昌吉，王欣榮

（甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，甘肅蘭州730070）

20世紀70年代以來，隨著近紅外檢測技術(shù)（Near Infrared Reflectance Spectroscopy）的日臻成熟，化學計量學的發(fā)展以及計算機軟件處理技術(shù)的不斷進步，使得近紅外光譜中蘊含的C－H、O－H、NH 等倍頻和合頻吸收的豐富結(jié)構(gòu)信息得以準確分析，這一快速、無損的分析技術(shù)應用范圍不斷擴大，被稱為分析領(lǐng)域的巨人［1］。目前，這一技術(shù)已成功的應用于農(nóng)業(yè)、食品、化工、飼料和生物等領(lǐng)域。在飼草營養(yǎng)成分的研究方面，自從Norris等［2］人利用近紅外分析技術(shù)成功的建立了8種成分為基礎(chǔ)的牧草營養(yǎng)品質(zhì)快速檢測模型以來，國內(nèi)外的學者在利用這一技術(shù)測定牧場牧草營養(yǎng)品質(zhì)［3－4］、人工牧草營養(yǎng)成分［5－6］等方面做了大量研究，建立了許多效果良好的定標檢測模型。然而，國內(nèi)外學者前期的研究多是對自然條件下的混合牧草營養(yǎng)成分進行實驗室檢測結(jié)合近紅外光譜技術(shù)建立定標模型，或者是對人工種植的單一牧草品種進行測定和定標，不同草場，甚至同一草場的不同區(qū)域、不同季節(jié)各種牧草的含量可能大不相同，而且近紅外定標模型建立之后還需要不斷的擴充完善才有可能有效的應用于生產(chǎn)。而且，利用同一草場不同月份的單一品種牧草和混合牧草結(jié)合建立近紅外定標檢查模型的相關(guān)研究未見有報道。本研究按照新疆昭蘇草原的主要放牧季節(jié)，按不同月份采集主要牧草單一樣品和混合樣品參與定標，研究混合定標的可行性，可為以后模型的簡單有效擴充提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料包括從新疆伊犁昭蘇草原5～10月份采集的混合草樣中分離出的主要牧草品種5個（百里香、黃花苜蓿、針茅、羊茅和苔草）各33份以及混合樣品87份，合計252份。全部樣品材料經(jīng)過60℃烘干、粉碎后過40目篩用于測定營養(yǎng)成分和掃描近紅外光譜。

1.2 主要儀器及軟件

FOSS公司XDS－RCA 可見／近紅外快速成分分析儀，波長范圍：400－2500nm；雙檢測器系統(tǒng)：硅檢測器（400－1100nm），硫化鉛檢測器（1100－2 500 nm）；數(shù)據(jù)采樣頻率：2 掃描／s；光譜分辨率：2nm；波長準確度：＜0.05nm；WinISIⅢ定標軟件。

1.3 試驗方法

1.3.1 化學成分測定方法 粗蛋白（CP）測定采用凱氏定氮法；干物質(zhì)（DM）測定采用烘干稱重法；粗脂肪（EE）測定采用索氏抽提法；磷（P）測定采用酸溶－釩鉬黃比色法［7］。

1.3.2 樣品光譜測定 將采集的牧草粉碎樣品裝入圓形固定樣品杯中上機掃描。每個樣品重復裝樣掃描6次，計算其平均光譜并存儲。

1.3.3 定標和校驗 把全部樣品分成2 份，其中198份作為定標集，54 份作為預測集，在WinISIⅢ定標軟件中對198個樣品先進行聚類分析，篩選出具有代表性的樣品122 份，測定營養(yǎng)成分后輸入。先用定標樣品集建立預測模型，再做交叉檢驗，根據(jù)1－VR，SECV，SEC等指標對模型進行優(yōu)化，并最終確定最佳定標方式和模型。然后，利用54個預測樣品集對模型進行外部驗證，檢測其預測效果，評價模型的外部驗證能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 牧草營養(yǎng)成分化學分析結(jié)果

對定標樣品集和預測樣品集牧草營養(yǎng)成分的實驗室化學分析結(jié)果見表1。

表1 定標和預測樣品集牧草營養(yǎng)成分實驗室化學分析結(jié)果Table 1 The lab data of the calibration sample ＆forecast sample set forage grass

2.2 樣品光譜測定結(jié)果

4個隨機牧草樣品的可見／近紅外光譜見圖1。從圖1可以看出，測定牧草在可見／近紅外光譜區(qū)域內(nèi)均有多處吸收峰，不同的牧草樣品吸收峰高低不同，在可見和近紅外光譜區(qū)域的區(qū)分度較好，所以，可見／近紅外光譜可以作為其營養(yǎng)成分定量測定的依據(jù)［5］。

2.3 可見／近紅外校正模型的建立與優(yōu)化

試驗用WinISIⅢ定標軟件對光譜數(shù)據(jù)進行預處理，選擇全譜范圍（400～2500nm），確定主因子數(shù)。共采用12種回歸、光譜和數(shù)學處理方法組合對定標集樣品光譜進行定標（表2），CP、DM、EE 和P的最佳光譜處理和數(shù)學處理方法見表3。

從表3可以看出，建立的牧草CP可見／近紅外光譜定標模型具有較好的驗證效果，交叉驗證相關(guān)系數(shù)1－VR 為0.9836，在0.9以上；交叉驗證相對分析誤差RPD 和外部驗證相對分析誤差RPD 分別為，8.5782和5.0575，均在3以上。說明所建立的牧草CP可見／近紅外分析模型具有較高的穩(wěn)定性和良好的預測能力；所建立的可見／近紅外預測模型對于牧草DM 的預測能力稍差，但是1－VR 為0.8878，在0.85以上，外部驗證RPD 大于3，需要對定標集進一步擴充和完善以進一步提高預測準確度；模型對P的交叉驗證結(jié)果相對較差，對于EE 的交叉驗證結(jié)果最差，1－VR 只有0.3715，交叉驗證RPD 和外部驗證RPD 均未超過2。

圖1 4個隨機牧草樣品的可見／近紅外光譜圖Fig.1 The spectrum of four random forage samples

表2 定標集樣品的回歸、光譜和數(shù)學處理方法Table 2 The calibration methods evaluated

表3 CP、DM、EE和P的最佳光譜處理和數(shù)學處理結(jié)果Table 3 The best calibration methods evaluated for CP，DM，EE and P

2.4 校正模型對于CP、DM、EE和P的預測效果

校正模型建立后，采用外部驗證的方法對所建立模型的預測效果進行驗證，結(jié)果見表4。外部驗證結(jié)果說明所建立的可見／近紅外預測模型對于牧草CP的預測結(jié)果最好，其次是DM，對于EE 的預測效果最差。定標樣品營養(yǎng)成分的可見／近紅外預測值與化學值相關(guān)性的散點圖（圖2）說明牧草CP的化學測定值與預測模型的預測值具有很好的相關(guān)性，DM 和P 的化學測定值與預測模型的預測值相關(guān)性稍差，EE 的化學測定值與預測模型的預測值相關(guān)性最差。

3 討論

自1976年Norris［2］首次對牧草8種營養(yǎng)成分進行近紅外法成功測定后，對于牧草營養(yǎng)成分的近紅外檢測的相關(guān)資料已有很多，主要檢測成分包括CP、EE、粗灰分（Ash）、鈣（Ca）、磷（P）、干物質(zhì)（DM）、酸性洗滌纖維（ADF）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）、體外消化率（Digestibility）等，也建立了一些效果較好且對于部分地區(qū)或部分牧草適用的預測模型［8－9］。但是，由于不同草地的牧草種類構(gòu)成、營養(yǎng)成分含量以及氣候、土壤等環(huán)境因素的多種差異，使得目前還沒有一個較為完善的模型可以應用于各地的牧草生產(chǎn)和草原管理［4］。所以，要真正意義上實現(xiàn)近紅外光譜分析技術(shù)在評定不同地區(qū)草場飼草營養(yǎng)品質(zhì)，從而為放牧家畜實現(xiàn)營養(yǎng)精準管理提供技術(shù)支撐，就必須對不同地區(qū)、不同類型的草原牧草分別建立更為準確的近紅外快速檢測模型，然后逐年的增加數(shù)據(jù)進行校正，最后的廣泛應用還需要各個研測機構(gòu)通力合作建立起完善的數(shù)據(jù)庫交流共享機制。本研究的測定結(jié)果也表明，不同季節(jié)的牧草營養(yǎng)成分含量相差顯著，如何快速、準確的建立起不同牧場牧草營養(yǎng)成分快速測定的近紅外預測模型非常重要。

圖2 飼草樣品的CP、DM、P和EE化學值與預測值相關(guān)性Fig.2 The correlation of calibration samples CP、DM、P and EE between NIR value and chemical value

本研究對新疆昭蘇草原的主要放牧季節(jié)（5～10月）所采集的具有代表性的5種優(yōu)勢牧草品種單一和混合樣品共252個，進行了CP、DM、EE 和P 四種實驗室營養(yǎng)成分測定和可見／近紅外的定標和檢校，所建立的定標檢測模型對CP 的定標和檢校結(jié)果最好，這與聶志東等［10］對紫花苜蓿青干草的CP所建立的定標模型具有良好的準確性和預測能力一致。DM 的定標結(jié)果也具有較好的預測能力，1－VR為0.8878，且陳鵬飛等［11］研究表明近紅外光譜分析技術(shù)可用于青貯苜蓿鮮樣的DM 的檢測，可能是本研究實驗室測定值有一定的誤差，如果進一步提高樣品量和測定精度完全可以用于牧草DM 的測定。P的定標和檢校1－VR 為0.8213，可能是由于P 屬于礦物質(zhì)與近紅外光譜所反映的有機物結(jié)構(gòu)信息關(guān)系稍差，但如果提高樣品測定量和精度也可以用于牧草P的測定，而且Shenk等［12］研究表明近紅外光譜技術(shù)可以用于牧草含P 量的測定。試驗對于EE的定標結(jié)果較差，Boever等［13］的研究表明近紅外測定青貯玉米的粗脂肪效果一般，所以對于牧草的EE能否用于近紅外測定尚需進一步研究。在試驗中選用優(yōu)勢種類的單一牧草和混合牧草共同參與定標使預測的結(jié)果更具有代表性，且定標過程也更為簡單，試驗的結(jié)果也說明了這一點。但是，試驗中對于DM、EE和P等幾個指標的測定誤差還較大，而且對于評價牧草營養(yǎng)成分的ADF、NDF、ADL 以及Digestibility等指標還沒有涉及，需要在以后的工作中進一步通過測定多種指標、逐步擴充樣本量以及降低實驗室化學成分測定的誤差等多種方法對定標方程進行逐步的校正，從而實現(xiàn)在草原生態(tài)監(jiān)測和草食家畜精準管理等方面的準確應用。

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