豬精液常溫保存稀釋液的應(yīng)用研究

丑武江，王世銀，楊力偉，張兆旺，張莉君，張 偉＊

（1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉831100；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，甘肅蘭州730070；3.新疆烏魯木齊榮盛養(yǎng)殖場(chǎng)，新疆烏魯木齊830000）

隨著家畜人工授精技術(shù)優(yōu)勢(shì)的日益顯現(xiàn)，豬精液的保存越來越受到人們的重視。國(guó)內(nèi)對(duì)豬精液常溫保存稀釋液配方的研究主要集中在兩個(gè)方面，一是對(duì)稀釋液基礎(chǔ)配方的篩選，在常規(guī)葡萄糖和檸檬酸鈉液的基礎(chǔ)上，參考國(guó)外進(jìn)口稀釋液的配方組成，通過調(diào)整滲透壓、pH 或緩沖指數(shù)等篩選豬精液常溫保存稀釋液的基礎(chǔ)配方［1－5］。耿果霞等［2］研究表明，pH 為6.4 和6.5 的弱酸環(huán)境有利于豬精子的常溫保存；黃建國(guó)［3］研究表明，滲透壓為226mmol／L～387mmol／L（冰點(diǎn)下降值為0.42～0.72）時(shí)精液保存效果較好。二是研究在基礎(chǔ)液中添加安鈉加、咖啡因、維生素E、半胱氨酸以及不同的抗生素、中草藥等對(duì)豬精液常溫保存效果的影響［5－11］。羅義梅［6］發(fā)現(xiàn)，豬精液稀釋液中添加0.5%～1%的安鈉咖可有效延長(zhǎng)精子的受精能力；張能適等［7］研究認(rèn)為在每100mL稀釋液中加入5～10mg的苯甲酸鈉咖啡因也取得了較好的保存效果，張兆旺等［11］用中草藥的水劑保存豬精液，發(fā)現(xiàn)可有效緩解精子的衰老，延長(zhǎng)精子存活時(shí)間。

眾多研究對(duì)豬精液的常溫保存提供了可靠的理論依據(jù)，但缺乏系統(tǒng)的液體參數(shù)控制方法，只對(duì)某一個(gè)稀釋液參數(shù)進(jìn)行篩選，存在很大的盲目性，且大大增加了后期篩選試驗(yàn)的工作量。

鑒于此，本研究首先確立了對(duì)稀釋液重要參數(shù)－滲透壓、pH 和緩沖指數(shù)的理論控制方法，在確定其準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，借鑒前人研究成果及本實(shí)驗(yàn)室的前期研究數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)9 個(gè)稀釋液配方，并以進(jìn)口BTS液為參照，篩選出最佳稀釋液配方，旨在開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的稀釋液配方用于生產(chǎn)實(shí)踐，降低豬人工授精的成本，同時(shí)也為其它家畜、家禽稀釋液的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用精液采自烏魯木齊榮盛養(yǎng)殖場(chǎng)2頭杜洛克公豬，年齡分別為2.5歲和3歲。輸精母豬為該場(chǎng)大×長(zhǎng)二元母豬，共計(jì)120頭，胎次在3～5胎之間。試驗(yàn)動(dòng)物按常規(guī)進(jìn)行飼養(yǎng)和管理。

1.2 主要試劑及儀器

配制稀釋液的試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，電子天平（Sartorius公司）、滲透壓儀（Advanced公司）、酸度計(jì)（成都漢維斯科技有限公司）、精子質(zhì)量評(píng)定系統(tǒng)（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）、生物顯微鏡（Motic）、17 ℃恒溫箱（50L，青島海爾集團(tuán)）、超純水系統(tǒng)（ABBOTA 公司）。

1.3 稀釋液配方設(shè)計(jì)

1.3.1 精液稀釋液pH 控制 根據(jù)“酸抑制”原理，弱酸性對(duì)精子的活動(dòng)有抑制作用，有利于精液的保存，所以精液液態(tài)保存稀釋液的pH 應(yīng)該偏酸性［12］。按照沖液pH 計(jì)算公式，對(duì)其進(jìn)行控制。

式中：Pka為電離常數(shù)，Ca和Cs分別為弱酸及其弱酸鹽的濃度，Ca／Cs又稱緩沖比。將期望得到的pH 代入上式，可以得到所需pH 時(shí)需要加入的弱酸和弱酸鹽的濃度。按文獻(xiàn)［12］所示，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的研究數(shù)據(jù)，豬精液常溫保存稀釋液的pH 控制在6.0～6.5之間。

1.3.2 精液稀釋液滲透壓控制 精液液態(tài)保存稀釋液滲透壓按公式（2）進(jìn)行控制：

式中：m（g）為每配制100mL 稀釋液需要加入試劑的質(zhì)量，A（mmol／L）為滲透壓，M 為相應(yīng)試劑的分子量。n為該試劑溶于水后解離成的離子數(shù)，例如葡萄糖溶于水不解離，則n為1；KCl溶于水后解離成K＋和Cl－，則n為2。將期望得到的滲透壓值A(chǔ) 代入上式，得到要加入相應(yīng)試劑的質(zhì)量m。

1.3.3 精液稀釋液緩沖能力的控制 按照以上精液稀釋液重要指標(biāo)控制原理，參照前人研究成果及本實(shí)驗(yàn)室前期數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)9個(gè)稀釋液配方（見表1）。

1～4號(hào)液主要是通過調(diào)整葡萄糖的量控制稀釋液的滲透壓，并通過計(jì)算理論值與實(shí)際測(cè)量值的誤差確定上述滲透壓控制的準(zhǔn)確性，然后通過精液保存試驗(yàn)確定合適的滲透壓水平。5～9號(hào)液則以此滲透壓值為標(biāo)準(zhǔn)，通過調(diào)整稀釋液成分改變其pH、緩沖能力及離子強(qiáng)度，并以進(jìn)口BTS 液為參照，通過精液保存試驗(yàn)篩選最佳配方用于豬精液常溫保存。

表1 豬精液常溫保存稀釋液成分Table 1 Swine semen extender ingredient and dose

1.4 精液采集、處理及保存

手握法采集公豬精液，四層紗布濾除膠狀物，置于保溫桶中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。氣味、色澤正常，活力在0.8以上的精液分別用上述9中稀釋液按照1∶2 的比例稀釋，分裝到青霉素小瓶中，外面包上五層紗布后置于17 ℃恒溫箱中保存。每隔6 h，將稀釋精液輕輕震蕩混勻，以防精子沉淀堆積死亡。

1.5 精液保存效果評(píng)定

每12h進(jìn)行一次精液品質(zhì)評(píng)定。精子活力為直線運(yùn)動(dòng)的精子占視野中總精子數(shù)的百分率，按照10級(jí)評(píng)分制進(jìn)行評(píng)定；精子有效存活時(shí)間是指精子活力在0.5以上的保存時(shí)間；精子生存指數(shù)指相鄰兩次精子活率均數(shù)與間隔時(shí)間乘積的總和，其計(jì)算公式參照文獻(xiàn)［11］所示。

1.6 母豬輸精試驗(yàn)

通過與進(jìn)口BTS稀釋液的對(duì)比試驗(yàn)，將上述稀釋液中最優(yōu)的稀釋液按照1∶2的稀釋比例稀釋豬精液，在17℃恒溫箱中保存5d，精子活力在0.5以上的稀釋精液用于人工授精試驗(yàn)，通過情期受胎率和產(chǎn)仔數(shù)最終衡量其精液保存效果。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件用方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋液pH、滲透壓和緩沖指數(shù)控制準(zhǔn)確性

由表2知，用上述方法控制精液稀釋液的pH、滲透壓和緩沖指數(shù)切實(shí)可行，三者的準(zhǔn)確性分別達(dá)到97.1%～99.42%、98.7%～99.68%和98.48%～99.16%，完全可以滿足稀釋液配方的設(shè)計(jì)。

2.2 不同滲透壓對(duì)豬精液常溫保存的影響

由表3可以看出，當(dāng)滲透壓為345mmol／L 時(shí)，精液的有效保存時(shí)間為116.8h，生存指數(shù)26.12，均極顯著地高于滲透壓為336mmol／L、352mmol／L和370mmol／L（P＜0.01）。因此，5～9號(hào)液設(shè)計(jì)時(shí)滲透壓均控制為345mmol／L。

表2 9種稀釋液配方pH、滲透壓、緩沖指數(shù)理論值與實(shí)測(cè)值比較Table 2 The comparison of pH，osmotic pressure，buffer index of theoretical value and measured value

表3 不同滲透壓對(duì)豬精液常溫保存的影響Table 3 The effect of different osmotic pressure on swine semen preservation

2.3 最佳稀釋液配方的篩選

以345mmol／L為標(biāo)準(zhǔn)控制滲透壓，通過改變配方組分設(shè)計(jì)5－9號(hào)稀釋液，以進(jìn)口BTS液為參照，通過精液保存試驗(yàn)篩選最佳配方用于后續(xù)的常溫保存及輸精試驗(yàn)（見表4）。

由表4可知，9號(hào)液有效保存時(shí)間極顯著高于5、6、7和8號(hào)液（P＜0.01），生存指數(shù)顯著高于8號(hào)液（P＜0.05），極顯著高于5、6 和7 號(hào)液（P＜0.01）。與進(jìn)口BTS液相比，雖然BTS液的保存時(shí)間略長(zhǎng)，但二者差異不顯著（P＞0.05）?？梢?，本試驗(yàn)篩選的9號(hào)稀釋液的精液保存效果已達(dá)到進(jìn)口同類稀釋液水平，可以用于豬人工授精試驗(yàn)，以最終評(píng)價(jià)該稀釋液的優(yōu)劣。

表4 不同稀釋液對(duì)豬精液常溫保存的影響Table 4 The effect of different extender on swine semen preservation

2.4 9號(hào)稀釋液液常溫保存豬精液對(duì)母豬情期受胎率和產(chǎn)仔數(shù)的影響

以進(jìn)口BTS液為對(duì)照，用9號(hào)稀釋液稀釋豬精液，在17℃恒溫箱中保存5d，精子活力在0.5以上的稀釋精液用于人工授精試驗(yàn)。共輸精母豬120頭，具體結(jié)果見表5。

可見，和進(jìn)口BTS 液相比，9 號(hào)稀釋液常溫保存5d的豬精液情期受胎率、平均窩產(chǎn)仔數(shù)雖然略低，但二者差異不顯著（P＞0.05），可以作為其替代產(chǎn)品用于我國(guó)豬人工授精。

表5 9號(hào)稀釋液常溫保存精液配種成績(jī)Table 5 The atificial insemination result of preservation semen extended by the 9th extender

3 討論

3.1 豬精液常溫保存稀釋液主要溶液參數(shù)的控制

豬精液保存在17℃時(shí)，精子仍處于活動(dòng)狀態(tài)，只是強(qiáng)度有所下降。稀釋液的pH、滲透壓和緩沖指數(shù)對(duì)精子活力的維持具有重要影響，在稀釋液配方設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)予以重點(diǎn)考慮。這三個(gè)參數(shù)可以通過調(diào)整稀釋液各個(gè)組分的相對(duì)量而調(diào)整，但需要設(shè)計(jì)大量配方，然后通過精液保存試驗(yàn)進(jìn)行篩選，存在很大的盲目性，后期篩選試驗(yàn)工作量很大。本試驗(yàn)中，在配方設(shè)計(jì)前先通過計(jì)算對(duì)上述三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行理論控制，很大程度上避免了這種盲目性，大大提高了配方篩選的效率。通過理論計(jì)算及實(shí)際測(cè)量，pH、滲透壓和緩沖指數(shù)控制的準(zhǔn)確度分別達(dá)到97.1%～99.42%、98.7%～99.68%和98.48%～99.16%，可以滿足精液稀釋液配方設(shè)計(jì)的要求。

3.2 不同pH 對(duì)豬精液常溫保存效果的影響

酸性環(huán)境對(duì)精子活動(dòng)有抑制作用，相反堿性環(huán)境對(duì)精子活動(dòng)有刺激作用，精子可以在附睪內(nèi)存活30～60d，與附睪內(nèi)的pH 為弱酸性（6.2～6.8）有密切的關(guān)系［12］。何蘭花等［8］對(duì)稀釋液pH 為6.4、6.6、6.8和7.0時(shí)豬精液常溫保存效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明pH 為6.4時(shí)保存效果最好［8］，這與耿果霞等［2］的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中，保存效果和受胎率最高的9號(hào)液，pH 實(shí)測(cè)值為6.28，也證明偏酸性的pH 環(huán)境有利于精子活力的保存。但是由于豬精液常溫保存過程中，精子代謝產(chǎn)生的CO2會(huì)使稀釋液的pH 進(jìn)一步降低，如果超過精子的耐受能力必然會(huì)影響精子的存活，所以稀釋液自身的pH 不能過于偏酸性。

3.3 不同滲透壓對(duì)豬精液常溫保存效果的影響

精子之所以能夠在附睪中存活較長(zhǎng)的時(shí)間，除了與其中弱酸性的環(huán)境有關(guān)以外，另一個(gè)重要因素就是附睪中的滲透壓。附睪中的滲透壓偏高滲（400 mOsm），使精子發(fā)生脫水現(xiàn)象，導(dǎo)致精子缺乏活動(dòng)所需要的最低限度水分，故不能運(yùn)動(dòng)［12］。黃建國(guó)［4］研究了5 個(gè)滲透壓水平（冰點(diǎn)下降值△t為0.32、0.42、0.52、0.62、0.72和0.82，換算成毫滲透摩爾值分別為183、225、280、333、387和441mmol／L）對(duì)豬精液常溫保存效果的影響，表明當(dāng)滲透壓為333 mmol／L 時(shí)，精液有效保存時(shí)間和受胎率均最高。本試驗(yàn)中，最適宜滲透壓為345 mmol／L，與黃建國(guó)［4］的研究結(jié)果基本一致。但蔡元等［5］在對(duì)比不同進(jìn)口稀釋液精液保存效果后發(fā)現(xiàn)，滲透壓為230 mmol／L的BTS液保存效果最好，這與本試驗(yàn)及黃建國(guó)［4］的研究結(jié)果差距較大。

3.4 緩沖指數(shù)對(duì)豬精液常溫保存效果的影響

精子在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生CO2而使稀釋液pH逐漸降低。精液常溫保存稀釋液的緩沖能力，尤其是對(duì)酸的緩沖能力將直接影響精液保存的效果。目前這方面開展的研究相對(duì)較少，尚缺乏理論控制及實(shí)際測(cè)量方法，本試驗(yàn)開展的工作將對(duì)這一稀釋液參數(shù)的設(shè)計(jì)和篩選提供參考。通過對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)緩沖指數(shù)456時(shí)精液的保存效果最好。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)建立的稀釋液pH、滲透壓和緩沖指數(shù)的控制方法準(zhǔn)確度分別達(dá)到97.1%～99.42%、98.7%～99.68%和98.48%～99.16%，可以滿足精液稀釋液配方設(shè)計(jì)的要求。pH 為6.28，滲透壓為347mmol／L，緩沖指數(shù)為456的9號(hào)稀釋液精液有效保存時(shí)間為160h，保存5d后的精液情期受胎率達(dá)到80.5%，與進(jìn)口的BTS液差異不顯著，可以用于實(shí)際生產(chǎn)。

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