南疆地區(qū)四個家雞群體微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性研究

吾買爾江·艾孜木，齊·阿拉達(dá)爾，程 龍，王 永，劉永宏，努爾古麗·玉素甫，格明古麗·木哈臺＊

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾843300；2.中科院新疆地理與生態(tài)研究所系統(tǒng)基因組學(xué)實驗室，新疆烏魯木齊830011；3.林肯大學(xué)農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)系，新西蘭坎特伯雷84850；4.和靜縣和靜鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，和靜，新疆841300，China）

中國家雞品種多、分布廣、遺傳多樣性非常豐富，但由于保種不當(dāng)，商業(yè)品種的大量推廣和雜交，使原有家雞種類和數(shù)量減少、瀕臨滅絕或已滅絕。因此，對家雞遺傳資源的保存和管理已成為當(dāng)務(wù)之急。分子生物學(xué)技術(shù)是遺傳資源保存研究中必不可少的技術(shù)手段之一，通過對DNA 多態(tài)性的分析，研究種群間的親緣關(guān)系及遺傳多樣性，有助于了解品種的進(jìn)化歷史、分類地位和相互關(guān)系，為生物資源的保存利用提供理論依據(jù)［1－6］。

微衛(wèi)星是指以少數(shù)幾個核苷酸DNA 序列，具有高度保守性和位點多態(tài)性，廣泛且均勻分布于真核生物基因組中。微衛(wèi)星標(biāo)記作為第2代分子遺傳標(biāo)記，具有分布廣泛、多態(tài)信息含量高、呈共顯性遺傳及檢測快速方便等優(yōu)點，因此在雞遺傳多樣性研究中得到廣泛的應(yīng)用［7－18］。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）［19］在其持續(xù)發(fā)展和管理動物遺傳資源的戰(zhàn)略計劃中，也將微衛(wèi)星標(biāo)記作為優(yōu)先推薦的分析工具。目前微衛(wèi)星標(biāo)記已經(jīng)成為群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性研究中最普遍最有效的工具之一。

據(jù)資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，新疆和靜縣、拜城縣、阿合奇縣和塔什庫爾干縣偏遠(yuǎn)的鄉(xiāng)村遺留一些家雞群。拜城縣隸屬于新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇地區(qū)，位于天山中段南麓。地勢北高南低，由西北向東南傾斜。北以天山為界與伊犁地區(qū)昭蘇縣、特克斯縣接壤，南以卻勒塔克山與新和縣相連，東與庫車縣、和靜縣毗鄰，西以木扎提河與溫宿縣相望。縣內(nèi)野生動、植物品種繁多，主要分布在天山山區(qū)。和靜縣位于新疆中部，天山中段南麓，巴音郭楞蒙古自治州西北地區(qū)，焉耆盆地西北部，周邊與烏魯木齊市、庫爾勒市等17個縣市毗鄰。塔什庫爾干塔吉克自治縣位于帕米爾高原東部，喀喇昆侖山北部。東與葉城縣、莎車縣交界，北與阿克陶縣毗鄰，南、西分別與克什米爾（巴基斯坦實際控制區(qū)）、阿富汗、塔吉克斯坦接壤（邊境線長808km），平均海拔在4 000m 以上。昆侖山、喀喇昆侖山、興都庫什山和天山四大山脈在此處匯合，形成“世界屋脊”。阿合奇縣位于新疆維吾爾自治區(qū)西部的天山南脈腹地，阿合奇縣地處克孜勒蘇柯爾克孜自治州東北部。東鄰烏什縣，東南、南部分別與阿克蘇地區(qū)的柯坪縣、喀什地區(qū)的巴楚縣接壤，西南與阿圖什市毗連，北部、西部與吉爾吉斯斯坦交界，國界線長達(dá)286.7km。全縣地處高寒山區(qū)。這四個縣相間的距離300～1 300km。為進(jìn)一步揭示四個縣家雞間的遺傳距離，用微衛(wèi)星標(biāo)記的方法進(jìn)行遺傳多樣性的研究。本研究由GenBank選擇多態(tài)性較好的20對微衛(wèi)星引物，用STR 分型檢測天山南段存有的3個家雞和昆侖山脈的1個家雞中進(jìn)行遺傳變異的分析，并計算各品種之間的遺傳距離，以揭示其親緣關(guān)系及遺傳多態(tài)性，為品種選擇與保護(hù)、雜交育種等提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新疆天山南段的和靜縣、拜城縣、阿合奇縣及塔什庫爾干縣等偏遠(yuǎn)的山區(qū)鄉(xiāng)村中篩選典型的家雞203只（和靜家雞47只，拜城油雞49 只，阿合奇縣家雞58 只和塔什庫爾干縣家雞49 只）。用自帶EDTA 抗凝劑采血管，每只雞翅下靜脈采血2～3 mL，－70 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取 用艾德萊生物小量全血基因組DNA 快速提取試劑盒提取基因組DNA。提取的基因組DNA 經(jīng)紫外分光光度法檢測其純度和濃度，稀釋成50ng／μL 用于PCR 擴(kuò)增模板。

1.2.2 微衛(wèi)星引物合成及PCR 擴(kuò)增 選擇韓健林［1］等報道的20對微衛(wèi)星，其引物序列見表1。引物由北京閱微基因技術(shù)有限公司合成。PCR 擴(kuò)增體系15μL：包含模板DNA 50ng，10×PCR Buffer 1.5μL，上、下游引物（10μM）各1.5μL ，Taq酶（5U／μL）0.15μL，加ddH2O 補(bǔ)齊15μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃變性，30s，58℃退火30s，72 ℃延伸30s，35個循環(huán)，最后60 ℃延伸30 min。PCR 產(chǎn)物用1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。用純化試劑盒純化PCR 產(chǎn)物，取1.0μL 純化PCR產(chǎn)物，加入9μL分子量內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液（0.5∶8.5），95 ℃變性3min，用3730XL測序儀檢測條帶大小和數(shù)目，將檢測得到的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入到分析軟件中進(jìn)行分析。

表1 20對微衛(wèi)星（STR）DNA 標(biāo)記的引物信息Table 1 Primer information of the 20microsatellite（STR）DNA markers

1.2.3 統(tǒng)計分析 利用POPGEN 3.2（http：／／www.ualberta.ca／～fyeh）進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，計算微衛(wèi)星位點的等位基因頻率（Nf）、等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和Shannon多樣性指數(shù)（I）；利用Cervus 3.0軟件計算多態(tài)信息含量（PIC），PIC＜0.25為低度多態(tài)，0.25≤PIC＜0.50 為中度多態(tài)，PIC≥0.50為高度多態(tài)。利用POPGEN 3.2計算群體間的Nei＇s 遺傳距離，并基于該遺傳距離用PHYLIP 3.5軟件構(gòu)建UPGMA 系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星基因座的多態(tài)性分析

20個微衛(wèi)星位點觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon 多樣性指數(shù)（I）和多態(tài)信息指數(shù)（PIC），結(jié)果見表2。

表2 20個微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)特征Table 2 Characteristics of 20STRs in four Xinjiang indigenous chickens

由表2可知，四個家雞品種的平均觀測等位基因數(shù)為14.65，其中LEI0234 最多（Na＝28），MCW0037最少（Na＝7）；有效等位基因數(shù)平均值為4.7，最高為13.229（LEI0234），最低為2.178（MCW0248）；觀測雜合度平均值為0.593，最高為0.833，最低為0.455；期望雜合度平均值為0.757，最高為0.927，最低為0.542；Shannon多樣性指數(shù)平均值1.753，LEI0234 最高為（I＝2.801），MCW0248位點最低（I＝1.030）；多態(tài)信息含量介于0.487～0.920，平均值為0.723，除MCW0248位點PIC為0.487外，其它19個位點的PIC值均大于0.5，為高多態(tài)性位點。

2.2 群體遺傳距離及聚類分析

4個家雞品種群體遺傳多樣性如表3 所示。和靜黑雞的平均等位基因數(shù)最多（Na＝9.6）；阿合奇家雞的平均觀測雜合度最高（Ho＝0.652）；拜城油雞的平均期望雜合度、多態(tài)性息含量及Shannon 多樣性指數(shù)均為最高（He＝0.757；PIC＝0.722；I＝1.678）。塔什庫爾干家雞的各項指數(shù)在4個家雞品種中均最低（Na＝8.2；Ho＝0.517；He＝0.702；PIC＝0.663；I＝1.512）。四個家雞品種的PIC均超過了0.5（0.663－0.722），差異顯著（P＜0.05），表明4個不同品種的家雞群體內(nèi)部均具有較高的遺傳多樣性。

表3 四種新疆地方雞群體多樣性Table 3 Genetic diversity of four Xinjiang indigenous chickens

表4 四種雞的Nei氏遺傳距離和遺傳一致度Table 4 Nei＇s genetic distance and genetic identity

圖1 根據(jù)Nei氏遺傳距離的UPGMA 系統(tǒng)聚類圖Fig.1 UPGMA phylogenetic tree by Nei＇s genetic distance

AMOVA 分析顯示群體間遺傳差異不顯著（P＞0.05）。其中拜城縣家雞和阿合奇家雞群體間遺傳差異最小，塔什庫爾干雞與其它三個家雞群體之間的遺傳差異均大于拜城縣家雞（拜城油雞）、阿合奇家雞、和靜黑家雞之間的遺傳差異。運(yùn)用Nei氏遺傳距離構(gòu)建的UPGMA 系統(tǒng)聚類圖顯示，塔什庫爾干雞屬于一個單獨(dú)的分支（圖1），塔什庫爾干雞與其他群體的遺傳距離都較遠(yuǎn)，與其他群體的遺傳一致度較低，見表4。四個家雞群遺傳一致度大于0.8672，顯示出較高的遺傳一致度。從遺傳距離上來看，拜城油雞和阿奇雞的遺傳距離最近，為0.0807。其次拜城油雞和阿合奇家雞與靜黑雞近一些。塔什庫爾干家雞與其他三個家雞距離較遠(yuǎn)，分別為0.1412、0.1362、0.1425，結(jié)果符合各生態(tài)地理。

3 討論

本研究利用20 個微衛(wèi)星DNA 標(biāo)記對對新疆天山山脈南段的和靜縣、拜城縣、阿合奇縣和帕米爾高原的塔什庫爾干縣家雞的203 個樣本進(jìn)行分析。測定結(jié)果PIC為0.487～0.92，平均值0.72，表示20個微衛(wèi)星座位的多態(tài)性都較高。一般認(rèn)為，PIC值大于0.5時，認(rèn)為高度多態(tài)性；若多態(tài)信息指數(shù)介于0.25和0.5之間，為中度多態(tài)性；若PIC小于0.25，為低多態(tài)性。4個不同品種的家雞群體內(nèi)部均具有較高的遺傳多樣性，其中塔什庫爾干雞的雜合度和多態(tài)性最低，原因是塔什庫爾干地理環(huán)境比較特殊，惡劣的氣候環(huán)境和高原氣候其他外來品種很難適應(yīng)，與外界的基因交流較少，導(dǎo)致遺傳多樣性低。四個群體之間比較看，群體間遺傳差異不顯著，其中拜城縣家雞（拜城油雞）和阿合奇家雞的遺傳差異最低，塔什庫爾干雞與其它三個品種家雞之間的遺傳差異均大于拜城縣家雞（拜城油雞）、阿合奇家雞、和靜黑家雞之間的遺傳差異。塔什庫爾干雞在相對隔絕的條件下，逐漸演變?yōu)橐粋€較為獨(dú)立的品種。

拜城油雞和阿合奇雞的遺傳距離最近，為0.0807。而和靜黑雞與其他兩種雞的距離比塔什庫爾干雞近一些。在聚類圖中證明了這一點，塔什庫爾干家雞均聚于一個獨(dú)立的分支，從其地理分布來看，塔什庫爾干家雞離阿合奇縣直線距離800km以上，與拜城縣1 200km 以上，與和靜縣1 600km以上，地處高海拔（4 000m 以上）帕米爾高原，據(jù)取證調(diào)查塔什庫爾干家雞主要來自巴基斯坦、阿富汗和烏茲別克斯坦等國家，所以塔什庫爾干雞是在特殊的地理、歷史和氣候條件下孕育出的獨(dú)特地方雞種。拜城縣和阿合奇縣家雞出現(xiàn)在一個分支上的原因是地理位置比較近（直線距離300以上），都在天山脈，所以一個品種的可能性大。和靜縣家雞與拜城縣家雞和阿合奇縣家雞聚的分支比較近，因為和靜縣也處于天山脈，但和靜家雞受外來雞中的影響比較大，表型遺傳上也可以看出來。

4 結(jié)論

新疆天山南段的四種家雞間的微衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)果揭示了它們的遺傳距離，以前認(rèn)為拜城油雞只有拜城縣所有，但鄰近的阿合奇縣家雞遺傳距離與拜城油雞比較近，和靜縣家雞也屬于天山山脈家雞種，但和靜縣家雞被商業(yè)品種雞雜化后形成了現(xiàn)在的外貌及生產(chǎn)性能上有差別的新的培育品種，而塔什庫爾干縣家雞是獨(dú)立的一個新發(fā)現(xiàn)的地方品種，因此和靜縣家雞和塔什庫爾干縣家雞需要深一步研究、保護(hù)開發(fā)利用。

［1］吳常信.利用畜禽遺傳資源，為我國畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展做出新貢獻(xiàn)［C］∥家禽研究最新進(jìn)展：第十一次全國家禽學(xué)術(shù)討論會論文集.長春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，2003：3－6.

［2］常 洪.中國家畜遺傳資源的保存［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，1985（2）：1－9.

［3］吳常信.畜禽品種資源的保存與利用［C］∥全國畜禽品種資源保存與利用學(xué)術(shù)討論會資料.長春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，1987.

［4］王小霞，陸建國.新疆拜城油雞［J］.新疆畜牧業(yè)，1995（4）：42－43.

［5］格明古麗，許宗運(yùn)，吾買爾江·艾孜木，等.新疆拜城油雞［J］.中國家禽2003，1（21）：35－36.

［6］季維智，宿 兵.遺傳多樣性研究的原理與方法［M］.杭州：浙江科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

［7］曾盛誠，Gariba Danbaro，William Nano，等.利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記分析巴布亞新幾內(nèi)亞三個地方雞群體的遺傳多樣性及親緣關(guān)系［J］，畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2010，41（7）：797－803.

［8］邢文麗，王亞平，龍君江，等.利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析5 種地方家禽品種遺傳多樣性［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（1）：44－48.

［9］曲魯江，李顯耀，徐桂芳，等.利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析中國地方雞種的遺傳多樣性［J］.中國科學(xué)：C輯，2006，36（1）：17－26.

［10］Buchanan F C，Adams L J，Littlejohn R P，et al.Determination of evolutionary relationships among sheep breeds using microsatellites［J］.Genomics，1994，22：397－403.

［11］MacHugh E，Lofftus R T，Barley D G，et al.Microsatellite DNA variation within and among European cattle breeds［J］.Proc Roy Soc Biol Sci，1994，256：25－31.

［12］Weigend S，Hillel J，Groenen M A M，et al.Assessment of biodi－versity in a wide range of chicken breeds by genotyping DNApools for microsatellite loci［C］∥In Proc.of the 27th International Conference on Animal Genetics.Minneapolis，USA，2000：83.

［13］Romanov M N，Weigends S.Genetic diversity in chicken populations based on microsatellite markers［C］∥In Proc of the Conference“From Jay Lush to Genomics：Visions for Animal Breeding and Genetics”.Ames.Iowa，USA，1999：174.

［14］Hillel J，Groenen M A M，Tixier Boichard M，et al.Biodi－versityof 52chicken populations assessed by microsatellite typing of DNA pools［J］.Genet Sel Evol，2003，35：533－557.

［15］Zhang X，Leung F C，Chan D K，et al.Comparative analysis of allozyme，randomly amplified polymorphic DNA，and microsatellite polymorphism on Chinese native chickens［J］.Poult Sci，2002，81：1 093－1 098.

［16］Zhang X，Leung F C，Chan D K，et al.Genetic diversity of Chinese native chicken breeds based on protein polymorphism，randomly amplified polymorphic DNA，and microsatellite polymorphism［J］.Poult Sci，2002，81：1 463－1 472.

［17］屠云潔，陳寬維，沈見成，等.利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析四川8個地方雞品種遺傳多樣性［J］.遺傳，2005，27（5）：724－728.

［18］陳紅菊，岳永生，樊新忠，等.利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析山東地方雞品種的遺傳多樣性［J］.遺傳學(xué)報，2003，30（9）：855－860.

［19］Baker J S F.A global protocol for determining genetic distance among domestic livestock breeds［C］∥Proceedings of the 5th world congress on genetic applied to livestock production.1994：501－508.