產(chǎn)黃樟素內(nèi)生真菌交鏈孢霉LJX27的發(fā)酵條件優(yōu)化

徐 洲，尹禮國，張 超,*，魏 琴

產(chǎn)黃樟素內(nèi)生真菌交鏈孢霉LJX27的發(fā)酵條件優(yōu)化

徐 洲1,2，尹禮國1，張 超1,*，魏 琴2

（1.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 室，四川 宜賓 644000）

以巖桂內(nèi)生真菌交鏈孢霉（Alternaria）LJX27為研究對象，通過單因素試驗(yàn)研究各發(fā)酵工藝因素對黃樟素產(chǎn)量的影響，在此基礎(chǔ)上通過二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化黃樟素發(fā)酵工藝參數(shù)。結(jié)果表明：交鏈孢 霉LJX27在初始pH 8、發(fā)酵溫度 24 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、培養(yǎng)5 d的條件下，黃樟素產(chǎn)量最高，達(dá)2.13 g/L，比優(yōu)化前黃樟素的產(chǎn)量提高了67.72%。各因素對黃樟素產(chǎn)量的影響大小為初始pH值＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞轉(zhuǎn)速。該回歸模型可以用于優(yōu)化黃樟素的發(fā)酵條件。

二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)；巖桂；黃樟素；發(fā)酵條件

黃樟素又稱黃樟油素、黃樟腦，是合成胡椒基丁醚、洋茉莉醛、異丁香酚、香蘭素等系列產(chǎn)品的重要原料[1-2]，現(xiàn)已成為我國出口創(chuàng)匯的一種重要資源。由于以黃樟素為原料的市場需求量日益增加，其在國際貿(mào)易市場上長期處于供不應(yīng)求的局面，致使近年來樟屬類植物，特別是針對黃樟樹的砍伐盜挖問題日趨嚴(yán)峻。為了保護(hù)植被，避免對生態(tài)環(huán)境的進(jìn)一步破壞，各國先后制定限制刨取黃樟樹根的環(huán)境法規(guī)，巴西政府甚至嚴(yán)令禁止破壞黃樟樹的任何行為[2]。因此，在天然樟樹資源日趨枯竭的情況下，尋找一條替代天然樟屬植物產(chǎn)黃樟素的途徑已成為相關(guān)研究者的必然選擇。微生物因其具有繁殖速度快、發(fā)酵周期短、節(jié)能環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，而備受研究者青睞，國內(nèi)研究人員已經(jīng)開始利用油樟內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)黃樟素。

巖桂（Cinnamomum pauciflorum）是四川省宜賓市筠連縣、珙縣的一種特有的樟屬、樟科植物資源[3]，其中巖桂精油中黃樟素的比例高達(dá)90%～95%[4]。本課題組在前期研究工作中，從巖桂葉中分離得到了一株具有抑菌活性的交鏈孢霉屬（Alternaria）內(nèi)生真菌LJX27，該菌對灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）有較強(qiáng)的抑制作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LJX27能夠發(fā)酵產(chǎn)生一定量的黃樟素，但是在原有的實(shí)驗(yàn)條件下黃樟素的產(chǎn)量偏少、發(fā)酵條件苛刻，有必要繼續(xù)深入研究和改良其發(fā)酵條件。

二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)（quadratic general rotary unitized design）具有準(zhǔn)確性高、綜合性好、系統(tǒng)性強(qiáng)、信息量大等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)和科學(xué)實(shí)驗(yàn)[5-6]。為了提高交鏈孢霉 LJX27產(chǎn)黃樟素的量，本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上[7]，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，考察各因素對交鏈孢霉 LJX27 發(fā)酵產(chǎn)黃樟素的影響，確定各因素的最佳水平并建立數(shù)學(xué)模型，以期為深層次利用該菌株產(chǎn)黃樟素提供技術(shù)參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

經(jīng)18S rDNA序列分析技術(shù)鑒定為交鏈孢霉屬（Alternaria）的內(nèi)生真菌LJX27，分離純化于四川省宜賓市筠連縣的巖桂葉，菌種保藏于發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，發(fā)酵產(chǎn)黃樟素的量為1.27 g/L。

PDA固體培養(yǎng)基、葡萄糖硝酸銨液體培養(yǎng)基。

乙醚、鹽酸、磷酸二氫鉀、乙酸鈉、硝酸銨、硫酸鎂等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GC7890F氣相色譜儀 蘭州中科安泰分析科技有限責(zé)任公司；HZQ-QX搖床培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；AR2130電子天平 美國奧豪斯儀器有限公司；DHG-9145A恒溫干燥箱 上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸浮液制備

將在實(shí)驗(yàn)室保藏的菌種LJX27轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng) 72 h，隨后用無菌生理鹽水洗下PDA斜面培養(yǎng)基上的孢子，轉(zhuǎn)移到三角瓶中，用磁力攪拌器攪拌10 min，備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 發(fā)酵溫度對黃樟素產(chǎn)量的影響

在初始pH 6、轉(zhuǎn)速150 r/min、發(fā)酵時(shí)間5 d、接種量2%、裝液量100 mL條件下，測定不同發(fā)酵溫度（20、22、24、26、28 ℃）下黃樟素的產(chǎn)量。

1.3.2.2 接種量對黃樟素產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵溫度22 ℃、初始 pH 6、轉(zhuǎn)速150 r/ min、發(fā)酵時(shí)間5 d、裝液量100 mL條件下，測定不同接種量（1%、2%、3%、4%、5%）下黃樟素的產(chǎn)量。

1.3.2.3 發(fā)酵時(shí)間對黃樟素產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵溫度22 ℃、初始pH 6、接種量2%、轉(zhuǎn)速150 r/min、裝液量100 mL條件下，測定不同發(fā)酵時(shí)間（3、4、5、6、7 d）下黃樟素的產(chǎn)量。

1.3.2.4 初始pH值對黃樟素產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵溫度 22 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min、發(fā)酵時(shí)間5 d、接種量2%、裝液量100 mL條件下，測定不同初始pH值（4、5、6、7、8）[8]下黃樟素的產(chǎn)量。

1.3.2.5 轉(zhuǎn)速對黃樟素產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵溫度22 ℃、初始pH 6、發(fā)酵時(shí)間5 d、接種量2%、裝液量100 mL條件下，測定不同轉(zhuǎn)速（100、150、200、250、300 r/min）下黃樟素的產(chǎn)量。

1.3.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化發(fā)酵條件

在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，在初始pH值、發(fā)酵溫度[9]、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間和接種量5 個(gè)因素中選取4 個(gè)影響作用較大的因子，以黃樟素產(chǎn)量作為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化。

1.3.4 色譜條件

色譜柱為AE.SE-54（15 m×0.25 mm，0.33 μm），柱溫145 ℃，進(jìn)樣溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃，進(jìn)樣體積1 μL，定量方法為外標(biāo)峰高法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用DPS7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行方差分析、顯著性檢驗(yàn)[10]，使用Design Expert 7.1.3軟件進(jìn)行響應(yīng)面法交互效應(yīng)分析[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵溫度對黃樟素產(chǎn)量的影響

圖1 發(fā)酵溫度對菌株LJX27產(chǎn)黃樟素的影響Fig.1 Effect of fermentation tempe rature on the production of safrole

由圖1可知，溫度對黃樟素的產(chǎn)量有明顯影響。溫度太低不利于LJX27菌體的生長和代謝，溫度過高菌體易衰老而影響其代謝產(chǎn)物的積累。內(nèi)生真菌LJX27的臨界溫度為24 ℃，當(dāng)發(fā)酵溫度在20～24 ℃區(qū)間時(shí)，黃樟素產(chǎn)量隨溫度升高而增高，溫度達(dá)24 ℃時(shí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量達(dá)到最高，隨后產(chǎn)量隨溫度上升而降低。

2.1.2 接種量對黃樟素產(chǎn)量的影響

圖2 接種量對菌株LJX27產(chǎn)黃樟素的影響Fig.2 Effect of inoculum amount on the production of safrole

由圖2可知，不同接種量對黃樟素的產(chǎn)量具有較大的影響。接種量過少，菌體生長緩慢，產(chǎn)油量較低，隨著接種量的增加，黃樟素的量逐漸上升，當(dāng)接種量為4%時(shí)，黃樟素產(chǎn)量達(dá)到最高，為1.21 g/L。之后隨著接種量進(jìn)一步增大，黃樟素產(chǎn)量反而下降。這可能是由于發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)主要用于菌體細(xì)胞增殖，有大量的代謝廢物生產(chǎn)[12]，抑制了菌體的進(jìn)一步發(fā)酵產(chǎn)黃樟素。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對黃樟素產(chǎn)量的影響

圖3 發(fā)酵時(shí)間對菌株LJX27產(chǎn)黃樟素的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the production of safrole

由圖3可知，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，黃樟素的產(chǎn)量也隨之逐漸增加，第3天到第6天增長速率較大，第6天時(shí)黃樟素產(chǎn)量達(dá)到最大值，為1.18 g/L，之后增長率很小，可以忽略。

2.1.4 初始pH值對黃樟素產(chǎn)量的影響

圖4 初始pH值對菌株LJX27產(chǎn)黃樟素的影響Fig.4 Effect of initial medium pH on the production of safrole

由圖4可知，發(fā)酵環(huán)境初始pH值對菌株LJX27產(chǎn)黃樟素有較大的影響。每種微生物都有其生長的最適宜pH值，pH值過高或過低都會導(dǎo)致菌體生長受阻，其主要原因是pH值會引起細(xì)胞膜電位的變化，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[12]，進(jìn)而引起產(chǎn)代謝產(chǎn)物能力的下降。pH值為7時(shí)黃樟素產(chǎn)量達(dá)最大值，為1.28 g/L，pH值為8時(shí)產(chǎn)量下降，為1.26 g/L。

2.1.5 轉(zhuǎn)速對黃樟素產(chǎn)量的影響

圖5 轉(zhuǎn)速對菌株LJX27產(chǎn)黃樟素的影響Fig.5 Effect of shaking speed on the production of safrole

菌株LJX27發(fā)酵產(chǎn)黃樟素需要氧氣，培養(yǎng)過程中增大轉(zhuǎn)速會影響發(fā)酵液的通氣量，進(jìn)而增加培養(yǎng)基的溶氧水平[13]。由圖5可知，轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)黃樟素產(chǎn)量最大達(dá)1.13 g/L，轉(zhuǎn)速為 250 r/min時(shí)黃樟素產(chǎn)量基本保持不變，但繼續(xù)增大轉(zhuǎn)速，黃樟素的產(chǎn)量反而有所降低，可能是由于轉(zhuǎn)速增大的同時(shí)，剪切力也隨著增大，過大的剪切力會將菌絲切斷，影響了霉菌的生長與產(chǎn)酶[13]。

2.2 黃樟素發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 二次通用旋轉(zhuǎn)回歸組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，在考察的5 種影響因子中，接種量對菌株LJX27產(chǎn)黃樟素的影響最小，因此選取初始pH值（X1）、發(fā)酵溫度（X2）、轉(zhuǎn)速（X3）和發(fā)酵時(shí)間（X4）為自變量，以黃樟素產(chǎn)量為響應(yīng)指標(biāo)，利用DPS7.05進(jìn)行四因素五水平的二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化工藝參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 二次通用旋轉(zhuǎn)回歸組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果Table 1 Quadric general rotational composite design with experimental values of safrole production

續(xù)表1

2.2.2 模型建立與方差分析

表2 方差分析表Table 2 Analysis of variance for the experimental results of safrole production

采用DPS7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，計(jì)算各項(xiàng)回歸系數(shù)，得到黃樟素產(chǎn)量與4 個(gè)因素的數(shù)學(xué)回歸模型：

Y = 1.650 00+0.335 83 X1-0.045 00 X2-0.030 00 X3+ 0.117 50 X4-0.002 92 X12-0.120 42 X2

2-0.080 42 X3

2-0.067 92 X4

2+0.013 75 X1X2+0.018 75 X1X3-0.035 00 X1X4+ 0.075 00 X2X3-0.056 25 X2X4-0.053 75 X3X4（1）

由表2可知，發(fā)酵溫度、 轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間二次項(xiàng)偏回歸系數(shù)均達(dá)極顯著水平（P＜0.01），說明各個(gè)影響因素與響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。通過查F分布表得知，回歸方程的失擬檢驗(yàn)F= 6.972 31＞F0.05（11,6）=3.09差異顯著，而回歸方程的擬合檢驗(yàn)F=27.527 70＞F0.01（15,6）= 4.32極顯著，說明方程與實(shí)際情況擬 合良好，模型的預(yù)測值與實(shí)際值吻合較好，模型成立。

2.2.3 數(shù)學(xué)模型解析

2.2.3.1 主因子效應(yīng)分析

由回歸模型方程可知：一次項(xiàng)中的X1和X4的系數(shù)大于零，X2和X3的系數(shù)小于零。一次項(xiàng)系數(shù)絕對值大小反映了該因素對產(chǎn)量影響程度的強(qiáng)弱[14-15]，對模型進(jìn)行主效應(yīng)分析，得到各個(gè)因素對菌株LJX27產(chǎn)黃樟素的影響大小次序?yàn)椋撼跏紁H值＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞轉(zhuǎn)速。

2.2.3.2 單因子效應(yīng)分析

將4 個(gè)因素中的其中3 個(gè)固定在0水平，對數(shù)學(xué)模型進(jìn)行降維分析，得到以其中1 個(gè)因素為決策變量的偏回歸模型：

上述4 個(gè)方程中，二次項(xiàng)的系數(shù)均為負(fù)值，說明其表征的拋物線都開口向下，因此，4 個(gè)因素取值均存在最佳值，過大或過小均會使響應(yīng)值降低[5]。

2.2.3.3 響應(yīng)面圖及等高線圖分析

對模型的方差分析表明，交互項(xiàng)中僅有因素X2X3對黃樟素產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01），而其他交互項(xiàng)均未達(dá)到極顯著水平。由于二次項(xiàng)系數(shù)之間具有相關(guān)性，因此這些微弱的交互項(xiàng)，原則上不能刪除[16]。因而在其他因素條件固定不變的情況下，只需要探討X2（發(fā)酵溫度）與X3（轉(zhuǎn)速）交互作用對菌株LJX27產(chǎn)黃樟素的影響，采用Design Expert 7.1.3對模型進(jìn)行降維分析[17]。

等高線的形狀可以反映因素間交互作用的大小，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著[18-19]。由圖6可知，發(fā)酵溫度與轉(zhuǎn)速存在一定的交互作用[20]。當(dāng)發(fā)酵溫度一定時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的增加，黃樟素產(chǎn)量先升高后降低，在200 r/min達(dá)到最大值；當(dāng)轉(zhuǎn)速一定時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的增加，黃樟素產(chǎn)量也是先升高后降低，在24 ℃時(shí)達(dá)到最大值。

通過Design Expert 7.1.3軟件分析，得到內(nèi)生真菌LJX27產(chǎn)黃樟素的最佳發(fā)酵條件為：初始pH 8、發(fā)酵溫度24 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、發(fā)酵時(shí)間5 d，得到黃樟素最大產(chǎn)量為2.13 g/L。為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可靠性，在最佳發(fā)酵條件下，進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到產(chǎn)黃樟油素產(chǎn)量為2.24 g/L，實(shí)際值與模型最優(yōu)值的比值為1.06（＞1），說明本實(shí)驗(yàn)獲得的二次通用旋轉(zhuǎn)組合的最佳模型是可靠的。

圖6 發(fā)酵溫度與轉(zhuǎn)速交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the interactive effect of fermentation temperature and shaking speed on the production of safrole

3 結(jié)論與討論

本研究通過單因素試驗(yàn)篩選出對黃樟素發(fā)酵影響較大的4 個(gè)因素，并對這4 個(gè)因素進(jìn)行了二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)優(yōu)化，獲得內(nèi)生真菌 LJX27發(fā)酵產(chǎn)黃樟素的最佳條件為初始pH 8、發(fā)酵溫度24 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、發(fā)酵時(shí)間5 d，在此條件下黃樟素產(chǎn)量達(dá) 2.13 g/L，比優(yōu)化前黃樟素的產(chǎn)量提高了67.72%。各因素對黃樟素產(chǎn)量的影響大小依次為：初始pH值＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞轉(zhuǎn)速；響應(yīng)面試驗(yàn)得出發(fā)酵溫度與轉(zhuǎn)速有一定的交互作用。試驗(yàn)所建立的回歸模型經(jīng)顯著性檢驗(yàn)達(dá)到顯著水平，說明該模型用于內(nèi)生真菌 LJX27產(chǎn)黃樟素發(fā)酵條件的優(yōu)化是可行的。

在檢測方法上，本研究采用的是氣相色譜法，以黃樟素標(biāo)準(zhǔn)樣品比對進(jìn)行檢測。由于內(nèi)生真菌發(fā)酵液中的成分復(fù)雜，其極性也各不相同，測定值可能存在一定的誤差，可以采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法做進(jìn)一步檢測和驗(yàn)證。以黃樟素為原料的市場需求量較大，四川省宜賓市的巖桂資源優(yōu)勢突出，本研究結(jié)果能夠?yàn)閹r桂內(nèi)生真菌 LJX27進(jìn)一步放大培養(yǎng)產(chǎn)黃樟素提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，可以結(jié)合地方特色巖桂產(chǎn)業(yè)進(jìn)行更深入的研究和應(yīng)用。

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Optimization of Fermentation Conditions of Alternaria LJX27 for Safrole Production

XU Zhou1,2, YIN Li-guo1, ZHANG Chao1,*, WEI Qin2
(1. College of Life Science and Food Engineering, Yi Bin University, Yibin 644000, China; 2. Key Laboratory of Fermentation Resource and Application o f Institutes of Higher Learning in Sichuan Province, Yibin 644000, China)

The objective of this study was to optimize fermentation conditions of Alternaria LJX27 (an endophytic fungus from Cinnamomum paucifl orum) for enhanced production of safrole by response surface methodology with quadratic general rotary composite design. The production of safrole was investigated with respect to fermentation conditions including inoculum amount, pH, fermentation temperature, fermentation time and shaking speed. Fermentation experiments performed under the optimal conditions: medium pH 8; temperature, 24 ℃; shaking speed, 200 r/min; and incubation time, 5 d; resulted in maximum production of 2.13 g/L, which was 67.72% higher than that obtained before optimization. Safrole production was affected in decreasing order by initial medium pH, fermentation time, fermentation temperature and shaking speed. Our investigations indicated that the developed regression model was applicable for optimizing the fermentation conditions for safrole production.

quadratic general rotary composite design; Cinnamomum paucifl orum; safrole; fermentation condition

TS201.3

A

1002-6630（2014）17-0165-05

10.7506/spkx1002-6630-201417032

2014-05-30

四川省科技廳應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目（2009JY0057）；宜賓學(xué)院科研啟動經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（2009Q27）；四川省高?？蒲袆?chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)資助項(xiàng)目（14TD0031）

徐洲（1984—），男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：zhxu23@126.com

*通信作者：張超（1966—），男，教授，博士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：chzh6122@126.com