保加利亞乳桿菌對(duì)絞股藍(lán)皂苷Gypenoside XLⅥ的微生物轉(zhuǎn)化

劉慧敏，高雅軍，曾 鳴，樸香蘭,*

保加利亞乳桿菌對(duì)絞股藍(lán)皂苷Gypenoside XLⅥ的微生物轉(zhuǎn)化

劉慧敏1，高雅軍2，曾 鳴1，樸香蘭1,*

（1.中央民族大學(xué) 中國(guó)少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081；2.北京海淀婦幼保健院乳腺病防治中心，北京 100080）

目的：分析絞股藍(lán)皂苷Gypenoside ⅩLⅥ的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。方法：利用益生菌德氏乳桿菌保加利亞亞種的脫脂牛奶培養(yǎng)基對(duì)Gypenoside ⅩLⅥ進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，并利用液相色譜離子阱飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜方法鑒定Gypenoside ⅩLⅥ的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。結(jié)果：Gypenoside ⅩLⅥ的微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為絞股藍(lán)皂苷Gypenoside L、Gypenoside LI、Damulin B 和Damulin A。結(jié)論：通過微生物轉(zhuǎn)化方法可以獲得更多天然產(chǎn)物活性成分。

微生物轉(zhuǎn)化；絞股藍(lán)；gypenoside ⅩLⅥ；德氏乳桿菌保加利亞亞種

生物轉(zhuǎn)化（biotransformation）是替代天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)修飾的一種方法。它具有很高的區(qū)域選擇性、立體選擇性和基團(tuán)選擇性，可以完成一些化學(xué)方法難以進(jìn)行的反應(yīng)[1-3]。保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）是產(chǎn)乳酸的細(xì)菌，常用于制作酸奶、發(fā)酵食品、飲料和飼料。此外，某些保加利亞乳桿菌與其他一些菌種被認(rèn)為是促進(jìn)健康的，使乳蛋白產(chǎn)生具有生物活性的有利的肽類成分而被廣泛銷售。保加利亞乳桿菌非常適合于大規(guī)模的生產(chǎn)。此菌種適應(yīng)不同的培養(yǎng)環(huán)境，對(duì)熱、冷和酸性條件均表現(xiàn)出高耐受性。

絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum），屬于葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物，在亞洲被用來(lái)作為民間醫(yī)藥，多分布于亞熱帶和北亞熱帶地區(qū)。我國(guó)絞股藍(lán)資源極為豐富，在陜西、湖北、浙江、江蘇、山東等省有栽培。它含有皂苷類[4]、黃酮類[5]、多糖類[6]、維生素、氨基酸[7]等成分，因含有大量的達(dá)瑪烷型皂苷[8]，絞股藍(lán)在中國(guó)被稱為“南方人參”。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有增強(qiáng)免疫力、抗高血脂、降血糖、調(diào)節(jié)肝功能和抑制腫瘤等作用[5,8-11]。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)中的絞股藍(lán)皂苷Gypenoside L、Gypenoside LI、Damulin A和Damulin B對(duì)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）A549細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用[12]，但其含量甚微。

本研究利用絞股藍(lán)中的主成分絞股藍(lán)皂苷Gypenoside ⅩLⅥ作為底物，通過德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）發(fā)酵方法獲得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，運(yùn)用液相色譜離子阱飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography ion trap/time of flight mass，LCMS-IT-TOF）鑒定其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum） 同仁堂藥店（北京），并設(shè)樣品號(hào)（GP2011-01）；絞股藍(lán)皂苷Gypenoside L、Gypenoside LI、Damulin A、Damulin B及Gypenoside ⅩLⅥ 本實(shí)驗(yàn)室前期分離得到；德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus） 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心提供，其CICC編號(hào)為6047；食用脫脂奶粉 黑龍江省完達(dá)山乳業(yè)有限公司。

乙腈（色譜純） 美國(guó)Grace公司；NW Ultra-pure Water System超純水 Heal Force公司；其余化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜離子阱飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有LC-20AD泵、SPD-M20A紫外檢測(cè)器、CBM-20A控制器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10AS vp控溫箱及LC solution軟件） 日本Shimadzu公司；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；ZHWY-211C培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；分析柱Shim-pack VP-ODS（150 mm × 2.0 mm，5 μm）日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 絞股藍(lán)皂苷Gypenoside ⅩLⅥ的分離、鑒定

絞股藍(lán)葉（10 kg）用80%乙醇提取3 次，每次3 h。乙醇提取物用石油醚、二氯甲烷、水飽和正丁醇進(jìn)行萃取。利用硅膠柱色譜方法，以二氯甲烷-甲醇作為洗脫液（10∶1～1∶1），對(duì)正丁醇萃取物進(jìn)行分離，得到10 個(gè)組分。利用Shim-pack PREP-ODS（H）.KIT半制備柱（250 mm × 20 mm，5 μm），以乙腈-水（40∶60，V/V）為洗脫液，以10 mL/min流速對(duì)組分5進(jìn)行分離，得到Gypenoside ⅩLⅥ（150 mg）。其結(jié)構(gòu)通過紫外（ultraviolet，UV）、質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）及核磁共振譜（nuclear magnetic resonance，NMR）等波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)比，被鑒定為絞股藍(lán)皂苷Gypenoside ⅩLⅥ[13]，純度大于98%。

1.3.2 菌種的活化與生物轉(zhuǎn)化

生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)是在脫脂牛奶培養(yǎng)基中進(jìn)行。培養(yǎng)基配制方法如下：脫脂奶粉（120 g）用水稀釋至1 L，使用前培養(yǎng)基在113 ℃滅菌20 min。

絞股藍(lán)皂苷Gypenoside ⅩLⅥ的生物轉(zhuǎn)化如下：德氏乳桿菌保加利亞亞種接種于含5 mL脫脂牛奶培養(yǎng)基的15 mL試管中，于43 ℃孵育1 d。取500 μL的上述乳桿菌培養(yǎng)基于含有100 mL脫脂牛奶培養(yǎng)基的250 mL的三角燒瓶中，43 ℃孵育1～2 d。加入1 mg/mL的GypenosideⅩLⅥ水溶液2 mL。持續(xù)發(fā)酵6 d后，收集培養(yǎng)液。

培養(yǎng)液用等體積的水飽和正丁醇進(jìn)行萃取，共萃取3 次。所得有機(jī)溶劑在45 ℃減壓濃縮得到殘留物。殘留物中加入2 mL的甲醇，用0.22 μm的濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中，加蓋保存在4 ℃冰箱中，待測(cè)LCMS-IT-TOF。

1.3.3 液相色譜離子阱飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析

色譜條件：色譜柱：Shimadzu Shim-pack VP-ODS column（150 mm × 2.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相為水（A）-乙腈（B）（0～30 min，30%～70% B）；流速：0.2 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：離子源：ESI負(fù)離子掃描；掃描范圍：m/z 200～1 500；加熱模塊溫度：200℃；CDL溫度：200 ℃；霧化氣流速：1.5 L/min；干燥氣體壓力：103.0 kPa；IT真空度：1.8e-2Pa，TOF真空度：1.9e-4Pa，離子源電壓：負(fù)離子模式-3.5 kV；檢測(cè)器電壓：1.57 kV。在負(fù)離子m/z 961～962、799～800和781～782的多離子色譜（multi ion chromatography，MIC）中進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜離子阱飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析

圖1 德氏乳桿菌保加利亞亞種（A）與絞股藍(lán)皂苷Gypenoside ⅩLⅥ（1）發(fā)酵前（B）后（C）的正丁醇萃取物的多離子色譜Fig.1 Multi-ion chromatogram of butanol extracts of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus cells (A) and gypenoside ⅩLⅥL before (B) and after (C) microbial transformation by LC-MS

在牛奶培養(yǎng)基中利用ⅩLⅥ德氏乳桿菌保加利亞亞種進(jìn)行Gypenoside的微生物轉(zhuǎn)化，用正丁醇萃取其微生物轉(zhuǎn)化的發(fā)酵液，可除去蛋白質(zhì)等部分雜質(zhì)。但由于其他雜質(zhì)的干擾，本實(shí)驗(yàn)選用負(fù)離子m/z 961～962、799～800、781～782的MIC進(jìn)行分析。圖1顯示絞股藍(lán)通過德氏乳桿菌保加利亞亞種的發(fā)酵前后的正丁醇萃取物的多離子色譜。出現(xiàn)在9.2 min的絞股藍(lán)皂苷GypenosideⅩLⅥ經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后在15.7、16.2、20.6、21.2 min的保留時(shí)間處出現(xiàn)新峰2、3、4、5。結(jié)果表明，絞股藍(lán)皂苷Gypenoside ⅩLⅥ可被德氏乳桿菌保加利亞亞種生物轉(zhuǎn)化。

2.2 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

圖2 絞股藍(lán)皂苷Gypenoside ⅩLⅥ被德氏乳桿菌保加利亞亞種生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的質(zhì)譜Fig.2 Mass spectra of microbial transformation products from gypenoside ⅩLⅥL

由圖2可知，在負(fù)離子模式ESI-MS中，峰1顯示m/z 961.5392[M-H]-（圖2A），峰2顯示m/z 799.4852 [M-H]-（圖2B），峰3顯示m/z 799.4848[M-H]-（圖2C），峰4顯示m/z 781.4729 [M-H]-（圖2D），峰5顯示m/z 781.4742 [M-H]-（圖2E），通過從絞股藍(lán)熱處理產(chǎn)物中分離得到的對(duì)照品Gypenoside L、Gypenoside LI、Damulin B、Damulin A[12]比對(duì)，4 個(gè)生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物被鑒定為Gypenoside L、Gypenoside LI、Damulin B和Damulin A。

3 結(jié) 論

皂苷類化合物是以C30骨架作為母核的糖苷，廣泛存在于植物界中。根據(jù)碳骨架不同可分為三萜皂苷和甾體皂苷[14]。其中，三萜皂苷主要存在于五加科、豆科、遠(yuǎn)志科和葫蘆科，甾體皂苷主要存在于薯蕷科、百合科和玄參科。此外，海星、海參等海洋生物中也存在皂苷類化合物。皂苷類成分具有復(fù)雜的物理化學(xué)性質(zhì)（如具有發(fā)泡和乳化作用），因而也具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗炎、抗微生物、抗糖尿病、抗氧化、免疫促進(jìn)以及心血管和神經(jīng)保護(hù)等作用[15-20]。前期研究表明，熱處理絞股藍(lán)產(chǎn)物中分離得到的絞股藍(lán)皂苷Gypenoside L、Gypenoside LI、Damulin A和Damulin B具有較強(qiáng)的抑制非小細(xì)胞肺癌增殖作用[12]。但這4 個(gè)化合物在絞股藍(lán)原植物中含量甚微。如何提高植物中有效成分的含量是本實(shí)驗(yàn)的主要目的。

利用微生物對(duì)有機(jī)化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化是獲得化學(xué)合成方法難以得到的新類型結(jié)構(gòu)的有效方法之一，微生物對(duì)三萜類化合物的區(qū)域選擇性和立體選擇性轉(zhuǎn)化已被廣泛研究[21-22]。因?yàn)槲⑸锏拇x產(chǎn)物和哺乳動(dòng)物的代謝物的相似性，最近，微生物轉(zhuǎn)換可用于預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物中的代謝途徑。已報(bào)道[23]微生物可成功地用于預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物的藥物代謝物的體外模型。

在本研究中，通過乳桿菌保加利亞亞種的牛奶培養(yǎng)基對(duì)絞股藍(lán)皂苷Gypenoside ⅩLⅥ進(jìn)行發(fā)酵，使其轉(zhuǎn)化成C20位脫糖基的絞股藍(lán)皂苷Gypenoside L、Gypenoside LI和進(jìn)一步C20（21）、C20（22）脫水的Damulin B和Damulin A。因此，微生物轉(zhuǎn)化是從天然產(chǎn)物中獲得有效成分的方法之一，通過微生物轉(zhuǎn)化方法可以獲得更多的有效成分。

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Microbial Transformation of Gypenoside ⅩLⅥ by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

LIU Hui-min1, GAO Ya-jun2, ZENG Ming1, PIAO Xiang-lan1,*
(1. Institute of Chinese Minority Traditional Medicine, Minzu University of China, Beijing 100081, China; 2. Mazopathy Prevention and Cure Center, Haidian Maternal and Child Health Hospital, Beijing 100080, China)

Objective: This study aimed to analyze the microbial transformation products of gypenoside ⅩLⅥ. Methods: Gypenoside ⅩLⅥ was transformed by the probiotics Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus grown in skim milk medium. The transformation products were identified by high performance liquid chromatography-ion trap time of flight (LCMS-IT-TOF) mass spectrometry. Results: The products were identified as gypenoside L, gypenoside LI, damulin B and damulin A. Conclusion: More bioactive constituents from the natural product may be obtained by microbial transformation.

microbial transformation; Gynostemma pentaphyllum; gypenoside ⅩLⅥ; Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

Q939.117

A

1002-6630（2014）17-0133-04

10.7506/spkx1002-6630-201417027

2013-08-17

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81274186）

劉慧敏（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸镛D(zhuǎn)化。E-mail：huiminliu@yeah.net

*通信作者：樸香蘭（1965—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。E-mail：xlpiao@163.com