液相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測定吳茱萸水提物中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量

鄢良春李 波，2華 樺廖 利趙軍寧

（1四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，成都，610041；2四川省郫縣人民醫(yī)院，郫縣，611730）

液相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測定吳茱萸水提物中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量

鄢良春1李 波1，2華 樺1廖 利1趙軍寧1

（1四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，成都，610041；2四川省郫縣人民醫(yī)院，郫縣，611730）

目的：建立同時(shí)測定吳茱萸水提物中吳茱萸堿（Evodiamine，EVO）和吳茱萸次堿（Rutaecarpine，RUT）的LC／MS方法。方法：液相色譜采用Welch Materials Xtimate-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3μm），以甲醇-10 mmol／L乙酸銨水溶液（85∶15）為流動相，流速0.2 mL／min，柱溫30℃。質(zhì)譜采用正離子全掃描模式，m／z：0～1000，電噴霧離子化源（ESI）。霧化氣為氮?dú)?，霧化壓力為40 psi；噴霧電壓4000 V，源溫度為100℃；去溶劑氣為氮?dú)?，溫?50℃，流速為10 L／min。結(jié)果：吳茱萸堿在2.02～504 ng／mL（r＝0.9992），吳茱萸次堿在1.97～493.33 ng／mL（r＝0.9999）線性關(guān)系良好，回收率分別為87.8%～97.04%和86.35%～98.22%，日內(nèi)、日間精密度均＜10%。結(jié)論：該方法簡便、可靠、靈敏度高，可用于同時(shí)測定吳茱萸水提物中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量及藥代動力學(xué)研究。

吳茱萸水提物；吳茱萸堿；吳茱萸次堿；液相色譜-質(zhì)譜

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa（Juss）Benth，石虎Evodia rutaecarpa（Juss）Benth var officinalis（Dode）Huang或疏毛吳茱萸Evodia rutaecarpa（Juss）Benth.Var bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果實(shí)。吳茱萸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，能溫中散寒、疏肝止痛，用于厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉、高血壓、外治口瘡等[1]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對吳茱萸的化學(xué)成分進(jìn)行深入研究，主要集中在吳茱萸堿（Evodiamine，EVO）、吳茱萸次堿（Rutaecarpine，RUT）、檸檬苦素等單體成分的研究[2-4]。吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量測定方法一般為HPLC法及液相色譜-紫外檢測法等，多只測定吳茱萸中的單一成分。

中醫(yī)臨床運(yùn)用中，吳茱萸多以復(fù)方水煎為主。前期本研究室對吳茱萸的毒性情況做了比較系統(tǒng)研究，結(jié)果表明吳茱萸提取物對大鼠、小鼠均具有一定的毒性作用[5-7]。本研究擬建立一種同時(shí)測定吳茱萸水提物中吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量的液相色譜-質(zhì)譜法（LC／MS），為進(jìn)一步研究吳茱萸毒性及其藥代動力學(xué)特征奠定基礎(chǔ)[8-9]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 受試藥物 吳茱萸由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院資源與種植研究所舒光明研究員于重慶紅廟村實(shí)地采集并鑒定，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院易進(jìn)海研究員提供水提取物樣品。

1.2 主要試劑 吳茱萸堿對照品、吳茱萸次堿對照品（成都曼思特生物科技有限公司，純度均≥98%）；卡馬西平對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（PAA）；非必需氨基酸（Sigma）。

1.3 主要儀器 美國Agilent 1200 RRLC-6410 triple quadrupole液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，配有G1312B二元泵、G1322B真空脫氣機(jī)、G1329B自動進(jìn)樣器和G1316B柱溫箱，使用MassHunter軟件控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理；超純水系統(tǒng)（Millipore）；CP-225D型精密電子天平（Sartorius），F(xiàn)D-ID-50冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；XW-80A漩渦混旋儀（上海青浦滬西儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 Welch Materials Xtimate-C18，（2.1 mm×150 mm，3μm）；流動相：甲醇-10 mmol／L乙酸銨水溶液（85：15）；流速：0.2 mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子化源（ESI），正離子模式，噴霧電壓4000 V，源溫度為100℃；霧化氣為氮?dú)?，霧化壓力為40 psi；去溶劑氣為氮?dú)?，溫?50℃，流速為10 L／min；碰撞氣為高純氮?dú)?，壓力?.1 MPa；采用MRM模式對藥物檢測，質(zhì)譜條件如下。

表1 吳茱萸水提物中吳茱萸堿和吳茱萸次堿LC／MS法測定條件

2.3 受試樣品吳茱萸水提取物的制備 取吳茱萸藥材，加水煎煮2次，每次加水10倍，第1次煎煮2 h，第2次煎煮1.5 h，合并煎液，濾過、濃縮冷凍干燥，即得。每克藥粉含原生藥3.44 g。用DMEM-10培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，1%非必需氨基酸的DMEM高糖培養(yǎng)液）配成不同濃度溶液，0.22μm過濾器過濾備用。

2.4 樣品預(yù)處理 微量加樣器精密吸取待測樣品600 μL置1.5 mL離心管中，加入804 ng／mL卡馬西平40 μL，冷凍干燥后，加入600μL甲醇溶解，渦旋混勻1 min，12 000 r／min離心10 min，0.22μm微孔濾膜過濾，取上清液10μL進(jìn)樣測定。

2.5 混合對照品溶液的配制 精密稱取吳茱萸堿（EVO）對照品和吳茱萸次堿（RUT）對照品適量，用DMEM-10培養(yǎng)液配制成終濃度分別為504 ng／mL（EVO），493.33 ng／mL（RUT）的對照品混合溶液。作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。4℃冰箱保存。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 方法專屬性 取空白DMEM-10溶液、空白DMEM-10溶液加內(nèi)標(biāo)卡馬西平、空白DMEM-10溶液加EVO、RUT和內(nèi)標(biāo)卡馬西平混合物、吳茱萸水提取物DMEM-10溶液，分別經(jīng)LC／MS檢測后，記錄色譜圖，考察其專屬性。

2.6.2 線性關(guān)系考察 取空白DMEM-10溶液600 μL，精密加入濃度為804 ng／m L卡馬西平40μL，配成EVO終濃度為2.016、20.16、50.40、100.80、201.60、504 ng／mL，RUT終濃度為1.97、19.73、49.33、98.67、197.33、493.33 ng／mL的混合對照品溶液。按2.4項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣10μL經(jīng)LC／MS測定。記錄峰面積。

2.6.3 精密度實(shí)驗(yàn) 在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)取空白DMEM-10溶液，配制EVO、RUT高、中、低3個(gè)不同濃度的樣品，按2.4項(xiàng)下方法處理樣品，在1 d內(nèi)分別測定5份樣品，計(jì)算日內(nèi)精密度；每天各測定1份樣品，連測5 d，計(jì)算日間精密度。

2.6.4 回收率實(shí)驗(yàn) 配制EVO、RUT高、中、低3個(gè)濃度樣品，記錄峰面積，計(jì)算其回收率。

2.6.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)用空白DMEM-10溶液配制高、中、低，的EVO、RUT混標(biāo)溶液，按2.4項(xiàng)下方法操作，分別在冷凍后0，1，2，11和14 d，進(jìn)行LC／MS含量測定，計(jì)算RSD%。

2.6.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取受試樣品按2.4項(xiàng)下方法操作，測定吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量，進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。2.7 吳茱萸水提取物樣品吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量測定 按2.3項(xiàng)下制備受試樣品3份，按2.4項(xiàng)下制備成受試樣品溶液，進(jìn)樣10μL，測定吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察結(jié)果

3.1.1 方法專屬性 如圖1-圖4所示，在該實(shí)驗(yàn)條件下采用MRM模式對藥物檢測，吳茱萸堿、吳茱萸次堿和卡馬西平保留時(shí)間分別為3.1min、2.3min和4.0 min。結(jié)果表明：空白DMEM-10培養(yǎng)液不干擾吳茱萸堿、吳茱萸次堿的測定。（圖1：空白DMEM-10培養(yǎng)液MRM色譜圖，圖2：空白DMEM-10培養(yǎng)液加內(nèi)標(biāo)卡馬西平MRM色譜圖；圖3：吳茱萸堿、吳茱萸次堿和內(nèi)標(biāo)卡馬西平混合物MRM色譜圖；圖4：吳茱萸水提物DMEM-10溶液MRM色譜圖）

圖1 空白DMEM-10培養(yǎng)液MRM色譜圖

圖2 空白DMEM-10培養(yǎng)液加內(nèi)標(biāo)卡馬西平MRM色譜圖

圖3 吳茱萸堿、吳茱萸次堿和內(nèi)標(biāo)卡馬西平混合物MRM色譜圖

圖4 吳茱萸水提物DMEM-10溶液MRM色譜圖

3.1.2 線性關(guān)系考察 以樣品濃度（C）為橫坐標(biāo)，樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得到回歸方程：Y吳茱萸堿＝0.0098x+0.0096（r＝0.9992），Y吳茱萸次堿＝0.0073x-0.03（r＝0.9999）。表明吳茱萸堿在2.02～504 ng／mL，吳茱萸次堿在1.97～493.33 ng／m L線性關(guān)系良好。

3.1.3 精密度實(shí)驗(yàn) 高、中、低濃度生物樣品日內(nèi)、日間峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比RSD＜10%，精密度良好，結(jié)果見表2。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.4 回收率實(shí)驗(yàn) 高、中、低濃度生物樣品回收率大于85%，滿足生物樣品分析檢測的要求，結(jié)果見表3。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

3.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 生物樣品中各成分在-20℃冰箱保存14 d，測定混合對照品和內(nèi)標(biāo)物的峰面積。各濃度樣品測定值的RSD均小于7.0%，說明在低溫條件下，14 d內(nèi)各成分的穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 重復(fù)性考察結(jié)果顯示，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的RSD均小于5%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

3.2 受試樣品中吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量測定結(jié)果顯示，800μg／mL的吳茱萸水提物中吳茱萸堿（EVO）的含量為（36.86±0.30）μg／mL、吳茱萸次堿（RUT）為（41.08±0.29）μg／m L。結(jié)果見表5。

表5 含量測定結(jié)果

4 討論

吳茱萸是常用溫理藥，本草記載吳茱萸生品有小毒，但其臨床應(yīng)用廣泛，含有多種活性成分，具有多種藥理作用，尤以在心血管系統(tǒng)方面作用的研究進(jìn)展迅猛。關(guān)于吳茱萸中主要活性成分如吳茱萸堿、吳茱萸次堿等的研究已經(jīng)深入到分子和基因水平。中藥成分復(fù)雜、含量微少，一般的分離儀器與測定方法難以對中藥成分進(jìn)行分離和檢測。

本研究建立同時(shí)測定吳茱萸水提物中吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量的LC／MS法，操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好，樣品專屬性、分離度、精密度、回收率等均符合生物樣品檢測的相關(guān)要求。且檢測樣品用量少，樣品預(yù)處理方法簡便，與液液萃取、固相萃取和直接蛋白沉淀等樣品處理方法相比，該方法具有待測成分損失較小，不受雜質(zhì)干擾等優(yōu)點(diǎn)，特別適合大批量樣品分析測定及吳茱萸體內(nèi)、體外藥代動力學(xué)研究。LC／MS法與液相色譜法、紫外檢測法等分析方法相比，具有更高的靈敏度。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，LC／MS法將在中藥材及中成藥制劑化學(xué)成分的定量分析中具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：160.

[2]欒連軍，裘國麗，程翼宇.吳茱萸堿和吳茱萸次堿在家兔體內(nèi)的藥動學(xué)研究[J].中國藥學(xué)雜志，2006，41（1）：48-50.

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（2014-01-06收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng)）

Simultaneous Determination of Evodiamine and Rutaecarpine in Water extracts of Evodia rutaecarpa by LC-MS

Yan Liangchun1，Li Bo1，2，Hua hua1，Liao Li1，Zhao Junning1
（1 Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China；2 Pixian People＇s Hospital，Pixian 611730，China）

Objective：To establish a LC-MS method for the simultaneous determination of evodiamine and tutaecarpine in water extracts of Evodia rutaecarpaMethods：A Welch Materials Xtimate-C18（2.1mm×150mm，3μm）was used.The mobile phase consisting of a mixture of methanol and 10 mmol／L ammonium acetate（85：15）was delivered at a flow-rate of0.2 mL／min.The column temperature was maintained at 30℃.The mass spectrometer was operated under the positive ion mode.Atomization pressure（N2）was40 psi，voltage was 4000v and temperature was100℃.The drying gas（N2）flow was10 L／min，the drying gas temperature was 350℃.Results：The linear ranges were 2.02～504 ng／mL（r＝0.9992）and 1.97～493.33 ng／mL（r＝0.9999）for evodiamine and rutaecarpine.The method extraction recoveries of evodiamine and rutaecarpine were 87.8%～97.04%and 86.35%～98.22%respectively.The intra and inter-day RSD were also lower than 10%.Conclusion：The method is simple，reliable and sensitive.It can be used for the pharmacokinetics research of water extracts of Evodia rutaecarpa.

Water extracts of Evodia rutaecarpa；Evodiamine；Rutaecarpine；LC-MS

R284.2

A

10.3969／j.issn.1673-7202.2014.02.004

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目（編號：2011ZX09401-304-（4-1））；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（編號：2009CB522801）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號：81073047）

鄢良春，碩士，副研究員，E-mail：yanlc9722＠163.com

趙軍寧，男，研究員，博士生導(dǎo)師，電話：（028）85226120，E-mail：zarmy＠189.cn