基于Microtox技術(shù)（微毒測(cè)試）的中藥綜合毒性快速評(píng)價(jià)

趙軍寧 鄢良春

（四川省中醫(yī)藥科學(xué)院藥理毒理研究所，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評(píng)價(jià)重點(diǎn)研究室，四川省道地藥材系統(tǒng)開發(fā)工程技術(shù)研究中心，中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)與創(chuàng)新中藥研究四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都，610041）

基于Microtox技術(shù)（微毒測(cè)試）的中藥綜合毒性快速評(píng)價(jià)

趙軍寧 鄢良春

（四川省中醫(yī)藥科學(xué)院藥理毒理研究所，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評(píng)價(jià)重點(diǎn)研究室，四川省道地藥材系統(tǒng)開發(fā)工程技術(shù)研究中心，中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)與創(chuàng)新中藥研究四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都，610041）

Microtox技術(shù)（微毒測(cè)試）是以一種非致病的明亮發(fā)光桿菌作指示生物，以其發(fā)光強(qiáng)度的變化為指標(biāo)，測(cè)定環(huán)境中有害有毒物質(zhì)的生物毒性的一種方法，現(xiàn)已成為一種簡(jiǎn)單、快速的生物毒性檢測(cè)手段。本文綜述了Microtox技術(shù)（微毒測(cè)試）的研究現(xiàn)狀，并就該技術(shù)在中藥毒性評(píng)價(jià)應(yīng)用的技術(shù)方法、技術(shù)路線、關(guān)鍵問題以及應(yīng)用范圍等方面開展研究，為建立一種新的中藥毒性快速檢測(cè)、安全性評(píng)價(jià)以及風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)評(píng)定的的綜合評(píng)價(jià)體系奠定基礎(chǔ)。

中藥；Microtox技術(shù)；發(fā)光細(xì)菌；毒性；生物評(píng)價(jià)

中藥毒性和安全性評(píng)價(jià)已經(jīng)成為關(guān)系人民群眾的用藥安全、我國(guó)民族醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展和中醫(yī)藥國(guó)際化的重大科學(xué)問題[1-2]。中藥（尤其是有毒中藥），是中醫(yī)臨床用藥的重要組成部分，其毒性也給臨床安全用藥帶來一定風(fēng)險(xiǎn)。由于中藥成分的復(fù)雜性、易變性和現(xiàn)時(shí)人們對(duì)其認(rèn)知的程度，決定了僅依賴于現(xiàn)今對(duì)已知有效成分的分析測(cè)定尚遠(yuǎn)不能滿足作為一個(gè)藥物質(zhì)量控制的最低要求，趙軍寧等提出基于“功效-毒性-物質(zhì)”并行性中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)的新型方法體系，對(duì)于保證中藥臨床安全性和有效性具有重大的現(xiàn)實(shí)意義[3]。中藥毒性是一項(xiàng)非常重要的生物學(xué)參數(shù)，它是衡量中藥樣品對(duì)活性生物體所產(chǎn)生的影響，大多必須在條件苛刻實(shí)驗(yàn)室使用整體動(dòng)物，甚至高等生物進(jìn)行，不完全符合中藥復(fù)雜體系安全性測(cè)試的實(shí)際情況，存在耗時(shí)、費(fèi)錢、條件高、可重復(fù)性較低等不足，目前尚存眾多爭(zhēng)議[4-5]。Microtox技術(shù)（Microtox technology，微毒測(cè)試）是以一種非致病的明亮發(fā)光桿菌作指示生物，以其發(fā)光強(qiáng)度的變化為指標(biāo)，測(cè)定環(huán)境中有害有毒物質(zhì)的生物毒性的一種方法，也是目前我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 15441-1995和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)（ISO11348）認(rèn)證的急性毒理測(cè)試。自1672年R.Boyle觀察到發(fā)光的菌體所發(fā)出的光易被化學(xué)物質(zhì)抑制后，許多科學(xué)家相繼對(duì)細(xì)菌的發(fā)光效應(yīng)進(jìn)行了大量的研究。本世紀(jì)70至80年代初，國(guó)外科學(xué)家首次從海魚體表分離和篩選出對(duì)人體無害，對(duì)環(huán)境敏感的發(fā)光細(xì)菌，用于檢測(cè)水體生物毒性，現(xiàn)已成為一種簡(jiǎn)單、快速的生物毒性檢測(cè)手段[6]。80年代初我國(guó)引進(jìn)了這項(xiàng)技術(shù)，并先后分離出海水型和淡水型的發(fā)光細(xì)菌，用以檢測(cè)環(huán)境污染物的急性生物毒性。近年來還分離出明亮發(fā)光桿菌暗變種檢測(cè)環(huán)境污染物致突變性，擴(kuò)大了檢測(cè)范圍[7]。本文綜述了Microtox技術(shù)（微毒測(cè)試）的研究現(xiàn)狀，并就該技術(shù)在中藥毒性評(píng)價(jià)應(yīng)用的技術(shù)方法、技術(shù)路線、關(guān)鍵問題以及應(yīng)用范圍等方面開展研究，為建立一種新的中藥毒性以及毒性分級(jí)、配伍解毒等的綜合評(píng)價(jià)體系奠定基礎(chǔ)。

1 發(fā)光細(xì)菌及Microtox技術(shù)基本原理

1.1 發(fā)光細(xì)菌及其代謝特征 發(fā)光細(xì)菌（lnminescent bacteris或luminousbacteria）是一類在正常的生理?xiàng)l件下能夠發(fā)射可見熒光的細(xì)菌，這種可見熒光并不發(fā)熱，屬于冷光，波長(zhǎng)在450～490nm之間，在黑暗處肉眼可見。發(fā)光細(xì)菌為革蘭氏陰性，兼性好氧化能自養(yǎng)型細(xì)菌。按傳統(tǒng)分類，根據(jù)細(xì)菌表型特征，即細(xì)菌的形態(tài)、生理生化特征等方面的相對(duì)性，目前已發(fā)現(xiàn)并收入《伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)》的發(fā)光細(xì)菌有以下幾種：1）屬于異短桿菌屬（Xenorhabdus）的有發(fā)光異短桿菌（Xenorhabdus luminescens）；2）屬于發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）的有明亮發(fā)光桿菌（Photosbacterium phosphoreum）和鰒發(fā)光桿菌（P.1eiognathi）；3）屬于希瓦氏菌屬（Shewanella）的有羽田希瓦氏菌（Shezoanella hanedai），以前也曾經(jīng)把它歸類為交替單胞菌屬（Alteromonas）的海氏交替單胞菌（Alteromonas hanedia）；4）屬于弧菌屬（Vibrio）的有哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、美麗弧菌生物型I（V.splendidus biotype I）、費(fèi)氏弧菌（V.fischeri）、火神弧菌（V.1ogei）和東方弧菌（V.orientalis）?；魜y弧菌（V.cholerae）和地中海弧菌（V.mediterranei）中的某些菌株有發(fā)光現(xiàn)象，曾有報(bào)道易北河弧菌（V.albensis）有發(fā)光現(xiàn)象，后將其重新分類歸人霍亂弧菌（V.cholerae）[8]。其中，發(fā)光桿菌屬、希瓦氏菌屬以及弧菌屬中的大多數(shù)發(fā)光細(xì)菌均為海洋細(xì)菌，而霍亂弧菌則是少數(shù)被發(fā)現(xiàn)的淡水發(fā)光細(xì)菌之一。我國(guó)學(xué)者朱文杰也從青海湖中分離得到一個(gè)淡水發(fā)光細(xì)菌新種并命名為青海弧菌[7]。

發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光現(xiàn)象是其正常的代謝活動(dòng)，在一定條件下發(fā)光強(qiáng)度是恒定的。雖然發(fā)光細(xì)菌的種類有很多，但發(fā)光機(jī)理是相同的，屬于酶促氧化反應(yīng)。細(xì)菌發(fā)光反應(yīng)主要參與的物質(zhì)包括熒光酶、FMN、NAD（P）H、長(zhǎng)鏈脂肪醛（RCHO）、分子氧等。發(fā)光細(xì)菌合成的熒光酶可以催化還原型的黃素單核苷酸（FMNH2）和長(zhǎng)鏈脂肪醛（RCHO，至少含8個(gè)C），并在O2的參與下發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的能量并不被生物體儲(chǔ)存，而是通過光的形式釋放出來。發(fā)光的代謝過程及原理見圖1[7]。

有研究表明，發(fā)光基因（lux gene）系統(tǒng)中包括結(jié)構(gòu)基因luxC，D，A，B，E和調(diào)節(jié)基因luxI和luxR等。從不同發(fā)光細(xì)菌中分離得到的發(fā)光基因其種類和數(shù)量有所差異，例如luxF僅發(fā)現(xiàn)于明亮發(fā)光桿菌，但以上五個(gè)結(jié)構(gòu)基因luxC，D，A，B，E是普遍存在于已知的所有發(fā)光細(xì)菌中的。編碼菌熒光素酶的基因是luxA和luxB，在lux操縱子中，luxA和luxB是緊密相連的。luxA luxB分別編碼熒光酶的α（40 kD）和β（37 kD）亞基，形成的異二聚體即為具有產(chǎn)光能力的細(xì)菌熒光酶。而luxCDE分別編碼依賴NADPH的醛蛋白還原酶（54 kD）、?；D(zhuǎn)移酶（33 kD）和ATP合成酶（42 kD），三者共同構(gòu)成脂肪酸還原酶復(fù)合體，產(chǎn)生長(zhǎng)鏈脂肪醛作為發(fā)光反應(yīng)的電子供體[8]。

圖1 發(fā)光細(xì)菌發(fā)光的代謝過程和原理圖[9]

E1：細(xì)菌熒光素酶，由α、β 2個(gè)亞基組成，α為40000～42000D，β為37000～39000D。單獨(dú)α、β亞基均無發(fā)光活性，只有α、β共存時(shí)才有活性。E2：NADH：FMN氧化還原酶，分子量為3000D，對(duì)FMN有高度特異性。E3：脂肪酸還原酶。

1.2 Microtox技術(shù)原理 發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光現(xiàn)象是其正常的代謝活動(dòng)，在一定條件下發(fā)光強(qiáng)度是恒定的。外來受試物（無機(jī)、有機(jī)毒物、抑菌、殺菌物等）與發(fā)光細(xì)菌接觸時(shí)會(huì)使細(xì)胞的狀態(tài)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、電子的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、酶及細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)）發(fā)生改變，其發(fā)光強(qiáng)度即有所減弱。變化的大小與受試物的濃度及毒性呈相關(guān)關(guān)系，濃度越高，毒性越強(qiáng)，抑制代謝作用越強(qiáng)，發(fā)光抑制率也就越高。通常認(rèn)為外來受試物通過下面兩個(gè)途徑抑制細(xì)菌發(fā)光：1）直接抑制參與發(fā)光反應(yīng)的酶類活性；2）抑制細(xì)胞內(nèi)與發(fā)光反應(yīng)有關(guān)的代謝過程（如細(xì)胞呼吸等）。利用發(fā)光細(xì)菌和LumiFox為檢測(cè)系統(tǒng)可以檢測(cè)樣品的綜合毒性。發(fā)光菌毒性測(cè)試是在20世紀(jì)70年代后興起的一種微生物監(jiān)測(cè)環(huán)境污染及檢測(cè)污染物毒性的新方法。1978年美國(guó)Beckman公司即推出功能完備的生物發(fā)光光度計(jì)“Microtox”。自此這一急性毒性測(cè)試技術(shù)在世界范圍內(nèi)迅速推廣。因此人們也將發(fā)光菌毒性測(cè)試稱為Microtox測(cè)試。目前，市場(chǎng)上有許多測(cè)光儀器可供選擇。國(guó)產(chǎn)的測(cè)光儀，大多適用于一般化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。由于發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光是一種生物活體的發(fā)光，與單純的化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致的發(fā)光有所不同，如果不是處于最佳的響應(yīng)波長(zhǎng)范圍內(nèi)，就會(huì)大大影響檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性。故用專為發(fā)光細(xì)菌毒性檢測(cè)用的測(cè)光儀，能保證結(jié)果的可靠性。專為發(fā)光細(xì)菌毒性檢測(cè)用的測(cè)光儀一般都有配套的發(fā)光菌凍干粉，主要為進(jìn)口儀器，如美國(guó)Bechman儀器公司Microtox、CheckLight公司ToxSreen、Merck公司ToxA-lert、荷蘭SKaler公司ToxTracer、美國(guó)SDI公司Deltatox、芬蘭BioTox、美國(guó)哈希LUMIStox300等。近年來，國(guó)內(nèi)的北京濱松光子技術(shù)股份有限公司也研制出專門用于發(fā)光細(xì)菌急性毒性檢測(cè)法的BHP9511檢測(cè)儀[7]。其主要操作流程圖如下：

圖2 Microtox測(cè)試主要操作流程圖[10]

2 適合于中藥研究的Microtox技術(shù)測(cè)試方法及應(yīng)用

2.1 實(shí)驗(yàn)方法 大多數(shù)中藥本身顏色或者水不溶性可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大影響。我們通過實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，對(duì)于一些渾濁或具有顏色的樣品，可選用具有色度和濁度的自動(dòng)補(bǔ)償功能的檢測(cè)儀。

2.1.1 待測(cè)樣品溶液制備 在1%～100%抑制率所落在的濃度范圍內(nèi)根據(jù)需要再增配6～12個(gè)濃度。將樣品用蒸餾水稀釋到各濃度，再將淡水樣品與滲透壓調(diào)節(jié)液以17∶3的比例混合，配制成待測(cè)樣品溶液。樣品每個(gè)濃度都設(shè)3個(gè)平行樣（即3個(gè)測(cè)試管），分別取各濃度待測(cè)樣品溶液1 mL到對(duì)應(yīng)的干凈的測(cè)試管中。

2.1.2 零標(biāo)管（空白對(duì)照管）溶液制備 取1 mL復(fù)蘇稀釋液加入到每一個(gè)干凈的測(cè)試管中，共3個(gè)測(cè)試管。

2.1.3 發(fā)光細(xì)菌凍干粉復(fù)蘇 以費(fèi)氏弧菌凍干粉（CS234）為例，根據(jù)費(fèi)氏弧菌凍干粉的活性大小以及待測(cè)樣品濃度的個(gè)數(shù)（零標(biāo)管15 min測(cè)量的發(fā)光值在900在光值之間為宜），從冰箱冷凍室取3～5支凍干粉置于室溫（20℃左右）平衡15 min。按每個(gè)測(cè)試管加0.05 mL凍干粉溶液，取合適量的復(fù)蘇稀釋液加入到平衡后的費(fèi)氏弧菌凍干粉試劑瓶中，溶解后的凍干粉溶液應(yīng)合并到一起，置于室溫下10 min后用于測(cè)定樣品。

2.1.4 樣品發(fā)光度測(cè)定 用移液槍向各測(cè)試管中依次加入0.05 mL復(fù)蘇后的凍干粉溶液，輕輕振蕩，使之充分混勻，放置15 min后選擇LU模式測(cè)定發(fā)光值（若樣品有顏色干擾，則需開啟色度校正功能），計(jì)算抑制率。

2.1.5 毒性參數(shù)的表示方法 1）標(biāo)準(zhǔn)毒物（如重鉻酸鉀、氯化汞、苯酚、硫酸鋅等）濃度表示：當(dāng)未經(jīng)稀釋的樣品（即樣品稀釋度為100%）的抑光率在5%～95%時(shí)，也即相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度在95%～5%范圍內(nèi)，可以用相同抑光率時(shí)標(biāo)準(zhǔn)毒物的濃度來表示樣品的毒性。

2）EC50／IC50值表示：EC50／IC50值是指受試物對(duì)發(fā)光菌作用后，發(fā)光強(qiáng)度下降為對(duì)照組的50%時(shí)（即相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度或抑光率為50%時(shí)）的受試物濃度。EC50／IC50值是評(píng)價(jià)化合物生態(tài)毒性的重要參數(shù)，也是評(píng)價(jià)毒物對(duì)生物體毒理學(xué)效應(yīng)的常用參數(shù)，常用于表征受試物對(duì)發(fā)光菌的作用結(jié)果。EC50／IC50值越小表明受試物的毒性越大。

3）毒性劑量-效應(yīng)動(dòng)力曲線：可以直觀反應(yīng)藥物的毒性效應(yīng)動(dòng)力學(xué)過程和作用特點(diǎn)。

4）毒性表達(dá)方法還應(yīng)注明樣品與發(fā)光菌作用的時(shí)間，因?yàn)樽饔脮r(shí)間也影響數(shù)值大小。發(fā)光菌作用時(shí)間10 min和作用15 min的數(shù)值是不同的，有時(shí)差異還很大，故必須表明作用的時(shí)間。一般可在數(shù)值表達(dá)后用括號(hào)加注作用時(shí)間，例如：EC50＝0.10%（15 min），或抑光率45%（15 min），表明是15 min時(shí)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)。

2.2 Microtox技術(shù)在中藥毒性生物評(píng)價(jià)的應(yīng)用

2.2.1 中藥、有毒中藥毒性評(píng)價(jià) 我們提出一種基于Microtox技術(shù)的快速檢測(cè)中藥綜合毒性的生物測(cè)試方法，包括如下步驟：1）制備測(cè)試用菌液：取發(fā)光細(xì)菌凍干粉，用氯離子濃度為0.1～1.0 mol／L的溶液復(fù)蘇，得測(cè)試用菌液；2）檢測(cè)：取待檢中藥樣品，用測(cè)試用菌液檢測(cè)，確定發(fā)光強(qiáng)度抑制率為50%的樣品濃度以及濃度-效應(yīng)動(dòng)力曲線。本發(fā)明方法檢測(cè)準(zhǔn)確度和靈敏度均較高，操作簡(jiǎn)單。通過對(duì)雷公藤、蒼耳子、吳茱萸、蛇床子、醋甘遂、醋商陸、貫眾、馬錢子、天南星、重樓等中藥水提取物進(jìn)行綜合毒性測(cè)試，結(jié)果表明：1）本發(fā)明方法可以有效檢測(cè)中藥的綜合毒性，獲得定量化的IC50（抑制率為50%的樣品濃度）、標(biāo)準(zhǔn)毒物參比值（如氯化汞參比，適合無法測(cè)試IC50的中、低毒性物質(zhì)）、毒性劑量-效應(yīng)動(dòng)力曲線，可重復(fù)性好，再現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高。2）不同中藥IC50值差異較大，本發(fā)明方可以測(cè)出不同中藥的毒性大小，可基于毒性劑量-效應(yīng)動(dòng)力曲線為中藥的質(zhì)量控制及安全性評(píng)價(jià)提供參考[11]。

2.2.2 在中成藥、中藥注射劑毒性評(píng)價(jià) 以中藥注射劑為例，近年來隨著中藥注射劑臨床應(yīng)用的日趨廣泛，不良反應(yīng)報(bào)道亦日漸增多。從2006年“葛根素事件”“魚腥草事件”到2008年的“刺五加事件”“茵梔黃事件”，再到2009年的“雙黃連事件”和“清開靈事件”，讓整個(gè)中藥注射劑行業(yè)陷入信任危機(jī)。2006年之后，國(guó)家對(duì)中藥注射劑安全問題的關(guān)注達(dá)到了前所未有的高度。2009年7月，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局下發(fā)《關(guān)于做好中藥注射劑安全再評(píng)價(jià)工作的通知》，全面開展生產(chǎn)及質(zhì)量控制環(huán)節(jié)的風(fēng)險(xiǎn)排查切實(shí)控制中藥注射劑安全隱患。目前，中藥注射劑質(zhì)量控制檢測(cè)的項(xiàng)目包括：性狀、鑒別、pH值、重金屬、灼熾殘?jiān)?、有關(guān)物質(zhì)（蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、樹酯、草酸鹽、鉀離子）、熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素、無菌、裝量、不溶性微粒、可見異物、含量測(cè)定、降壓物質(zhì)、異常毒性、過敏反應(yīng)檢查、溶血與凝聚、滲透壓、有害元素、聚山梨酯80、5-HMF、指紋圖譜、大分子蛋白檢查等。但是，這些檢測(cè)指標(biāo)仍然無法有效的保證其藥效的一致性和降低其不良反應(yīng)的發(fā)生率。因此，有必要引入新的質(zhì)量控制方法。我們提出一種基于Microtox技術(shù)的快速檢測(cè)中藥注射劑綜合毒性的生物測(cè)試方法，確定發(fā)光強(qiáng)度抑制率為50%的稀釋度以及濃度-效應(yīng)動(dòng)力曲線。通過魚腥草注射液、紅花注射液的實(shí)驗(yàn)說明，對(duì)于用傳統(tǒng)方法檢測(cè)質(zhì)量均合格的中藥注射液，我們的發(fā)明方可以測(cè)出其毒性有大有小，能夠較好地解釋現(xiàn)有中藥注射液不良反應(yīng)不一致的現(xiàn)象?？梢姡景l(fā)明毒性檢測(cè)方法的檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)靈敏，準(zhǔn)確度高，可以檢測(cè)中藥注射液的毒性，為中藥注射液的質(zhì)量控制提供依據(jù)，應(yīng)用前景良好[12-14]。

2.2.3 藥物聯(lián)合作用 當(dāng)待測(cè)生物暴露在混合污染物中時(shí)，由于混合物中各組分相互影響，會(huì)產(chǎn)生聯(lián)合毒性作用，表現(xiàn)為加和作用、協(xié)同作用和拮抗作用。為了深入了解重金屬混合物的聯(lián)合毒性對(duì)發(fā)光細(xì)菌的作用，利用淡水發(fā)光細(xì)菌——青?；【鶴67（Vibrio qinghaiensis sp.nov-Q67）發(fā)光值的測(cè)定方法，采用聯(lián)合毒性單位法，在測(cè)定了硝酸鎘、重鉻酸鉀和硝酸鉛單一毒性EC50的基礎(chǔ)上，對(duì)硝酸鎘+重鉻酸鉀、硝酸鎘+硝酸鉛、硝酸鉛+重鉻酸鉀3種重金屬二元混合物的聯(lián)合毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，硝酸鎘+重鉻酸鉀、硝酸鉛+重鉻酸鉀是拮抗作用，硝酸鉛+硝酸鎘是協(xié)同作用[15]。采用二次二因子回歸通用旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以明亮發(fā)光桿菌（photobacterium phosphoreum）T3變種作為毒性測(cè)試物種，研究了多菌靈+氟硅唑、甲氨基阿維菌素+阿維菌素和二氯喹啉酸+莎稗磷等二元農(nóng)藥混合物的聯(lián)合毒性和主因子作用，建立了3個(gè)相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明，多菌靈、氟硅唑、甲氨基阿維菌素、阿維菌素、二氯喹啉酸和莎稗磷等農(nóng)藥對(duì)明亮發(fā)光桿菌的毒性有顯著的正效應(yīng)[16]。3個(gè)二元農(nóng)藥混合物的聯(lián)合毒性作用不同，總體上，多菌靈與氟硅唑以拮抗作用為主，而甲氨基阿維菌素與阿維菌素以相加作用為主，二氯喹啉酸與莎稗磷以協(xié)同作用為主。從單因子作用效應(yīng)的角度看，對(duì)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響：多菌靈大于氟硅唑、阿維菌素大于甲氨基阿維菌素，莎稗磷大于二氯喹啉酸。發(fā)光細(xì)菌法作為一種快速、操作方便、成本低廉的生物監(jiān)測(cè)方法，將在農(nóng)產(chǎn)品污染物毒性評(píng)價(jià)和農(nóng)產(chǎn)品安全快速檢測(cè)中有著廣泛的應(yīng)用前景[17]。有用明亮發(fā)光桿菌分別檢測(cè)甘草及其配伍藥物的抑光率、川烏及其配伍藥物的抑光率、藜蘆及其配伍藥物的抑光率。結(jié)果三組配伍藥的抑光率均相等或低于單味藥物的抑光率。證實(shí)“十八反”的藥物配伍后的毒性沒有增加或有所減低[18]。運(yùn)用了“明亮發(fā)光桿菌502測(cè)定”“十八反”藥物的毒性，研究結(jié)果支持“十八反”配伍毒性并不增加，相反有些毒性有所降低的結(jié)論[19]。

3 方法學(xué)評(píng)價(jià)與前景展望

1）目前，物質(zhì)毒性的常規(guī)檢測(cè)還是以理化指標(biāo)檢測(cè)方面為主，而對(duì)綜合毒性的考慮較少；若要回答對(duì)人群健康的影響，則必須用生物醫(yī)學(xué)的方法對(duì)毒性進(jìn)行分析判斷，而傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)是以受試生物的死亡數(shù)來判斷毒性的大小，一般需要幾天的時(shí)間才能有結(jié)果，而且個(gè)體差異大，影響因素多，導(dǎo)致動(dòng)物消耗量過大、測(cè)定結(jié)果在不同國(guó)家不同實(shí)驗(yàn)室存在很大波動(dòng)等問題。

2）Microtox技術(shù)用于中藥毒性檢測(cè)具有以下特點(diǎn)：a.發(fā)光細(xì)菌同高等動(dòng)物有著類似的物理化學(xué)特性和酶作用過程等特點(diǎn)，凡能干擾或破壞發(fā)光細(xì)菌呼吸、生長(zhǎng)、新陳代謝等生理過程的有毒有害物質(zhì)等都可以運(yùn)用發(fā)光細(xì)菌法檢測(cè)生物毒性，故是一種綜合毒性檢測(cè)方法；b.方法客觀、可靠、快速，國(guó)際公認(rèn)，操作簡(jiǎn)單方便，結(jié)果易于重復(fù)；c.對(duì)毒物反應(yīng)靈敏（要比一般生物細(xì)胞反應(yīng)靈敏幾個(gè)數(shù)量級(jí)）；d.試驗(yàn)所用的細(xì)菌數(shù)量大（達(dá)數(shù)百萬），個(gè)體差異可以忽略不計(jì)；e.可同時(shí)獲得多個(gè)定量參數(shù)，IC50（抑制率為50%的樣品濃度）、標(biāo)準(zhǔn)毒物參比值（如氯化汞參比，適合無法測(cè)試IC50的中、低毒性物質(zhì)）、毒性劑量-效應(yīng)動(dòng)力曲線等，既可以作為受試藥物毒效生物指紋圖譜，又可以測(cè)試其毒性效能和效強(qiáng)，綜合表征藥物毒性特點(diǎn)；f.特別適用有毒中藥、中藥注射劑以及藥物聯(lián)合毒性作用的快速評(píng)價(jià)。

3）探索和應(yīng)用快速、敏感、可靠的新型毒性測(cè)試技術(shù)已經(jīng)成為中藥毒性和安全性評(píng)價(jià)領(lǐng)域的技術(shù)瓶頸和大勢(shì)所趨?，F(xiàn)行的美國(guó)ASTM標(biāo)準(zhǔn)（D-5660）《通過對(duì)海洋發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行毒性試驗(yàn)而對(duì)遭化學(xué)污染的水和土壤進(jìn)行微生物解毒予以評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法》，美國(guó)環(huán)保局（EPA）飲用水毒性測(cè)試協(xié)議（WET）認(rèn)可，歐盟ISO11348-3《水質(zhì)測(cè)定——水樣對(duì)于發(fā)光細(xì)菌的抑制效應(yīng)測(cè)定》，中國(guó)國(guó)標(biāo)GB／T15441-1995《水質(zhì)急性毒性的測(cè)定發(fā)光細(xì)菌法》均提示Microtox技術(shù)作為高效的毒性測(cè)試方法的廣泛應(yīng)用前景。我們有理由相信，未來在進(jìn)一步改善和完善專門針對(duì)中藥的Microtox技術(shù)系統(tǒng)基礎(chǔ)上，這種任何人都能簡(jiǎn)單地用這種技術(shù)而且只需要很短時(shí)間完成標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)，將可能是復(fù)雜成分中藥毒性和安全性快速檢測(cè)、安全性評(píng)價(jià)以及風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)評(píng)定的重大突破。

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（2014-01-06收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng)）

Microtox-based fast Testing Method of Comprehensive toxicity of Traditional Chinese Medicine

Zhao Junning，Yan Liangchun
（Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610041，China）

Microtox technology is one of the fastest testing methods for determining the poisonous or toxic substances which use Luminous bacteria as a indicator organism.Our research reviews the development of microtox technology，and application for testing toxicity of Chinese medicinal materials，including technical methods，technical maps，key issues and scope of work.Our research serves as foundation for establishing a new safety and risk analysis system by providing a fast test method of TCM toxicity.

Traditional Chinese Medicine；Microtox Technology；Luminous bacteria；Toxicity；Biological evaluation

R285.5

A

10.3969／j.issn.1673-7202.2014.02.003

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（編號(hào)：2009CB522801），國(guó)家支撐計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2012BAI29B10），“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目（編號(hào)：2011ZX09401-304），國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：81073047），四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2013sz0115）

趙軍寧，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，從事中藥藥理（毒理）、中藥質(zhì)量生物控制以及道地藥材系統(tǒng)研究開發(fā)，Tel：（028）85226120，E-mail：zarmy＠189.cn