發(fā)酵性接合酵母富鐵能力分析及發(fā)酵條件的優(yōu)化

■賴 穎 李青芝 馮盼盼 高 翔

（周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口466001）

鐵是人體及動物必需的微量元素，是血紅蛋白與肌紅蛋白、細(xì)胞色素A以及某些呼吸酶的組成成分，參與體內(nèi)氧與二氧化碳的轉(zhuǎn)運(yùn)、交換和組織呼吸過程，并具有增強(qiáng)免疫的功能[1-3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，約有30%的世界人口存在鐵缺乏現(xiàn)象，而90%的貧血現(xiàn)象是由于鐵缺乏所引起的[4]。食物中鐵的缺乏會引起貧血、免疫功能低下并誘發(fā)多種疾病，例如貧血性心臟病、舌炎、口角炎及各種感染性疾病和癌癥等[5]。無機(jī)態(tài)的鐵毒性較大，被機(jī)體吸收的水平很低?，F(xiàn)存的普通口服鐵劑，由于鐵離子對胃腸道副作用大，因而限制了其使用[6]。研究低毒高效補(bǔ)鐵劑是目前鐵制劑開發(fā)的方向。

酵母菌具有富集多種微量元素的能力，其發(fā)酵工藝成熟，生產(chǎn)周期短，還可提供大量的菌體蛋白、氨基酸、豐富的B族維生素以及其他生物活性物質(zhì)，是目前作為微量元素載體理想的菌種[7-8]。富鐵酵母具有穩(wěn)定性好、吸收率高、安全性好，與食物中其他成分協(xié)同配合性好，具有良好的風(fēng)味等優(yōu)點(diǎn)，所以富鐵酵母作為強(qiáng)化食品的鐵源是預(yù)防鐵缺乏和缺鐵性貧血的一項行之有效的措施。

本研究利用酵母屬（Saccharomyces）中的發(fā)酵性接合酵母（Saccharomycescerevisiae）細(xì)胞能夠?qū)o機(jī)態(tài)的鐵轉(zhuǎn)化為有機(jī)形態(tài)的性質(zhì)，采用在酵母培養(yǎng)過程中添加Fe2+的方法制備富鐵酵母，并對影響酵母富鐵的因素進(jìn)行了研究，從而確定酵母富鐵培養(yǎng)的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

發(fā)酵性接合酵母（Saccharomycescerevisiae）：7株，周口師范學(xué)院發(fā)酵工程實驗室提供，編號F-4、F-5、F-13、F-15、F-19、F-20、F-21。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基（g/l）：酵母粉10、蛋白胨10、葡萄糖40，pH值自然；YPS培養(yǎng)基（g/l）：酵母粉10、蛋白胨10、蔗糖40，pH值7.2；YPM培養(yǎng)基（g/l）：酵母粉10、蛋白胨10、麥芽糖40，pH值7.2；Wort培養(yǎng)基（g/l）：糖濃度為40 Birxe，pH值6.0；Mallases培養(yǎng)基（g/l）：蔗糖糖蜜 41、(NH4)2SO40.5、H3PO41.0，pH值自然；瓊脂斜面培養(yǎng)基（g/l）：葡萄糖40、MgSO45、K2HPO41、KH2PO41、蛋白胨10、瓊脂條20，pH值自然；平板篩選培養(yǎng)基（g/l）：瓊脂斜面培養(yǎng)基，150～200 mg/l鐵離子濃度，pH值自然；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/l）：葡萄糖40、MgSO45、K2HPO41、KH2PO41、蛋白胨10，pH值自然。

1.1.3 儀器及試劑

儀器：AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；UV-5100型紫外/可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；JJ-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司）；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；DHP-9162型電子恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；PSM11R-090型pH計；SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；ZH?WY-2102C型雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；HC-3018型高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有新公司）。

試劑：葡萄糖、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、鹽酸羥胺，試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物量的測定

取一定體積的發(fā)酵液4 000 r/min離心20 min，收集菌體，用蒸餾水洗滌酵母泥，離心，反復(fù)3次，收集菌體，置于干燥箱中60～80℃烘干至恒重，測定干細(xì)胞的重量，換算成1 L發(fā)酵液中含有的干細(xì)胞克數(shù)（g/l），即為細(xì)胞生物量。

1.2.2 鐵含量的測定

精確稱取0.2～0.3 g酵母干粉置于燒瓶中，加入濃硝酸∶高氯酸（4∶1）混合消化液5 ml置于電爐上，接上冷凝裝置，回流冷凝消化至樣液呈無色透明。冷卻后，用蒸溜水沖洗并轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，加水定容至刻度。然后準(zhǔn)確吸取樣品溶液2 ml于50 ml試管中，之后操作按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法進(jìn)行，在相同的工作條件下，測定樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出鐵的含量。

鐵含量：每克干酵母吸附的鐵量（mg/g）；

生物量：每升培養(yǎng)液中含有的酵母干重（g/l）；

總鐵含量（mg/l）=細(xì)胞生物量（g/l）×細(xì)胞鐵含量（mg/g）。

1.2.3 菌種的選育

菌種的初篩：無菌條件下將23株初篩菌種接種至瓊脂斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h復(fù)蘇菌種，分別接一環(huán)菌種至100 ml種子培養(yǎng)基，28℃、200 r/min培養(yǎng)24 h得種子液。然后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，種子液接種量10%、Fe2+濃度150 mg/l、28 ℃培養(yǎng)48 h，取一定量的發(fā)酵液離心，烘干，收集菌體分別測定其生物量和鐵含量。

菌種的復(fù)篩：從23株初篩菌株中篩選出7株總鐵含量較高的菌種，制成菌懸液后適當(dāng)稀釋，然后涂布于含鐵離子濃度200 mg/l的平板篩選培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3 d后從平板中選取大而圓的菌落進(jìn)行復(fù)篩，測定菌體的生物量和鐵含量，從中篩選出1株總鐵含量最高的菌株。

1.2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

首先對影響菌株生長的碳源、氮源、Fe2+添加量、培養(yǎng)基裝液量、種子培養(yǎng)基接種量、培養(yǎng)時間、起始pH值、搖床轉(zhuǎn)速、鐵添加時間、溫度等因素進(jìn)行考察，測定菌株F-13在不同影響因素下的生物量及鐵含量；然后通過正交試驗對菌株生物量及鐵含量影響較大的因素水平進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，確定富鐵酵母F-13的最佳培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種初篩和復(fù)篩

通過對23株不同種屬的酵母菌進(jìn)行初篩，發(fā)現(xiàn)不同酵母菌株對硫酸亞鐵的抗性差異較大，不同菌株的生物量及鐵含量均不相同。從初篩菌株中篩選出7株總鐵含量較高的菌株進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果見表1。菌株F-13鐵含量及總鐵含量均最高，故選擇菌株F-13作為本試驗的出發(fā)菌株。

表1 不同菌株細(xì)胞生物量及鐵含量的分析

2.2 富鐵酵母F-13發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 碳源對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

在含有Fe2+80 mg/l、糖濃度40 g/l、恒溫26 ℃、200 r/min的YPD、YPS、YPM、Wort和Mallases培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48 h。分別測定其生物量、細(xì)胞鐵含量，并計算細(xì)胞總鐵含量，結(jié)果如圖1所示，在以葡萄糖為碳源的YPD培養(yǎng)基中，菌株F-13細(xì)胞生物量稍低，但細(xì)胞鐵含量及總鐵含量最高，故選擇葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

學(xué)生作為教學(xué)中的接受方，具有一定的差異性，在應(yīng)用混合式教學(xué)的過程中，我們要尊重學(xué)生的個性，了解學(xué)生的共性，從而選擇合適的混合教學(xué)方式。首先，教師要重視學(xué)生的個性色彩，根據(jù)學(xué)生的基礎(chǔ)情況，選擇相應(yīng)的知識灌輸；另外，學(xué)生劃分多個學(xué)習(xí)小組，基礎(chǔ)相當(dāng)?shù)膶W(xué)生分到一個小組，根據(jù)小組自身學(xué)習(xí)的需要制定小組內(nèi)部的學(xué)習(xí)的方式、內(nèi)容和數(shù)量，充分發(fā)揮了學(xué)生的學(xué)習(xí)自主權(quán)。最后，不管是什么教學(xué)模式都要實現(xiàn)英語學(xué)習(xí)小組之間的溝通交流，主動參與網(wǎng)上互動，與教師在線互動，及時解決英語難題。所以，在實際的工作中我們不能不切實際脫離生活，英語教育內(nèi)容應(yīng)與日常生活息息相關(guān)，這樣的混合式教學(xué)活動才能得到想要的效果。

圖1 碳源對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

進(jìn)一步研究了不同葡萄糖濃度對細(xì)胞生物量及鐵含量的影響，結(jié)果如圖2所示。在培養(yǎng)基葡萄糖濃度低于40 g/l時，隨著糖濃度的增大，菌株F-13的生物量呈緩慢上升趨勢，當(dāng)糖濃度大于60 g/l時，對其生長產(chǎn)生一定的抑制作用，生物量趨于穩(wěn)定。細(xì)胞鐵含量則隨著培養(yǎng)基葡萄糖濃度的增加呈下降趨勢，并在葡萄糖濃度達(dá)到60 g/l時趨于穩(wěn)定。綜合考慮細(xì)胞生物量及鐵含量，在葡萄糖濃度為40 g/l時細(xì)胞總鐵含量達(dá)到最高，因此，選取葡萄糖的濃度為40 g/l。

2.2.2 氮源對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同的氮源（硝酸銨、牛肉膏、尿素、蛋白胨、酵母膏），根據(jù)微生物的生長需求，培養(yǎng)基的配制一般采用碳氮比為4∶1，結(jié)果見圖3。以蛋白胨為唯一氮源時，菌株F-13的細(xì)胞鐵含量和總鐵含量均高于其它氮源的細(xì)胞鐵含量和總鐵含量，故選擇蛋白胨為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

圖2 葡萄糖濃度對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

圖3 氮源對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

進(jìn)一步研究不同蛋白胨濃度對細(xì)胞生物量及鐵含量的影響，結(jié)果(見圖4)表明，較高的蛋白胨濃度對細(xì)胞生物量及鐵含量均有一定的抑制作用，隨著蛋白胨濃度的繼續(xù)增加，細(xì)胞生物量及鐵含量均呈下降趨勢，在蛋白胨濃度為10 g/l時細(xì)胞鐵含量及生物量最高，故選擇蛋白胨濃度為10 g/l。

圖4 蛋白胨濃度對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

2.2.3 初始pH值對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

在上述優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，研究不同初始pH值下菌株生物量及鐵含量的富集情況。據(jù)圖5可知，pH值過低抑制菌株的生長且不利于菌株對鐵的吸收，隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高，酵母菌生長速度加快，細(xì)胞鐵含量增加，當(dāng)初始pH值大于6.0時酵母菌生長受到抑制，明顯表現(xiàn)為酵母菌顏色發(fā)生變化。Brady等的研究表明，微生物吸收金屬離子的最適pH值范圍是在4.0～8.0之間，因此確定本試驗的初始pH值為6.0。

圖5 初始pH值對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

2.2.4 鐵添加時間對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

在上述培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，為確定最佳鐵加入時間從而使酵母細(xì)胞獲得較高的總鐵含量。在不同發(fā)酵時間添加80 mg/l Fe2+，結(jié)果如圖6。在發(fā)酵0～10 h，細(xì)胞總鐵含量最高且基本趨于穩(wěn)定。因此，在開始發(fā)酵的同時即加入硫酸亞鐵。

圖6 鐵添加時間對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

2.2.5 裝液量對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

利用不同的裝液量來模擬不同的溶氧程度對菌株F-13生長的影響。分別用250 ml的三角瓶裝入不同體積的培養(yǎng)基，測定菌株的鐵含量和生物量，試驗結(jié)果如圖7所示。在250 ml三角瓶中，較大的裝液量（低溶氧）有利于菌株F-13對鐵的富集，而較小的裝液量（高溶氧）對菌株F-13生物量的提高比較明顯。綜合考慮細(xì)胞生物量和鐵含量，確定培養(yǎng)基裝液量為50 ml/250 ml。

2.2.6 鐵離子濃度對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

為確定不同濃度的Fe2+對酵母生物量及鐵含量的影響，分別配制Fe2+濃度為20、40、60、80、100、120、140、160、180 mg/l的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，然后測定生物量及鐵含量，結(jié)果見圖8。硫酸亞鐵的加入對酵母菌株的生長有抑制作用，但卻促進(jìn)酵母體內(nèi)鐵富集量的增加。當(dāng)Fe2+的濃度為80～120 mg/l時，酵母生物量及鐵含量達(dá)到最大值，當(dāng)Fe2+濃度超過100 mg/l時，菌體總鐵含量降低，分析原因可能是此時培養(yǎng)基中鐵的濃度過高，抑制了酵母的生長和代謝。為確定多因素綜合作用下的最佳條件，試驗選擇Fe2+濃度為80、100、120 mg/l作為正交試驗的3個水平。

圖7 裝液量對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

圖8 鐵離子濃度對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

2.2.7 培養(yǎng)時間對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

在上述培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，為確定最佳菌體培養(yǎng)時間從而使酵母細(xì)胞獲得較高的總鐵含量。相同條件下培養(yǎng)菌體不同時間并分別測定其生物量及鐵含量，結(jié)果如圖9所示。在培養(yǎng)時間為12～48 h時，菌體鐵含量剛開始變化不大，之后緩慢增加；菌體生物量，總鐵含量均繼續(xù)緩慢增加；在培養(yǎng)時間為48～60 h時，菌體鐵含量變化不大，而菌體的生物量有所增加，鐵含量仍緩慢上升，總鐵含量達(dá)到最大值；當(dāng)培養(yǎng)時間超過60 h后，鐵含量變化不大，生物量及總鐵含量明顯降低。為確定多因素綜合作用下培養(yǎng)溫度的最佳水平，試驗選擇培養(yǎng)時間48、54、60 h作為正交試驗的3個水平。

2.2.8 接種量對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

配制Fe2+添加濃度為100 mg/l的培養(yǎng)基，分別接種不同濃度的液體種子（v/v），使種子濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%，26℃培養(yǎng)48 h，測其生物量及鐵含量，結(jié)果如圖10所示。隨著接種量的增加，鐵含量有下降趨勢但變化不大，而酵母的生物量隨接種量增加而增加，當(dāng)接種量達(dá)到10%以后，生物量隨接種量的增加變化不明顯。在接種量為8%～10%范圍內(nèi)，細(xì)胞總鐵含量達(dá)到最大，隨著接種量的進(jìn)一步增加，細(xì)胞總鐵含量不再變化。

圖9 培養(yǎng)時間對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

2.2.9 溫度對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

微生物的生命活動由一系列的生物化學(xué)反應(yīng)所組成，而這些化學(xué)反應(yīng)受溫度的影響又極其明顯，因此微生物的生長均有其特定的最佳溫度范圍，在最佳溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)微生物能夠促進(jìn)其生長和代謝活動[19]。結(jié)果如圖11所示，在培養(yǎng)溫度為28℃時，菌體的總鐵含量最高，故選擇培養(yǎng)溫度為28℃。

圖11 培養(yǎng)溫度對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

2.2.10 搖床轉(zhuǎn)速對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

在不同搖瓶轉(zhuǎn)速0、100、150、200、300 r/min條件下觀察菌體生長及發(fā)酵情況，結(jié)果如圖12所示。富鐵酵母在提高轉(zhuǎn)速時菌體生長良好，且隨著轉(zhuǎn)速的提高，菌體生物量有所增加，靜置時菌體生物量明顯低于高轉(zhuǎn)速時的生物量。綜合考慮，雖然提高轉(zhuǎn)速可以增加氧溶解速度，提高酵母菌的產(chǎn)量，但是菌體的含鐵量變化并不明顯，因此試驗中選用的轉(zhuǎn)速為200 r/min。

圖12 搖床轉(zhuǎn)速對菌株F-13細(xì)胞生物量及鐵含量的影響

2.3 富集條件的正交優(yōu)化

在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步確定多因素綜合作用下酵母培養(yǎng)的最佳條件，采用正交試驗L9（34），對細(xì)胞生物量和鐵含量影響較大的葡萄糖濃度、蛋白胨濃度、鐵鹽濃度及培養(yǎng)時間4個因子的水平進(jìn)行了優(yōu)化，每個因子取三種水平進(jìn)行，正交試驗設(shè)計見表2，結(jié)果表3。當(dāng)僅考慮細(xì)胞生物量時，葡萄糖濃度是影響菌株F-13細(xì)胞生物量最重要的因子，其次為蛋白胨濃度，再次為培養(yǎng)時間及鐵鹽濃度；當(dāng)僅考慮細(xì)胞鐵含量時，鐵鹽濃度是影響菌株F-13細(xì)胞鐵含量的最重要因子，其次為培養(yǎng)時間和蛋白胨濃度，再次為葡萄糖濃度；而綜合考慮發(fā)酵液中的細(xì)胞總鐵含量時，鐵鹽濃度是影響菌株F-13細(xì)胞總鐵含量的最重要因子，其次為葡萄糖濃度，再次為蛋白胨濃度和培養(yǎng)時間。

表2 正交試驗L9（34）因素水平設(shè)計

綜合各因素對總鐵含量的影響，確定菌株最佳培養(yǎng)條件為A2B2C3D1，即葡萄糖濃度40 g/l，蛋白胨濃度10 g/l，鐵離子添加濃度120 mg/l，培養(yǎng)時間48 h。在該條件下進(jìn)行驗證試驗，所得生物量為3.92 g/l，鐵含量為7.04 mg/g。

表3 正交試驗L9（34）結(jié)果

3 結(jié)論

通過對7株發(fā)酵性接合酵母菌株進(jìn)行初篩及復(fù)篩，得到1株富鐵能力強(qiáng)的菌株F-13作為出發(fā)菌株，確定其最佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度28℃，pH值為6.0，培養(yǎng)基Fe2+添加濃度為120 mg/l，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，接種量10%，裝液量50 ml/250 ml三角瓶，培養(yǎng)時間48 h。在此優(yōu)化條件下獲得的富鐵酵母生物量可達(dá)到3.92 g/l，鐵含量可達(dá)7.04 mg/g。經(jīng)過篩選及優(yōu)化后，菌株F-13的生物量及富鐵量均有所提高，本試驗所篩選出的菌種以及最佳培養(yǎng)條件為規(guī)?；a(chǎn)鐵酵母提供了參考，但酵母的富鐵能力還不夠理想，單位體積發(fā)酵液中菌體富集的總鐵含量依然較低，為了培育出可用于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良菌種，有必要對其進(jìn)行連續(xù)的改良，以便提高菌株的指標(biāo)性能。