秸稈纖維素降解真菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

■韓愈杰 魏 萌 吳國江

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071001）

我國作為農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)作物秸稈資源十分豐富，約占農(nóng)作物生物學(xué)產(chǎn)量的60%，但因秸稈中營養(yǎng)物質(zhì)難以被利用而大部分被焚燒，僅有少量作為粗飼料用于反芻動(dòng)物，這樣不僅造成環(huán)境的污染，還造成秸稈資源嚴(yán)重浪費(fèi)。因此，將豐富的秸稈資源轉(zhuǎn)化為秸稈飼料等可利用資源，對畜牧業(yè)的發(fā)展、解決人類環(huán)境的污染和人畜爭糧問題均具有重大意義。目前，秸稈飼料的加工工藝主要采用物理法或化學(xué)法，但無論哪種方法均不能保證秸稈飼料營養(yǎng)成分充分合理利用。微生物具有強(qiáng)大的產(chǎn)酶性能，可以將木質(zhì)素、纖維素降解并轉(zhuǎn)化為成糖、乙醇、飼料蛋白等，提高了秸稈飼料營養(yǎng)價(jià)值，一定程度上可以減少精料使用。

目前利用微生物轉(zhuǎn)化秸稈為可利用的飼料資源，已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。有研究表明，用于微生物轉(zhuǎn)化的菌株多為真菌，主要有木霉、曲霉和青霉等。但因其產(chǎn)酶活力低，菌種單一等原因，制約了秸稈飼料廣泛應(yīng)用。因此篩選高產(chǎn)纖維素酶的菌株，擴(kuò)大菌種來源，成為研究的一項(xiàng)重要任務(wù)。

本研究用剛果紅羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基法從富含腐爛落葉和秸稈的土壤中分離篩選到1株高纖維素酶活的真菌，測定其酶活力，并對產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶條件進(jìn)行了初步研究。本試驗(yàn)為纖維素酶工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

樣品來源于河北保定富含腐爛落葉和秸稈土樣。

1.1.2 培養(yǎng)基配方

纖維素剛果紅培養(yǎng)基：纖維素粉1.88 g，K2HPO40.50 g，MgSO40.25 g，剛果紅 0.20 g，瓊脂 14.00 g，明膠 2.00 g，土壤浸汁100 ml，pH 值7.0，定容到1 000 ml。

無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KH2PO42 g，(NH4)2SO44 g，Mg-SO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨 10 g，牛肉膏 5 g，定容到1 000 ml。

無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g，KH2PO41 g，Mg-SO4·7H2O 1 g，NaCl 5 g，定容到1 000 ml。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PD）：馬鈴薯200 g（去皮，切成小塊煮沸20 min，紗布過慮），葡萄糖20 g，定容到1 000 ml。

種子培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，切碎煮沸30 min過濾，葡萄糖20 g，定容到1 000 ml。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g，(NH4)2SO44 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，定容到1 000 ml，pH值自然。

玉米秸稈培養(yǎng)基：玉米秸稈粉3 g，蒸餾水100 ml（固體培養(yǎng)則不加水），pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選

將采集的腐木和土樣進(jìn)行富集培養(yǎng)、平板分離和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，將產(chǎn)酶能力較高菌株挑選出來供進(jìn)一步試驗(yàn)。

1.2.2 粗酶液的制備

把100 ml發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基裝入250 ml三角瓶中，從種子培養(yǎng)基中取2 ml菌懸液接種到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3 d，4℃、6 000 r/min離心15 min，取上清液，即為粗酶液。

1.2.3 酶活力測定方法

①采用羧甲基纖維素酶活力的方法測定羧甲基纖維素酶(CMC)活，濾紙酶活力的方法測定濾紙酶(FP)酶活。

② 內(nèi)切纖維素酶（EG）的測定：取粗酶液0.5 ml，加入含1%CMC-Na的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH值4.8，0.1 mol/l)2 ml，經(jīng) 50 ℃恒溫水浴 30 min 后，立即用DNS法測定還原糖。

③ 外切纖維素酶(CBH)的測定：取粗酶液0.5 ml，加入含2%Avicel的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH值4.8，0.1 mol/l)2 ml，50 ℃恒溫水浴2 h，立即按DNS法測定還原糖。

④ β-葡萄糖苷酶(BG)的測定：取粗酶液0.5 ml,加入含0.5%水楊苷的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH值4.8，0.1 mol/l)2 ml，50 ℃恒溫水浴30 min，立即按DNS法測定還原糖。

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

根據(jù)《中國真菌志》測定方法，采用載片培養(yǎng)法培養(yǎng)真菌，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲體大小、形狀、表面特征及是否有橫隔、孢子大小、形狀、類型等，對照確定菌株的種屬地位。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

參照真菌總DNA的提取方法，提取菌株的DNA。以提取的DNA為模板，用通用引物擴(kuò)增ITS序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。回收并與pMD18-T連接,16℃連接過夜。轉(zhuǎn)化后挑陽性克隆提質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后測序（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成）。測序結(jié)果提交至Genbank中與已知真菌的18S rDNA序列進(jìn)行BLAST(http://www.ncbi.Nlm.Nih.gov/BLAST)比對。用MEGA5建發(fā)育樹。

1.4 篩選菌株急性毒性試驗(yàn)

在PD培養(yǎng)基中接目的菌株菌餅，30℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7 d，制成1×108cfu/ml的菌懸液，試驗(yàn)組10只小鼠灌喂菌懸液，每只小鼠灌喂2 ml，每天2次；對照組灌喂PD培養(yǎng)基，連續(xù)灌喂14 d。觀察并記錄小鼠的臨床表現(xiàn)，第14 d捕殺小鼠進(jìn)行病理解剖學(xué)及血液生理生化檢查。

1.5 產(chǎn)酶條件的測定

1.5.1碳氮源對菌株產(chǎn)酶能力的影響

在無碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增添1%的不同碳源（稻草粉、纖維素粉、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖）；在無氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增添1%的不同氮源（蛋白胨、尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨）。接種量為1%，培養(yǎng)4 d，測定其內(nèi)切葡聚糖酶（EG）酶活，檢測碳氮源對產(chǎn)酶的影響。

1.5.2 培養(yǎng)條件對菌株產(chǎn)酶能力的影響

以1%的接種量將H-3接種于pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 4 d，測定其EG酶活，檢測起始pH值對菌株產(chǎn)酶的影響。將H-3以1%的接種量接種發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1～7 d，測定其EG酶活，檢測培養(yǎng)時(shí)間對菌株產(chǎn)酶的影響。以1%的接種量將H-3接種發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別在25、28、30、33、35 ℃條件下培養(yǎng)4 d，測定其EG酶活，考察培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響。

目前高職院校的評(píng)估都圍繞著教學(xué)目標(biāo)、教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)進(jìn)度、教案、人才培養(yǎng)方案等內(nèi)容作精心的安排。教師上課在鉆研教材和設(shè)計(jì)教學(xué)過程中，將學(xué)生作為知識(shí)的受體，上課是努力執(zhí)行教案的過程。這種課堂就是預(yù)設(shè)教學(xué)過程的錄像式的課堂，高職院里層次不齊的生源，學(xué)生作為不同的獨(dú)立個(gè)體，他們的潛能與需求無法得到有效開發(fā)?，F(xiàn)實(shí)課堂，學(xué)生因主觀能動(dòng)性不同，在開放的課堂中更需要多種形式的交互作用以及創(chuàng)生能力。教案預(yù)設(shè)的教學(xué)過程往往無法根據(jù)課堂的實(shí)際情況調(diào)整。后現(xiàn)代主義強(qiáng)調(diào)人際溝通的差異性與多元性，認(rèn)知是不同主體之間的溝通與協(xié)作，以及主客體之間的理解與對話。因此，錄像式的高職課堂應(yīng)轉(zhuǎn)換成富有生命氣息的互動(dòng)型直播課堂。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

采集的樣品經(jīng)過涂布、劃線分離純化到15株菌株，將獲得的真菌進(jìn)行剛果紅染色水解圈的測定，其中有4株真菌產(chǎn)生明顯的水解圈，而H-3的水解圈最明顯，均高于其他菌株，表明其具有較強(qiáng)的產(chǎn)纖維素酶的能力。將4株菌株接入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，測得的纖維素酶活力和濾紙酶活力見表1。由表1可以看出H-3的酶活最高，羧甲基纖維素酶活力為237.428 IU/ml，濾紙酶活力為21.278 IU/ml。

表1 不同菌株的透明圈與菌落直徑比值及酶活

以1%的接種量在玉米秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基中接種菌株H-3，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，間隔24 h測定H-3菌株纖維素酶活，結(jié)果見表2。由表 2可知，H-3培養(yǎng)72 h時(shí)酶活最高，內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶分別為10.325、8.757、9.478 IU/ml。

表2 菌株H-3纖維素酶活力（IU/ml）

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定

菌落為白色圓形，中部粉狀，邊緣絨狀，背面淡黃棕色，見圖1。營養(yǎng)菌絲無色，直立，有隔膜，分生孢子單細(xì)胞，無色，分生孢子梗錐形見圖2。根據(jù)《中國真菌志》，依形態(tài)學(xué)特征初步鑒定菌株H-3為枝孢屬枝頂孢屬(Acremoniu)。

圖1 H-3菌落形態(tài)特征

圖2 H-3菌絲的形態(tài)

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

拼接測序結(jié)果，登錄NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，選取同源性較高的模式菌株進(jìn)行建樹分析，見圖3。結(jié)果顯示菌株H-3與Acremonium sp.GU985206.1親緣關(guān)系最近。由形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定該菌株為枝頂孢屬（Acremonium）。

2.3 篩選菌株急性毒性試驗(yàn)

飼料添加菌株需安全無毒，因此對篩選菌株進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)研究。試驗(yàn)組小鼠試驗(yàn)期間活動(dòng)與生長均正常，未出現(xiàn)中毒癥狀，第14 d解剖，各組織器官均正常（見圖4）。檢測血液指標(biāo)，各指標(biāo)試驗(yàn)組與對照組沒有明顯差距（見表3），初步表明菌株H-3沒有毒害作用。

圖3 菌株H-3與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 毒性試驗(yàn)內(nèi)臟觀察結(jié)果

表3 血液指標(biāo)測定結(jié)果

2.4 產(chǎn)酶條件測定結(jié)果

2.4.1 不同碳源對產(chǎn)酶結(jié)果的影響（見表4）

表4 不同碳源對產(chǎn)酶的影響

2.4.2 不同氮源對產(chǎn)酶結(jié)果的影響（見表5）

表5 不同氮源對產(chǎn)酶結(jié)果的影響

表5可以看出，以無機(jī)氮做為氮源，產(chǎn)酶最高的為(NH4)2SO4，其酶活力為12.37 IU/ml，優(yōu)于有機(jī)氮源酶活力，因此，菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最適氮源為硫酸銨。

2.4.3 初始pH值對產(chǎn)酶結(jié)果的影響（見圖5）

圖5 不同pH值對產(chǎn)酶結(jié)果的影響

由圖5可以看出，產(chǎn)酶的最適pH值是6.5，同時(shí)該菌株在pH值5～6.5時(shí)產(chǎn)酶效果好。

2.4.4 不同培養(yǎng)時(shí)間對產(chǎn)酶結(jié)果的影響（見圖6）

圖6 培養(yǎng)時(shí)間對產(chǎn)酶結(jié)果的影響

由圖6可以看出，在發(fā)酵前期（24～48 h）主要是菌絲生長旺盛階段，產(chǎn)酶量極低。在發(fā)酵72～96 h后產(chǎn)酶量開始增加，達(dá)到產(chǎn)酶的高峰期，然后逐漸降低，若再增加培養(yǎng)時(shí)間，酶活反而下降。

2.4.5 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶結(jié)果的影響（見圖7）

圖7 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶結(jié)果的影響

圖7表明，菌株H-3在25℃產(chǎn)酶能力最低，酶活為8.78 IU/ml，隨著溫度的升高，產(chǎn)酶能力增強(qiáng)，28℃酶活最高，其酶活力為12.47 IU/ml，溫度再升高，而酶活降低。

3 討論

纖維素類物質(zhì)是地球上最為豐富的再生資源，提高纖維素利用率可有效解決世界能源危機(jī)、糧食短缺、環(huán)境污染等問題，其中纖維素酶水解作用是解決這一環(huán)節(jié)的重要物質(zhì)。因此，選育高產(chǎn)纖維素酶的菌株，對提高富含纖維素資源的再利用具有重要意義。纖維素酶是一種復(fù)合酶，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，3種酶協(xié)同作用降解纖維素。本試驗(yàn)從腐木和腐爛秸稈土壤中利用剛果紅纖維素培養(yǎng)基分離篩選得到15株菌株，并利用濾紙條降解試驗(yàn)，獲得一株最優(yōu)產(chǎn)酶菌株H-3，測定其內(nèi)切纖維素酶、外切纖維素酶、β-葡萄糖苷酶分別為10.325、8.757、9.478 IU/ml。通過平板培養(yǎng)、形態(tài)特征觀察以及分子生物學(xué)鑒定，其與Acremonium sp.GU985206.1同源性達(dá)到99.26%，鑒定該菌株為枝頂孢屬（Acremonium）。急性毒性試驗(yàn)測定菌株的安全性，發(fā)現(xiàn)小鼠均無異常，表明該試驗(yàn)中篩選得到的H-3為實(shí)際無毒物質(zhì)。內(nèi)切葡聚糖酶在纖維素降解過程中具有重要作用，且能有效的消化飼料中各種營養(yǎng)成分，因此，本試驗(yàn)對菌株H-3產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶條件進(jìn)行優(yōu)化，確定H-3最適發(fā)酵條件為：麩皮分為碳源，硫酸銨為氮源，初始pH值6.5、28℃培養(yǎng)96 h,酶活為13.57 IU/ml，較優(yōu)化前提高了2.36 IU/ml。

目前，自然界中很多微生物都能有效降解纖維素并轉(zhuǎn)化成可利用資源，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)能降解纖維素的菌株有蟲擬蠟菌(Ceriporiopsis subvermispora)、粉孢革菌(Coniophora puteana)、地窖粉孢革菌(Coniophora cerebella)、康寧木霉(Acrostalagmus koningii)和里氏木霉(Trichoderma reesei)等，但枝頂孢屬(Acremonium sp.)產(chǎn)纖維素酶的研究報(bào)道相對較少，本試驗(yàn)篩選獲得的枝頂孢屬菌株H-3擴(kuò)大了降解纖維素菌種來源，且產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶能力強(qiáng)，因此具有很好的開發(fā)前景。

4 結(jié)論

獲得1株高產(chǎn)纖維素酶的菌株，該屬產(chǎn)纖維素酶的報(bào)道較少，通過急性毒理試驗(yàn)，該菌株安全無毒。

通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定了該菌株的最佳產(chǎn)酶條件。

（參考文獻(xiàn)19篇，刊略，需者可函索）