三裂葉豚草花粉致敏蛋白組分的分離、純化及鑒定

劉　玲，肖小軍，李　兵，何韶衡，劉志剛，楊平常#

(1遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121000；2深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院過敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，廣東深圳 518060)

三裂葉豚草(Ambrosia trifida Linn.)是豚草花粉中變應(yīng)性較強(qiáng)的一種，原產(chǎn)于北美洲，在我國遼寧有大面積生長(zhǎng)。其花粉顆粒小，粒徑18～20 μm[1]，易進(jìn)入上呼吸道。豚草花粉可溶性蛋白與人體接觸后可迅速釋放，致變態(tài)反應(yīng)，是秋季花粉癥的主要變應(yīng)原[2]。

目前，國內(nèi)外對(duì)豚草花粉致敏蛋白組分的相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果不盡相同，因此，不同地區(qū)應(yīng)根據(jù)本地區(qū)變應(yīng)原特點(diǎn)制備出相應(yīng)制劑，以便對(duì)本地區(qū)變態(tài)反應(yīng)性疾病進(jìn)行診斷和治療[3]。本研究通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)、離子交換層析和蛋白印跡(Western-blotting)等方法對(duì)錦州地區(qū)豚草花粉致敏蛋白組分進(jìn)行分離、鑒定，為本地區(qū)花粉過敏的診斷及治療提供資料。

材料和方法

材料來源

三裂葉豚草花粉采自錦州市郊區(qū)，特異患者血清由遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院提供，所有患者豚草皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(skin prick test，SPT)陽性，且與Western-blotting法檢測(cè)血清中特異性IgE(specific IgE，sIgE)抗體水平結(jié)果相符。

主要儀器與試劑

垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜電泳槽(Model1000/500)、離子交換層析柱；丙烯酰胺(BBI)；十二烷基硫酸鈉(SDS)(BIO-RAD)、過硫酸銨(AP)、生物素標(biāo)記鼠抗人IgE、辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(Kirkegaard & Perry Laboratories)、硝酸纖維膜(NC膜)(Gelman laboratory)等。

豚草花粉粗提液提取

取2.0 g豚草花粉于液氮中磨成粉末，按1∶3加入丙酮震蕩混勻，沉淀懸浮4℃，1 h。去丙酮，沉淀干燥成粉后稱重，按1∶20比例加入Coca’s液(氯化鈉5 g，碳酸氫鈉2.75 g，結(jié)晶酚4 g加蒸餾水至1 000 mL，pH 8.2)，4℃攪拌提取72 h，4℃ 4 000 r/min離心15 min，收集上清，4℃下對(duì)蒸餾水透析，冷凍干燥濃縮[4]。

豚草花粉粗提液致敏蛋白組分分離

采用SDS-PAGE體系對(duì)豚草花粉粗提液致敏蛋白組分進(jìn)行分離鑒定。分離膠12%和濃縮膠5%對(duì)花粉粗提液中的蛋白組分進(jìn)行電泳分離，電泳凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色，脫色后用凝膠成像及分析系統(tǒng)拍照并分析其相對(duì)分子質(zhì)量。

豚草花粉粗提液免疫學(xué)特性鑒定

取10份對(duì)豚草花粉存在變態(tài)反應(yīng)患者的血清混合，采用蛋白印跡法對(duì)花粉致敏蛋白組分行免疫學(xué)特性鑒定。步驟如下：電泳完取出SDS-PAGE凝膠，通過轉(zhuǎn)移槽于冰上將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上；TBS洗滌纖維膜2次，每次5 min；將膜于3%BSA-TBS 4℃封閉過夜；TBST洗膜3次，每次5 min；加入用1%BSA-TBST按5∶1稀釋的患者陽性血清37℃孵育2 h，洗膜3次；加入1%BSA-TBST按2000∶1稀釋的二抗，室溫孵育2 h，洗膜3次；加入1%BSA-TBST按5000∶1稀釋的HRP，室溫孵育1.5 h，洗膜5次，DAB(3，3′-二氨基聯(lián)苯胺)顯色，攝像后分析其相對(duì)分子質(zhì)量。

豚草花粉粗提液的離子交換柱層析與檢測(cè)

在FPLC層析控制系統(tǒng)下，用0.02 mol/L(pH 7.2)的Tris-HCl緩沖液充分平衡DEAE-Cellulose DE-52離子交換層析柱，再用此緩沖液透析24 h后的花粉粗提液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾上樣，待穿透峰后的基線走平后，改用洗脫緩沖液(0.5 mol/L氯化鈉，0.02 mol/L Tris-HCl)進(jìn)行線性離子梯度洗脫，收集各峰液。透析除鹽后冷凍干燥樣品。通過SDS-PAGE、Western-blotting分析樣品，確定各峰收集液中蛋白的免疫活性部分。

結(jié)　　果

豚草花粉粗提液SDS-PAGE

三裂葉豚草花粉主要有30余條蛋白區(qū)帶，其中主帶14條，相對(duì)分子質(zhì)量分別為10 000、13 000、15 000、18 000、20 000、27 000、35 000、36 500、38 000、42 000、56 000、63 000、70 000、100 000；25 000～100 000和10 000～17 000的區(qū)帶蛋白含量最豐富(圖1)。

豚草花粉粗提液免疫學(xué)特性鑒定結(jié)果

三裂葉豚草花粉提取液中可與變應(yīng)性患者血清IgE結(jié)合反應(yīng)陽性的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量分別為63 000、56 000、40 000和36 500，其中63 000、40 000和36 500為主要致敏蛋白組分(圖2)。

豚草花粉致敏蛋白組分純化

豚草花粉致敏蛋白組分離子交換層析：對(duì)DE-52離子交換層析緩沖液充分透析的三裂葉豚草花粉粗提液上柱，結(jié)果顯示花粉主要有6個(gè)蛋白峰(圖3)。

SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)：離子交換后各峰收集樣品進(jìn)行SDS-PAGE(圖4)。離子交換層析后蛋白主要分布在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ峰中，其中Ⅲ、Ⅳ峰蛋白條帶相同。Western blotting示主要致敏蛋白組分在第Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ峰(圖5)。

討　　論

花粉過敏又稱枯草熱，是由氣傳致敏花粉誘導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性疾病。一般認(rèn)為，花粉癥發(fā)病機(jī)制為機(jī)體接觸花粉變應(yīng)原后產(chǎn)生IgE抗體，抗體與花粉變應(yīng)原再次結(jié)合于肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞表面，從而誘發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒及組胺等炎性介質(zhì)釋放，導(dǎo)致哮喘、鼻炎和結(jié)膜炎等疾病。

豚草現(xiàn)已成為一種全國性公害植物，在探討引起兒童哮喘與吸入性變應(yīng)原的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，我國山東省753例兒童哮喘病中由豚草花粉引起的占18.28%[5]；而在抗原皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢查中發(fā)現(xiàn)，遼寧省沈陽市因豚草花粉傳播每年有上萬人患病[6]。我國遼寧及其他北方省市地區(qū)氣傳致敏花粉以三裂葉豚草為主，其在花期能產(chǎn)生大量致敏性極強(qiáng)的花粉，從而導(dǎo)致易感人群出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)[7]。豚草花粉最主要的致敏成分是蛋白質(zhì)，其中包含主要變應(yīng)原、次要變應(yīng)原及其他多種雜蛋白成分。因此分離純化花粉主要致敏蛋白組分，確定其變應(yīng)原性極其重要。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)豚草花粉致敏蛋白組分已進(jìn)行了一系列研究，Lowenstein等[8]證實(shí)，短小豚草花粉的粗提液中含大約50種抗原和蛋白質(zhì)，其中約22種為變應(yīng)原。在22種變應(yīng)原中AaBA(36.5 kDa)和Ra 6(8 kDa)具有較強(qiáng)免疫原性[9-10]。國內(nèi)吳曉曼和黃嫵嬌[11]通過SDS-PAGE分離得到5種豚草花粉的抗原，相對(duì)分子質(zhì)量分別是18 000、27 000、38 000、42 000和63 000，再結(jié)合Western blotting實(shí)驗(yàn)，觀察到豚草花粉和艾蒿花粉變應(yīng)原之間存在交叉反應(yīng)。外國學(xué)者在豚草花粉與食物的交叉變態(tài)反應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)，其與瓜類和香蕉間存在變應(yīng)原交叉反應(yīng)[12]。

本研究通過對(duì)三裂葉豚草花粉粗提液的制備，采用SDS-PAGE和Western blotting對(duì)該花粉粗提液中蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離和免疫學(xué)特性鑒定，再通過離子交換層析對(duì)主要變應(yīng)原進(jìn)行純化。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，錦州地區(qū)豚草花粉主要致敏蛋白組分相對(duì)分子質(zhì)量為63 000、40 000和36 500。離子交換層析分離得到6個(gè)峰，其中主要致敏蛋白組分主要分布在第Ⅳ、Ⅲ和Ⅰ峰中。與國內(nèi)研究報(bào)道相比較，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約為18 000與27 000的變應(yīng)原蛋白，其他蛋白基本吻合；但與國外研究結(jié)果略有不同。這一結(jié)果可能表明豚草花粉可能存在地域差異。本研究為豚草花粉致敏蛋白組分標(biāo)準(zhǔn)化的制定提供了一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，也為臨床豚草花粉變態(tài)反應(yīng)疾病的診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。

(本文圖1～5見插頁Ⅱ)

[1]Solomon WR. Airborne pollen：a brief life[J].J Allergy Clin Immunol， 2002，109：895-900.

[2]Fumanal B， Chauvel B， Bretagnolle F.Estimation of pollen and seed production of common ragweed in France[J].Ann Agric Environ Med， 2007，14：233-236.

[3]謝水祥， 朱清仙， 鄔玉蘭， 等. 豚草花粉過敏原的分析、鑒定與純化[J].廣東醫(yī)學(xué)， 2010， 31：2069-2070.

[4]楊慧， 劉志剛， 韓慶國， 等. 艾蒿、青蒿花粉變應(yīng)原組分的研究[J].免疫學(xué)雜志， 2004， 20：120-123.

[5]王清菊， 孫愛榮. 752例兒童哮喘及吸入性變應(yīng)原的關(guān)系[J].實(shí)用醫(yī)技雜志， 2003， 10：538-539．

[6]趙玉霞， 王偉， 于潤(rùn)江. 沈陽地區(qū)2283人變態(tài)反應(yīng)皮膚過敏試驗(yàn)陽性結(jié)果分析[J].中國公共衛(wèi)生， 1998， 14：77-78．

[7]Solomon WR. Airborne pollen：a brief life[J].J Allergy Clin Immunol， 2002，109：895-900.

[8]Lowenstein H， Marsh DG. Antigens of Ambrosia elatior (short ragweed) pollen. I. Crossed immunoelectrophoretic analyses[J].J Immunol，1981，126：943-948.

[9]Roebber M， Hussain R， Iaapper DG， et al．Isolation and properties of a new short ragweed pollen allergen， Ra6[J].J Immunol， 1983，13：706-711.

[10] Pilyavskaya A， Wieczorek M， Jones SW， et al．Isolation and characterization of a new basic allergen from short ragweed pollen (Ambrosia artemisiifolia)[J].Mol Immunol，1995，32：523-529.

[11] 吳曉蔓， 黃嫵嬌.艾蒿花粉與豚草花粉的抗原成份分析[J].廣東醫(yī)學(xué)，2004，25：1136-1138.

[12] Enberg RN， Leicky FE， Mc Cullough J， et al. Watermelon and ragweed share allergens[J].J Allergy Clin Immunol， 1987， 79：867-875.