甲潑尼龍琥珀酸鈉、環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤穿透神經(jīng)精神狼瘡患者血腦屏障的能力

陸　慧，鄭　昕，胡　蓓，張奉春#

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100053)

神經(jīng)精神狼瘡(neuropsychiatric systemic lupus erythematosus，NPSLE)是指系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)神經(jīng)系統(tǒng)損害相關(guān)的神經(jīng)精神表現(xiàn)，其發(fā)病率為14%～75%[1]。目前，國內(nèi)NPSLE急性期主要采用大劑量甲潑尼龍琥珀酸鈉(methylprednisolone sodium succinate，MPSS)500～1 000 mg/d或加用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CP)靜脈沖擊，聯(lián)合鞘內(nèi)注射甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)和地塞米松的治療方案。

與正常人相比，NPSLE患者的血腦屏障易受破壞或發(fā)生通透性改變，藥物穿透血腦屏障進(jìn)入腦脊液的程度可能有所改變。但是，目前對于NPSLE患者激素和免疫抑制劑穿透血腦屏障的研究相對較少，現(xiàn)行的治療方案在腦脊液局部是否可以有效尚缺乏可靠證據(jù)支持。本研究擬通過前瞻性研究方法，收集NPSLE患者血液及腦脊液樣本，建立在人血漿與腦脊液中MPSS、CP和MTX的定量分析方法并測定其濃度，評價這3種藥物穿透NPSLE患者血腦屏障的能力。

材料和方法

樣本收集及分組

全部患者均來自2011年12月至2012年5月北京協(xié)和醫(yī)院住院且均確診為NPSLE患者。診斷參考1999年美國風(fēng)濕病協(xié)會(American College Of Rheumatology，ACR)NPSLE命名和定義分類標(biāo)準(zhǔn)。所有患者均因病情需要正在接受3種方案(靜脈滴注MPSS、靜脈滴注CP和口服MTX)中1種或多種治療，試驗期間收集其血液及腦脊液樣本。所有患者均自愿簽署知情同意書。

試驗用藥

MPSS組：注射用MPSS粉末，比利時輝瑞醫(yī)藥公司生產(chǎn)。MPSS粉末溶于100 ml/250 ml葡萄糖溶液中，每位受試者一次靜脈滴注40或500或1 000 mg MPSS，滴注速度為40～60滴/min，輸注時間至少為30 min。

CP組：注射用CP粉末(0.2 g/瓶)，中國江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。每位受試者一次靜脈滴注0.4或0.8 g CP。給藥前1周內(nèi)未使用過CP。CP粉末溶解于100 ml生理鹽水中，滴注速度為40～60滴/min，輸注時間至少滴注30 min。

MTX組：MTX片劑(2.5 mg/片)，中國上海信誼制藥廠生產(chǎn)。每位受試者一次口服10 mg或15 mgMTX，服藥前1周內(nèi)未使用過MTX。

儀器及試劑

儀器：超高效液相色譜儀(美國Waters公司)。

對照品：琥珀酸甲潑尼龍(中國食品藥品檢定研究院)，環(huán)磷酰胺(中國食品藥品檢定研究院)，甲氨蝶呤(中國食品藥品檢定研究院)。

內(nèi)標(biāo)：4′-氨基苯乙酮(美國Sigma Inc.公司)

試驗方法

按藥物在血漿和腦脊液中達(dá)峰時間采集樣本，并測定其濃度。

血液樣本采集：MPSS組分別于靜脈滴注30 min和6 h后采集靜脈血樣本各3 ml；CP組于靜脈滴注60 min后采集靜脈血樣本3 ml；MTX組于口服100 min后采集靜脈血樣本3 ml。采血均采用血漿肝素鋰抗凝管。靜脈血樣本于4℃、1 500轉(zhuǎn)/min×15 min條件下分離得到血漿，放置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。MPSS組以MPSS和甲潑尼龍(methylprednisolone，MP)濃度之和表示。

腦脊液樣本采集：MPSS組于靜脈滴注6 h后采集腦脊液樣本1 ml；CP組于靜脈滴注60 min后采集腦脊液樣本1 ml；MTX組于口服100 min后采集腦脊液樣本1 ml。腦脊液樣本放置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

濃度測定：建立超高效液相色譜/質(zhì)譜串聯(lián)(ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry， UPLC-MS/MS)定量方法并對其進(jìn)行了考核，同時確認(rèn)血漿中MPS、CP和MTX的穩(wěn)定性。

統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0、Analys(美國AB Sciex公司)、SAS(美國SAS公司)軟件。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

基礎(chǔ)資料

共納入MPSS組14例，CP組10例，MTX組11例患者，均為女性。

MPSS組

MPSS組樣本血漿和腦脊液MPSS+MP峰值濃度為0.11%～3.72%，均值為(0.75%±0.90%)。3.72%為超出±3倍標(biāo)準(zhǔn)差的離群值，考慮為測量誤差或個體差異所致，予以舍棄。剔除異常數(shù)據(jù)，峰值濃度比為0.11%～1.00%，均值為(0.52%±0.30%)(表1)。

相關(guān)系數(shù)矩陣及檢驗，給藥6 h后血漿與腦脊液MPSS+MP濃度存在線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.131X+1.043，R=0.929，P=0.000，相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計學(xué)意義，線性關(guān)系顯著(圖1)。

CP組

CP組腦脊液和血漿峰值濃度為13.73%～32.94%，平均值為(22.74%±7.42%)(表2)。同期血漿和腦脊液CP濃度無正相關(guān)性。

表1　14例甲潑尼龍琥珀酸鈉組患者用藥后血漿及腦脊液甲潑尼龍琥珀酸鈉+甲潑尼龍濃度

圖1甲潑尼龍琥玻酸鈉組患者給藥6 h后血漿與腦脊液甲潑尼龍琥珀酸鈉+甲潑尼龍濃度線性圖

Fig1Linear graph of methylprednisolone sodium succinate + methylprednisolone concentrations in plasma and cerebrospinal fluid after 6h in methylprednisolone sodium succinate group

表2　10例環(huán)磷酰胺組患者血漿和腦脊液環(huán)磷酰胺濃度

MTX組

MTX組腦脊液與血漿峰值濃度為0～28.82%，均值為(2.78%±8.65%)(表3)。28.82%為超出±3倍標(biāo)準(zhǔn)差的離群值，予以舍棄。剔除異常數(shù)據(jù)后峰值濃度比為0～1.52%，平均值為(0.18%±0.48%)。同期血漿和腦脊液MTX濃度無正相關(guān)性。

討　　論

本研究為前瞻性、隨機(jī)的藥物試驗，收集了MPSS、CP和MTX患者血液及腦脊液樣本，建立人血漿和腦脊液中MPS、CP和MTX的UPLC-MS/MS定量測定方法。方法學(xué)考核的各項結(jié)果均符合國家食品藥品監(jiān)督管理總局(China Food and Drug Administration， CFDA)指導(dǎo)原則及本實驗室標(biāo)準(zhǔn)操作程序(standard operating procedures，SOP)的相關(guān)規(guī)定。

表3　11例甲氨蝶呤組患者血漿和腦脊液甲氨蝶呤濃度

ND：未測出

文獻(xiàn)報道，無論何種給藥方式，MPSS的藥代動力學(xué)模型均為線性。血漿濃度達(dá)峰時間約30 min，腦脊液濃度約6 h達(dá)峰[2-10]。1個MPSS分子進(jìn)入靜脈后立刻水解為1個琥珀酸甲潑尼龍基團(tuán)和1個鈉離子，1個琥珀酸甲潑尼龍基團(tuán)再繼續(xù)分解為1個MP分子和1個琥珀酸基團(tuán)，根據(jù)這一原理，計算MPS和MP濃度之和即可反映MPSS在體內(nèi)的形式。CP血漿濃度達(dá)峰時間為30～60 min，腦脊液濃度達(dá)峰時間為50～60 min，腦脊液濃度約為血漿濃度的20%[11-14]。MTX口服方式下血漿濃度約1～2 h達(dá)峰，目前尚無文獻(xiàn)報道MTX口服后腦脊液的達(dá)峰時間。有報道稱在急性淋巴細(xì)胞白血病的患兒中，靜脈大劑量使用MTX約100 min后腦脊液濃度達(dá)峰[15-17]。

本研究結(jié)果顯示，MPSS穿透血腦屏障的比率為(0.52%±0.30%)，MTX穿透血腦屏障的比率為(0.18%±0.48%)，提示該兩藥穿透血腦屏障能力微弱，臨床鞘內(nèi)注射地塞米松和MTX為合理用藥模式。CP穿透血腦屏障的比率為(22.74%±7.42%)，提示CP穿透能力相對較高，靜脈用藥也可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部發(fā)揮藥效。

文獻(xiàn)報道，多發(fā)性硬化患者靜脈滴注1 500 mg MPSS 2 h后血漿濃度與腦脊液濃度之比為150，3 h后該比值為25，約6 h后藥物在腦脊液中達(dá)峰值，濃度約為522 μg/L[18-21]。本研究按文獻(xiàn)報道的峰值濃度時間取樣，測得的腦脊液MPS+MP濃度為1.7～50.92 μg/L，遠(yuǎn)低于上文數(shù)據(jù)。輝瑞新西蘭公司2012年版MPSS說明書提到，NPSLE患者M(jìn)PSS腦脊液與血漿峰值濃度比值約為5%～6%；而本研究中MPSS腦脊液與血漿峰值濃度比為(0.52%±0.30%)，提示MPSS穿透血腦屏障比率低。MPSS為中等極性大分子，分子量為474.54，理論上其穿透血腦屏障的能力較弱，本研究結(jié)果與這一理論吻合。另外，血漿6 h與同期腦脊液MPS+MP濃度間存在線性關(guān)系，可以通過測量血漿濃度來估計同期腦脊液中的藥物濃度，以合理用藥，在保證治療效果的同時，減少藥物在局部不良反應(yīng)。

CP為極性較小的中分子，相對分子質(zhì)量為261 090，理論上其穿透血腦屏障的能力強(qiáng)于MPSS和MTX。本研究得到的CP腦脊液和血漿峰值濃度百分比與文獻(xiàn)結(jié)果接近[22]。

MTX為極性分子，被動擴(kuò)散吸收量較少，腦脊液中濃度更低，所以大部分患者在腦脊液中的濃度幾乎檢測不出來。本研究結(jié)果顯示，口服MTX血腦屏障穿透率僅為(0.18%±0.48%)，其值很低，提示口服小劑量MTX不能透過或僅能輕微透過血腦屏障。Valesini等[23]于1994年首次報道了同治療中樞白血病相似的鞘內(nèi)治療方法，認(rèn)為MTX 10 mg和DXM 20 mg鞘內(nèi)注射治療神經(jīng)精神狼瘡可發(fā)生戲劇性的治療效果，癥狀在24 h內(nèi)得到控制。本研究結(jié)果也證實了在NPSLE的治療中，MTX鞘內(nèi)注射合理，毒性作用及不良反應(yīng)小，同時能最大限度地提高療效。

由于時間、技術(shù)有限，本研究未能全面地研究NPSLE患者血漿和腦脊液中MPSS、MTX和CP的藥代動力學(xué)，試驗設(shè)計中這3種藥物在血漿和腦脊液中的達(dá)峰時間僅為根據(jù)文獻(xiàn)總結(jié)而來。但不同個體藥物在達(dá)峰時間、達(dá)峰濃度、代謝速率和藥時曲線下面積等方面?zhèn)€體間差異仍很大，本次測量得到的峰值濃度可能存在誤差，如果條件允許，可以連續(xù)地多時間點同時收集血漿和腦脊液，得到精確的血漿和腦脊液的峰值濃度，這樣對比得到的藥物穿透能力也更有說服力。若在同一個體上實施腦脊液多點采集有困難，可擴(kuò)大樣本量，將入組患者按時間點分組，不同時間點分組，再進(jìn)行組間對比，濃度最高的亞組的采集點即可認(rèn)定為腦脊液的達(dá)峰時間。另外，本研究收集的患者多采用聯(lián)合用藥模式，實驗中不可避免地會產(chǎn)生不同藥物間的相互影響，一種藥物可能對另一種藥物的分布、代謝和排泄產(chǎn)生協(xié)同或拮抗的作用。今后設(shè)計此類試驗時，可完善入組標(biāo)準(zhǔn)，選擇一段時間內(nèi)只用一個藥物治療的患者，以排除藥物間的相互影響。

[1]Hermosillo-Romo D， Brey RL. Diagnosis and management of patients with neuropsychiatric systemic lupus erythematosus (NPSLE)[J].Best Pract Res Clin Rheumatol， 2002，16：229-244.

[2]Daley-Yates PT， Gregory AJ， Brooks CD. Pharmacokinetic and pharmacodynamic assessment of bioavailability for two prodrugs of methylprednisolone[J].Br J Clin Pharmacol， 1997，43：593-601.

[3]Derendorf H， Mollmann H， Krieg M， et al. Pharmacodynamics of methylprednisolone phosphate after single intravenous administration to healthy volunteers[J].Pharm Res， 1991，8：263-268.

[4]Chen TC， Mackic JB， McComb JG， et al. Cellular uptake and transport of methylprednisolone at the blood-brain barrier[J].Neurosurgery， 1996，38：348-354.

[5]Bannwarth B， Schaeverbeke T， Pehourcq F， et al. Prednisolone concentrations in cerebrospinal fluid after oral prednisone.Preliminary data[J].Rev Rhum Engl Ed， 1997，64：301-304.

[6]Al-Habet SM， Rogers HJ. Methylprednisolone pharmacokinetics after intravenous and oral administration[J].Br J Clin Pharmacol， 1989，27：285-290.

[7]Defer GL， Barre J， Ledudal P， et al. Methylprednisolone infusion during acute exacerbation of MS：plasma and CSF concentrations[J].Eur Neurol， 1995，35：143-148.

[8]Bernards CM. Cyclosporine-A-mediated inhibition of p-glycoprotein increases methylprednisolone entry into the central nervous system[J].Spinal Cord， 2006，44：414-420.

[9]Mollmann H， Rohdewald P， Barth J， et al. Pharmacokinetics and dose linearity testing of methylprednisolone phosphate[J].Biopharm Drug Dispos， 1989，10：453-464.

[10] Derendorf H， Mollmann H， Rohdewald P， et al. Kinetics of methylprednisolone and its hemisuccinate ester[J].Clin Pharmacol Ther， 1985，37：502-507.

[11] Arndt CA， Balis FM， McCully CL， et al. Cerebrospinal fluid penetration of active metabolites of cyclophosphamide and ifosfamide in rhesus monkeys[J].Cancer Res， 1988，48：2113-2115.

[12] Yule SM， Price L， Pearson AD， et al. Cyclophosphamide and ifosfamide metabolites in the cerebrospinal fluid of children[J].Clin Cancer Res， 1997，3：1985-1992.

[13] Struck RF， Alberts DS， Horne K， et al. Plasma pharmacokinetics of cyclophosphamide and its cytotoxic metabolites after intravenous versus oral administration in a randomized， crossover trial[J].Cancer Res， 1987，47：2723-2726.

[14] Arndt CA， Balis FM， McCully CL， et al. Cerebrospinal fluid penetration of active metabolites of cyclophosphamide and ifosfamide in rhesus monkeys[J].Cancer Res， 1988，48：2113-2115.

[15] 黃民，趙香蘭. 急性淋巴性白血病兒童口服甲氨蝶呤的藥代動力學(xué)研究[J].癌癥， 1991，10：460-462.

[16] 趙帆， 王琦， 趙永新， 等. 大劑量甲氨蝶呤化療的腦脊液藥代動力學(xué)研究[J].中德臨床腫瘤學(xué)雜志(英文版)， 2006，5：101-103.

[17] 高晨， 高旻， 史衛(wèi)忠， 等. 冰片對甲氨蝶呤透過血腦屏障影響的實驗研究[J].中國臨床藥理學(xué)雜志， 2009，(02)：134-137.

[18] 杜臻雁， 唐福林. 糖皮質(zhì)激素抗炎作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中華醫(yī)學(xué)雜志， 2006，86：2512-2515.

[19] Bruyn GA. Controversies in lupus：nervous system involvement[J].Ann Rheum Dis， 1995，54：159-167.

[20] Badsha H， Edwards CJ. Intravenous pulses of methylprednisolone for systemic lupus erythematosus[J].Semin Arthritis Rheum， 2003，32：370-377.

[21] 陸曉曄， 顧越英， 王元. 神經(jīng)精神狼瘡的治療策略[J].中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志， 2007，1：202-206.

[22] Takada K， Illei GG， Boumpas DT. Cyclophosphamide for the treatment of systemic lupus erythematosus[J].Lupus， 2001，10：154-161.

[23] Valesini G， Priori R， Francia A， et al. Central nervous system involvement in systemic lupus erthematosus：a new therapeutic approach with intrathecal dexamethasone and methotrexate[J].Ann Rew Immunopathol， 1994， 16：313-321.