低溫低流量保護缺血再灌注肺損傷的研究進展

張偉艷（綜述），莫緒明（審校）

·綜 述·

低溫低流量保護缺血再灌注肺損傷的研究進展

張偉艷（綜述），莫緒明（審校）

體外循環(huán)；低溫；低流量；缺血再灌注；先天性心臟病

先天性心臟病是兒童非感染性疾病的首要死因，在活產(chǎn)兒的發(fā)病率大約是1%［1］，在自然流產(chǎn)的胎兒中約為5%～10%，在中國高發(fā)地區(qū)報告先天性心臟病發(fā)病率為0．73%［2］。近年來，隨著小兒心內(nèi)直視手術(shù)相關技術(shù)（如深低溫停循環(huán)、深低溫低流量灌注等）的迅速發(fā)展及術(shù)后監(jiān)護水平的提高，不少復雜危重先天性心臟病患兒得到了滿意的治療。

有些先天性心臟病心內(nèi)畸形十分復雜，涉及大血管病變，如果灌注量不減少，會由于灌注流量較大難以進行手術(shù)，必需將灌注流量減小才能完成，為避免低灌注流量造成的全身缺血缺氧性損害，只有降低體溫，減少氧耗量保護重要臟器。因此，臨床上對于復雜性先天性心臟病的手術(shù)常采用深低溫低流量（deep hypothermic low flow，DHLF）技術(shù)。DHLF能夠提供一定的氧供和血流，從而增強細胞對缺氧的耐受性，延長組織對缺氧的耐受時間，減輕細胞的損傷及因缺氧而造成的細胞的凋亡，同時低溫可抑制自由基及炎癥因子等釋放，具有較好的保護作用，但是，由于同樣經(jīng)歷缺血再灌注損傷（ischemical reperfusion injury，IRI）的過程，對肺、心、腎、腦等臟器仍將產(chǎn)生一定的損害，而肺損傷是體外循環(huán)術(shù)后的主要并發(fā)癥之一［3－7］。術(shù)后約2%的急性肺損傷（acute lung Injury，ALI）可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）［8］。有研究顯示：體外循環(huán)術(shù)后，因呼吸衰竭的病死率高達50%～70%。特別是先天性心臟病合并肺動脈高壓的年幼患兒及重癥患者，嚴重時可引起ARDS甚至死亡，嚴重影響患者預后［9］。因此，DHLF對肺部的作用仍需進一步探討。本文就近年來有關缺血再灌注肺損傷及低溫低流量對肺部作用的研究進展作一綜述。

1 缺血再灌注對肺組織的損傷

1．1 氧自由基（oxygen free radicals，OFR）的作用

OFR在肺IRI中起重要作用。缺血肺組織再灌注時注入氧分子，由線粒體細胞色素P450系統(tǒng)產(chǎn)生毒性氧代謝產(chǎn)物；并伴隨三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）降解，缺氧可激活細胞內(nèi)p38絲裂原活化蛋白激酶，使黃嘌呤氧化酶激活，從而當肺再灌注時產(chǎn)生活性氧［10］。OFR引起肺損傷的機制［11－13］有：①直接損傷DNA，使DNA鏈斷裂，導致DNA耗竭及ATP合成減少；②OFR與脂質(zhì)作用使脂肪酸過氧化，致細胞膜受體、膜蛋白酶和離子通道的脂質(zhì)微環(huán)境改變；③OFR與蛋白質(zhì)作用可使氨基酸氧化與破壞，導致酶失活及多肽鏈斷裂；④影響核基因的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)凋亡基因，誘導炎癥相關基因（如NF－KB）的表達，產(chǎn)生白細胞介素－1（interleukin－1，IL－1）、腫瘤壞死因子－α（Tumor necrosis factor，TNF－α）、集落刺激因子（conlony stimulating factor，CSF）、IL－8、細胞間黏附分子－1（intercellular adhesion molecule－1，ICAM－1）等，進而促進炎癥效應細胞的增殖與活化。

1．2 多型核白細胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）肺內(nèi)聚集和激活的作用 IRI時大量激活的白細胞聚集在肺內(nèi)是導致肺損傷的重要步驟，PMN浸潤、激活是引起肺損傷的主要原因之一［14］。PMN一方面通過“呼吸爆發(fā)”釋放OFR，導致細胞損傷；另一方面PMN釋放的蛋白水解酶物質(zhì)引起或加重“無復流”現(xiàn)象，導致肺水腫。IRI后大量白細胞黏附和聚集于缺血組織的血管中，活化的PMN經(jīng)脫顆粒作用釋放彈性蛋白酶，基質(zhì)金屬蛋白酶和髓過氧化物酶等多種蛋白酶，分解胞外纖維與基質(zhì)導致肺組織損傷［15］。

1．3 細胞間的相互作用 IRI可激活PMN和內(nèi)皮細胞釋放IL－8，IL－8進一步誘導PMN遷移、黏附和浸潤，激活的PMN表面表達黏附分子，與血管內(nèi)皮細胞表面的ICAM－1相互作用，PMN與內(nèi)皮細胞發(fā)生牢固粘連。同時內(nèi)皮細胞鈣離子內(nèi)流增加，內(nèi)皮

細胞間隙增大，通過IL－8、血小板等的趨化作用使PMN游出血管，在肺內(nèi)滯留，并釋放出大量的氧自由基而引起肺組織損傷［16］。

2 深低溫低流量對肺部的保護

2．1 抑制代謝率 正常供氧條件下，體溫每降低1℃，中樞氧代謝率被抑制5%左右。此時葡萄糖消耗量明顯減少，而高能磷酸化合物水平不變［25］。低溫保存高能磷酸化合物，抑制乳酸堆積，維持細胞內(nèi)酸堿平衡［26］。

2．2 抑制OFR生成，促進自由基清除 實驗證明，低溫可通過如下機制使自由基的量維持較低水平：①抑制興奮性氮基酸（excitatory amino acids，EAAs）和兒茶酚胺介導的氧化應激［27］。低溫缺血可顯著抑制EAAs釋放，同時可使腦缺血期間兒茶酚胺釋放量減少60%。②改善組織酸中毒程度［28］。組織酸中毒可經(jīng)過多種途徑如Bohr效應促進活性氧分子（reactive oxygen species，ROS）和過氧化脂質(zhì)產(chǎn)生，低溫通過改善復蘇后能量供應和需求間的不平衡而緩解胞內(nèi)酸中毒的程度，減少ROS和過氧化脂質(zhì)的生成。③低溫還可通過減少Ca2＋內(nèi)流、抑制嗜中性粒細胞活化和黏附、減少內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)消耗等途徑減少氧自由基的生成［29］。

2．3 對PMN功能的影響 很早以前，人們就發(fā)現(xiàn)亞低溫可抑制損傷后PMN浸潤從而減輕組織損傷。Maier［30］等發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后1 h的亞低溫可減少PMN浸潤達75%，2 h后減輕損傷為72%。亞低溫不但減少浸潤PMN數(shù)量，還抑制其功能。PMN釋放氧自由基的能力與溫度密切相關，有報道當溫度從37℃降至 33℃時，PMN釋放的氧自由基減少 4倍［31］。Mizuno［32］等的研究顯示，將 PMN孵育在35℃時，其吞噬能力顯著提高。

2．4 對凋亡的影響 實驗證實局部組織60 min的低溫（10℃）治療可直接阻斷TNF－α誘發(fā)的細胞凋亡，這可能與低溫治療恢復毛細血管灌流、改善組織缺血有關。當然也不能排除低溫可干擾TNF－α與其受體結(jié)合而發(fā)揮保護作用［33］。有研究證實低溫對于壞死的細胞無影響，但顯著減少凋亡的細胞，這提示低溫可特異性地抑制細胞凋亡。雖然在損傷和缺血的同時就可能觸發(fā)凋亡，但其死亡過程將持續(xù)一段時間，這就為低溫阻斷相關的生化反應過程提供了可能［34］。

2．5 對細胞因子的影響 低溫可顯著抑制炎癥早期TNF－α的釋放［35］和白介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）RNA表達［36］。Marion等［37］發(fā)現(xiàn)在腦創(chuàng)傷后36 h，低溫組IL－1β含量明顯低于常溫組，且復溫后差異依然存在。Aibiki等［38］證實，低溫可以抑制腦損傷后IL－6升高，且作用可延續(xù)到復溫時和復溫后。低溫降低機體的代謝率，并有可能改變一些酶等蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，降低其生物活性，這可能是低溫抑制機體炎癥因子釋放的機制之一。

2．6 對 Ca2＋的影響 Bickler等［39］和 Yamashima等［40］發(fā)現(xiàn)，低溫可顯著減緩缺血后的Ca2＋堆積，緩解細胞內(nèi)Ca2＋超載，從而影響缺血后包括脂蛋白相關磷脂酶A2，鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ、蛋白激酶C等多種重要Ca2＋靶酶的活性。低溫可促進Na＋－K＋－ATP酶和Ca2＋－Mg2＋－ATP酶活性恢復、緩解細胞內(nèi)Ca2＋超載、脂質(zhì)過氧化反應的普遍抑制以及能量代謝改善后磷脂再酰基化增多［41］。

2．7 對微循環(huán)的影響 Westmann等［33］發(fā)現(xiàn)局部低溫可阻斷TNF－α所致的毛細血管灌流障礙，這可能是低溫抑制PMN聚集，降低毛細血管阻力所致。低溫還可抑制血栓素生成，促進前列腺素合成從而恢復微血管灌流，保持組織結(jié)構(gòu)完整性。黏附分子可促進PMN與內(nèi)皮細胞黏附，多項研究證實低溫可抑制黏附分子的功能及其在白細胞和內(nèi)皮細胞上的表達，從而減少PMN的浸潤［42］。

雖然迄今尚未有低流量對肺有保護作用的報道，但Zhang［43］等研究證實低于30 mm Hg的肺灌注壓力可減少體外循環(huán)犬模型肺損傷。X．Yewei等［44］研究證明低溫低流量豬模型可顯著減少體外循環(huán)造成的肺損傷。除此以外，對于正常流量的體外循環(huán)手術(shù)，術(shù)中采用聯(lián)合超濾［45］，某些藥物、如烏司他丁［46］等可顯著降低患兒術(shù)后的肺損傷。

缺血再灌注肺損傷是一種多因素共同作用的復雜的病理、生理過程，確切的發(fā)生機制十分復雜，仍未完全清楚。而低溫是一項歷時久遠的臨床治療方法，其腦保護作用早已被人們所公認并廣泛應用。肺臟是空腔臟器，對其應用低溫的研究較少，僅限于少量動物實驗和心臟體外循環(huán)手術(shù)中。相信隨著技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，會更加深刻了解缺血再灌注的損傷機制，進一步明確低溫低流量的保護作用及相關的分子機制，為以后肺保護藥物的臨床應用提供基礎依據(jù)，為臨床的實施奠定基礎，同時新的、更有效的肺損傷保護措施也將不斷出現(xiàn)，以降低體外循環(huán)肺損傷的發(fā)生率，改善患者的預后并降低死亡率。

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210008南京，南京醫(yī)科大學附屬南京兒童醫(yī)院心胸外科

1．4 細胞因子的釋放 TNF－α是機體產(chǎn)生的早期炎癥反應細胞因子之一，在大量產(chǎn)生和釋放時，機體的免疫平衡被破壞。TNF－α與受體結(jié)合后通過多種細胞通路激活轉(zhuǎn)錄因子，使單核巨噬細胞分泌大量炎性細胞因子，出現(xiàn)細胞因子的級聯(lián)反應。研究發(fā)現(xiàn)［17］，IRI后肺組織中TNF－α顯著增加，明顯高于假手術(shù)組和藥物干預組。IL－8是一種PMN趨化因子，IRI損傷可激活PMN和內(nèi)皮細胞釋放大量的IL－8，進一步誘導PMN遷移、黏附和浸潤，加重肺IRI損傷。

1．5 細胞凋亡 多種臟器、組織歷經(jīng)IRI后均發(fā)現(xiàn)有細胞凋亡現(xiàn)象，凋亡參與IRI肺損傷的病理、生理機制，細胞凋亡的調(diào)控與多種基因的調(diào)控有關。B淋巴細胞瘤－2（B－cell lymphoma－2，Bcl－2）是重要的抗細胞凋亡基因，在IRI損傷中表現(xiàn)得尤為突出。Cooke等［18］發(fā)現(xiàn)用腺病毒轉(zhuǎn)染使人類Bcl－2在大鼠體內(nèi)過表達后可抑制肺移植后的細胞凋亡，而且Bcl－2作為半胱天冬酶（caspase）的上游調(diào)控機制，其過度表達能抑制各種因素誘發(fā)的caspase激活和凋亡。

1．6 微循環(huán)障礙 IRI過程中毛細血管長度增加，流量減少，流速降低［19］，導致血細胞易于在毛細血管壁沉著、黏附。IRI引起微血管壁上的受體發(fā)生改變而導致血管收縮異常。Anthonio等［20］研究發(fā)現(xiàn)在缺血30 min再灌注60 min的心臟中β1腎上腺素能受體密度明顯下降。IRI時釋放大量縮血管物質(zhì)，而擴血管物質(zhì)合成和釋放減少，造成微血管舒縮功能的改變，加重細胞的損傷和壞死。

1．7 鈣超載 當缺血發(fā)生時，細胞內(nèi)ATP含量減少，鈉泵活性降低，造成細胞內(nèi)Na＋含量增多，細胞水腫；再灌注時，細胞內(nèi)高Na＋迅速激活Na＋／Ca2＋交換蛋白，Na＋得以向細胞外轉(zhuǎn)運，同時，大量Ca2＋進入細胞，這是缺血再灌注鈣超載形成的主要途徑。IRI時鈣超載的發(fā)生主要是IRI期高濃度的細胞內(nèi)Ca2＋很容易激活磷脂酶A2和鈣敏感性蛋白酶。磷脂酶A2和蛋白激酶C的活化可導致花生四烯酸形成，花生四烯酸的活化可導致前列腺素和血栓素A2的形成，前者是OFR產(chǎn)生的底物，后者可導致微循環(huán)障礙。鈣超載可以使細胞膜、線粒體和肌漿網(wǎng)膜損傷，進一步增加膜的通透性，使內(nèi)皮細胞水腫，干擾線粒體氧化磷酸化，使ATP生成減少；還可以增強Ca2＋依賴性蛋白酶活性，加速黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，促進OFR生成［21］。

1．8 能量代謝障礙 缺血再灌注早期，能量代謝從線粒體的有氧氧化轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕴墙徒鉃橹鳎墙徒猱a(chǎn)生的ATP并不能滿足細胞需求，細胞內(nèi)儲備的高能磷酸化合物開始降解，其中磷酸肌酸較ATP提前降解［22］，ATP生成不足，使細胞膜和肌漿網(wǎng)上Ca2＋－ATP酶活性降低，進入細胞內(nèi)的Ca2＋不能被細胞膜和肌漿網(wǎng)上鈣泵有效而及時地轉(zhuǎn)運到細胞外或攝入肌漿網(wǎng)儲存，導致細胞內(nèi)Ca2＋濃度升高，更加重了細胞內(nèi)鈣超載［23］。Sommer等認為肺缺血再灌注損傷引起的肺水腫可能與線粒體的功能障礙有關［24］。

綜上所述：缺血再灌注肺損傷是一種多種因素共同作用的復雜的病理、生理過程，在其發(fā)生、發(fā)展過程中同時存在復雜的生理、化學和分子反應，其中氧自由基的生成、細胞間的相互作用、多形核中性粒細胞肺內(nèi)聚集和激活、細胞因子的釋放、細胞凋亡及信號轉(zhuǎn)導通路等都是關鍵性的致傷因素。而深低溫恰好可以從這幾個方面抑制缺血再灌注引起的損傷。

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