羊水來(lái)源干細(xì)胞骨向分化的研究進(jìn)展

繆 喆 綜 述 史 俊 審 校

·綜述·

羊水來(lái)源干細(xì)胞骨向分化的研究進(jìn)展

繆 喆 綜 述 史 俊 審 校

羊水來(lái)源干細(xì)胞的屬性介于胚胎干細(xì)胞與成體干細(xì)胞之間，保留有間充質(zhì)干細(xì)胞類似的未分化屬性，因無(wú)致瘤性、不促發(fā)同種異體免疫反應(yīng)而受到關(guān)注。目前，有關(guān)其細(xì)胞來(lái)源及特性、骨向誘導(dǎo)分化及培養(yǎng)，以及在組織工程的應(yīng)用等方面的研究日益增多。研究認(rèn)為，羊水來(lái)源干細(xì)胞的骨向分化有望成為骨缺損修復(fù)的新的骨組織來(lái)源。本文對(duì)羊水來(lái)源干細(xì)胞骨向分化的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

羊水來(lái)源干細(xì)胞骨向分化組織重建

干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞因?yàn)閺?fù)雜的倫理問(wèn)題和致瘤性，使其研究受限[1]。成體干細(xì)胞，如骨髓干細(xì)胞，具有多向分化潛能[2]，可定向分化為多種組織和器官，已有大量的研究對(duì)此進(jìn)行了報(bào)道。

Gosden[3]在診斷性羊膜穿刺液中發(fā)現(xiàn)大量胚胎及胚胎外組織來(lái)源的干細(xì)胞，屬性介于胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞間的這一干細(xì)胞群被命名為人羊水來(lái)源干細(xì)胞（hAFSC）。在體外誘導(dǎo)hAFSC形成骨組織則是一項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)，為hAFSC應(yīng)用于先天性骨缺損或外傷、腫瘤切除術(shù)后骨組織缺損的重建治療啟發(fā)新的思考[4]。我們對(duì)近年來(lái)骨向分化hAFSC的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 羊水及羊水來(lái)源干細(xì)胞

在胚胎發(fā)育第2周，胚泡逐漸形成由上下兩胚層組成的胚盤。上胚層近滋養(yǎng)層出現(xiàn)腔內(nèi)液為羊水的羊膜腔，羊膜腔逐漸擴(kuò)大使羊膜與絨毛膜融合形成羊膜絨毛膜。在胚胎孕育早期，Na+/Cl-跨母體蛻膜及胎兒皮膚進(jìn)行主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，隨之相伴發(fā)生水的被動(dòng)運(yùn)輸，形成與胎兒血漿等滲的羊水；在后期，大量羊水由胎兒排尿形成；此外，胎兒呼吸道分泌液、消化/胃腸道排泄也成為羊水的組成來(lái)源。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，三胚層來(lái)源的胚胎細(xì)胞都在羊水中存在。由于羊膜穿刺術(shù)的限制，一般在妊娠12周前行羊水抽檢[5]。

c-Kit/CD117被認(rèn)為是干細(xì)胞因子受體，從人羊膜穿刺術(shù)抽檢羊水中分離出約1%的CD117（+）羊水來(lái)源細(xì)胞，其MHC-I（HLA-ABC）表面抗原呈陽(yáng)性，部分MHC-Ⅱ（HLADR）表面抗原呈陽(yáng)性，并表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等間充質(zhì)或神經(jīng)組織干細(xì)胞表面標(biāo)志物[4]。

AFSC能抑制免疫反應(yīng)與MHC低表達(dá)相關(guān)[7-8]。Marta等[6]的研究顯示，HLA-DR表達(dá)陽(yáng)性hAFSC、HLA-DR表達(dá)陰性hAFSC及未經(jīng)區(qū)分hAFSC細(xì)胞，均不能誘導(dǎo)同種異體的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。但研究同時(shí)提及，HLA-DR陽(yáng)性AFSC能致使局部抗CD3為主的同種異體T細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)烈的增殖。

在Kim等[1]的實(shí)驗(yàn)中，hAFSC體外培養(yǎng)至27代，前19代細(xì)胞中均呈Oct4陽(yáng)性表達(dá)。Mauro等[10]對(duì)羊的羊水來(lái)源干細(xì)胞的研究顯示，AFSC體外培養(yǎng)細(xì)胞集落在三維形態(tài)上形成球狀體，這一過(guò)程與其他干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞一致。

相較其他干細(xì)胞，hAFSC具有以下優(yōu)勢(shì)[4，9]：①hAFSC的傳代時(shí)間短，為36 h，并且在250代后仍能保持長(zhǎng)端粒及正常染色體組成；②在特定的培養(yǎng)環(huán)境中，hAFSC易分化為不同的細(xì)胞系；③90%以上的hAFSC表達(dá)與未分化狀態(tài)密切相關(guān)的標(biāo)志物Oct4。

2 羊水來(lái)源干細(xì)胞的骨向分化培養(yǎng)

將hAFSC以3 000 cells/cm2的密度培養(yǎng)于10%FBS低糖細(xì)胞培養(yǎng)基（加青霉素/鏈霉素、100 mM地塞米松、10 mM β-甘油磷酸、0.05 mM抗壞血酸）[4]，體外培養(yǎng)1周后AFSC-支架復(fù)合物移植入免疫缺陷大鼠股骨缺損區(qū)。植入8周后，經(jīng)Kossa染色確認(rèn)，形成高度礦化組織。植入18周后Micro-CT掃描顯示，缺損區(qū)密度增高。

Ivana等[11]將未經(jīng)傳代挑選的hAFSC直接進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，在18 d后即有鈣化結(jié)節(jié)形成，30 d后的檢測(cè)顯示，COL1、ONC、OPN、OCN、OPG、BSP、Runx2等骨細(xì)胞標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)。

Chen等[12]應(yīng)用原子力學(xué)顯微鏡發(fā)現(xiàn)，伴隨hAFSC骨向分化，細(xì)胞內(nèi)的粗應(yīng)力纖維逐漸被成骨細(xì)胞內(nèi)特征性的細(xì)肌動(dòng)蛋白取代，hAFSC楊氏模量也隨細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重建而減小。

3 羊水來(lái)源干細(xì)胞組織工程支架研究

Li等[13]比較了6種常用組織工程支架PGA、PLGA5050、PLGA8515、PLLA、PCL和PDLLA，提示PLLA支架用于培植AFSC等間充質(zhì)干細(xì)胞有最高的擴(kuò)散率。

Kim等[9]應(yīng)用豬膀胱黏膜下膠原基質(zhì)與PLGA支架組成復(fù)合支架系統(tǒng)（BSM-PLGA），作為AFSC骨向分化的支架載體。PLGA的優(yōu)點(diǎn)是其超微結(jié)構(gòu)易控制，且其降解速度可以預(yù)測(cè)，能夠使降解速度同細(xì)胞滲透入新組織的速度相匹配；但PLGA缺少與細(xì)胞相兼容的表面結(jié)構(gòu)，限制了細(xì)胞濾過(guò)及黏附，包括限制生長(zhǎng)因子和其他生長(zhǎng)信號(hào)的分泌，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。豬膀胱黏膜下膠原基質(zhì)（BSM）是天然的生物活性物質(zhì)，主要含Ⅰ型、Ⅲ型膠原，其親水特性使其能夠增進(jìn)細(xì)胞的生存、黏附和擴(kuò)增；但作為骨細(xì)胞形成的載體，缺乏必需的支架結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)中，給予AFSC-復(fù)合支架系統(tǒng)骨向誘導(dǎo)分化，結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)成骨關(guān)聯(lián)基因RUNX2、OPN、OCN表達(dá)均上調(diào)，ALP活性和鈣含量增加，呈現(xiàn)出較高的礦化水平。實(shí)驗(yàn)提示，這類復(fù)合支架系統(tǒng)通過(guò)彌補(bǔ)彼此不足，為羊水來(lái)源干細(xì)胞的骨向分化提供了更合適的微環(huán)境，是AFSC骨向分化過(guò)程可供選擇的組織工程支架。

4 羊水來(lái)源干細(xì)胞骨向分化的其他誘導(dǎo)物質(zhì)

應(yīng)用地塞米松誘導(dǎo)AFSC骨向分化，AFSC支架復(fù)合物植入受區(qū)后，可能有骨組織缺損、甚至骨折的風(fēng)險(xiǎn)。目前，針對(duì)應(yīng)用其他誘導(dǎo)物質(zhì)行AFSC骨向分化已作了不同嘗試。

BMP是目前發(fā)現(xiàn)的唯一具有明確誘導(dǎo)作用，并能異位成骨的細(xì)胞因子。Sun等[14]以BMP-7（10%FBS加青霉素/鏈霉素、50 ng/L rhBMP-7、50μg/L抗壞血酸）分別誘導(dǎo)hAFSC-PLLA復(fù)合物和hMSC-PLLA復(fù)合物骨向分化。2周后，體外培養(yǎng)hAFSC-PLLA復(fù)合物即顯現(xiàn)更高的礦化水平，提示hAFSC較hMSC對(duì)BMP誘導(dǎo)的骨向分化具有更高的敏感性。

Janz等[15]應(yīng)用辛伐他汀及地塞米松（α-MEM培養(yǎng)基，含10-6 M辛伐他汀，100 nM地塞米松）為誘導(dǎo)物質(zhì)，維持24 d，體外誘導(dǎo)hAFSC骨向分化。經(jīng)RT-PCR分析提取mRNA，確認(rèn)OCN、OPN均完整表達(dá)。

Barba等[16]應(yīng)用LIM3蛋白（Lim Mineralization Protein 3）誘導(dǎo)hAFSC骨向分化，LIM-3通過(guò)抑制KLF基因表達(dá)，上調(diào)骨特異性轉(zhuǎn)錄因子、骨表面標(biāo)志物基因。LIM-3通過(guò)噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)24 h后，hAFSC細(xì)胞內(nèi)Krupple樣因子基因（KLF）表達(dá)就顯著降低（KLF-2、KLF-4）。hAFSC可能通過(guò)TGFβmiR143/145-KLF-4信號(hào)通路增加TGF-β的表達(dá)，增加BMP2、SMARCC2、Runx2、OP等骨表面標(biāo)志物的表達(dá)水平。

5 羊水來(lái)源干細(xì)胞骨向分化的應(yīng)用研究

Steigman等[17]對(duì)兔AFSC-PLLA支架復(fù)合物行體外骨向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，并設(shè)立體外培養(yǎng)14.6周及33.9周兩組進(jìn)行對(duì)照。實(shí)驗(yàn)中，將幼兔第2~3肋間隙部位的胸骨切除，同時(shí)將AFSC-支架復(fù)合物植入。術(shù)后兩個(gè)月未見(jiàn)不良反應(yīng)，Micro-CT掃描示修復(fù)區(qū)密度明顯增高；組織學(xué)表現(xiàn)為明顯的骨組織形態(tài)，移植區(qū)邊緣骨改建反應(yīng)活躍；細(xì)胞外間質(zhì)ALP反應(yīng)活躍。兩組對(duì)照未發(fā)現(xiàn)明顯差異。

Turner等[18]亦對(duì)兔AFSC-PLLA支架復(fù)合物行體外骨向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，19~20周后移植復(fù)合物入幼兔鼻骨缺損模型。實(shí)驗(yàn)中，相較于無(wú)細(xì)胞的PLLA支架，AFSC-PLLA支架復(fù)合物形成更為連續(xù)的礦化骨組織，提示AFSC骨向誘導(dǎo)分化可應(yīng)用于頜面部骨組織缺損后的重建。

Berardinelli等[19]對(duì)羊AFSC-富含Mg的羥磷灰石支架復(fù)合物行體外骨向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，21 d后，應(yīng)用于上頜竇提升術(shù)。實(shí)驗(yàn)顯示，AFMC增加了術(shù)后骨組織沉積、加快了血管組織生成反應(yīng)（細(xì)胞擴(kuò)增速率PI、VEGF表達(dá)、VA等均顯著提高）。

6 牙髓干細(xì)胞骨向分化的應(yīng)用及其同AFSC的比較

牙髓干細(xì)胞（DPSC）的傳代時(shí)間約為45 h，在30歲以上成人牙髓組織中僅有少量存在[20]。體外培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞骨向分化除了表達(dá)OCN，還表達(dá)flk-1（VEGF-R2），使細(xì)胞骨與血管組織生成反應(yīng)增強(qiáng)[21]。Aquino等[22]在第三磨牙拔除術(shù)后患者的第二磨牙遠(yuǎn)中植入DPSC-膠原生物復(fù)合體。術(shù)后1年，拔牙區(qū)骨再生效果顯著。

Maraldi等[23]建立“全層顱骨缺損”鼠模型，而后以骨向分化DPSC-膠原支架復(fù)合物及AFSC-膠原支架復(fù)合物移植入缺損區(qū)修復(fù)顱骨缺損，實(shí)驗(yàn)中通過(guò)放射直視影像（RVG）檢查，對(duì)比修復(fù)效果。4周后，相較DPSC修復(fù)組，AFSC-膠原支架復(fù)合物修復(fù)區(qū)密度更高，表明AFSC的修復(fù)效果更佳。

7 小結(jié)與展望

羊水來(lái)源干細(xì)胞的屬性介于胚胎干細(xì)胞與成體干細(xì)胞之間，保留有與間充質(zhì)干細(xì)胞類似的未分化屬性，因其無(wú)致瘤性、不觸發(fā)同種異體免疫反應(yīng)而受到研究關(guān)注，而且不存在明顯的倫理沖突；并且較骨髓干細(xì)胞處于更少的分化狀態(tài)，易分化形成不同的細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，體外誘導(dǎo)分化AFSC可形成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞等。AFSC骨向分化的相關(guān)研究，未來(lái)可能的聚焦方向包括幾點(diǎn)，①AFSC的篩選方法：目前自羊膜腔中提取羊水后，大多以流式細(xì)胞儀分選間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物（CD29、CD44、CD73、CD105等[24]）陽(yáng)性的AFSC，以提高細(xì)胞純度。該方法的有效性取決于選取何種表面標(biāo)志物作為分選標(biāo)準(zhǔn)，而目前的選擇標(biāo)準(zhǔn)不盡相同。今后的研究應(yīng)明確AFSC分選的最優(yōu)化方案，降低AFSC的應(yīng)用成本，促進(jìn)相關(guān)研究的深入開(kāi)展。②明確同種異體骨向分化AFSC移植受區(qū)后可能形成的局部免疫反應(yīng)/機(jī)制：已有的報(bào)道提示，AFSC可能存在同種異體免疫抑制/促進(jìn)的特性[6]。明確移植后受區(qū)局部免疫反應(yīng)/機(jī)制，是臨床應(yīng)用人同種異體骨向分化AFSC行骨缺損修復(fù)的前提和基礎(chǔ)。③開(kāi)展適合AFSC骨向分化細(xì)胞支架的研究：適合AFSC骨向分化的細(xì)胞支架應(yīng)具有人為可控的降解速率，使體內(nèi)降解與新生骨組織生成時(shí)間相適宜，且空隙、表面適合骨細(xì)胞的分化、形成、增殖。④AFSC骨向分化的最合適誘導(dǎo)物：目前的實(shí)驗(yàn)研究顯示，骨形成蛋白、辛伐他汀、LIM-3蛋白等均能刺激AFSC骨向分化，但具體機(jī)制尚不明確。對(duì)其機(jī)制和信號(hào)通路的研究，有助于探尋AFSC體內(nèi)誘導(dǎo)分化的最合適誘導(dǎo)物。⑤明確AFSC骨向分化是否可對(duì)所有類型骨組織缺損進(jìn)行修復(fù)：AFSC骨向分化細(xì)胞是否同時(shí)適用于長(zhǎng)干骨、扁平骨和不規(guī)則骨的骨缺損修復(fù)，是今后需要積極開(kāi)展的，其臨床適應(yīng)證尚待動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。⑥AFSC與其他干細(xì)胞骨向分化的效果比較：目前關(guān)于AFSC與其他干細(xì)胞成骨研究的比較，主要以修復(fù)后的影像學(xué)比較為主[24]，關(guān)于多種骨向分化干細(xì)胞“成骨反應(yīng)”的速率與形成骨組織的質(zhì)量、植入受區(qū)后局部免疫反應(yīng)的差異等方面的研究仍有待開(kāi)展。

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Research Progress on Osteogenic Differentiation of Amniotic Fluid-derived Stem Cell

MIAO Zhe,SHI Jun.College of Stomatology;Department of Craniofacial Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine;Shanghai Key Laboratory of Stomatology,Shanghai 200011,China.Corresponding author:SHI Jun(E-mail:dr. shijun.oms@gmail.com).

【Summary】Amniotic fluid-derived stem cell is in a medium state between embryonic stem cell and adult stem cell, maintaining undifferentiated property.As not tumorigenic,its stem cell potentiality and immunomodulator properties make it an attractive candidate for cell therapy approaches.Till now,documented reports on the cell origin,characteristics,osteogenic differentiation,cultivation and its tissue engineering application have been raised,regarding the cell lineage as a reasonable source for bone-defect reconstruction.Hereby,a review paper is made to conclude research progress on osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cell.

Amniotic fluid-derived stem cell;Osteogenic differentiation;Tissue reconstruction

Q813.1+1

B

1673－0364（2014）05－0279－03

2014年5月12日；修復(fù)日期：2014年5月28日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.05.013

200011上海市上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔顱頜面外科，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

史?。‥-mail：dr.shijun.oms@gmail.com）。