高效液相色譜法測(cè)定甘草內(nèi)生真菌產(chǎn)蘆丁條件優(yōu)化的研究

馬正南，李勤凡，耿果霞

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.西藏林芝地區(qū)職業(yè)技術(shù)學(xué)校，西藏林芝860000）

甘草是一種重要的中藥，可以分離出內(nèi)生真菌，內(nèi)生真菌能產(chǎn)有關(guān)活性物質(zhì)如甘草酸、甘草次酸、黃酮、生物堿等多種成分，其中甘草酸和黃酮是最重要的活性成分。甘草酸具有抗病毒、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等作用。黃酮具有抗炎、抗病毒、利膽、強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等作用。甘草黃酮的獲得主要是從野生或者種植甘草中提取的。由于干旱、過(guò)度采挖等原因，造成甘草資源短缺，來(lái)源不足。所以，積極尋求一種新的黃酮來(lái)源是具有重大意義的研究工作。內(nèi)生菌是指在其生活史的部分或全部階段都生活在植物組織內(nèi)的細(xì)菌、真菌或放線菌，且不會(huì)引起植物病害。植物內(nèi)生菌能獨(dú)立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，是天然產(chǎn)物的重要來(lái)源和具有高度開(kāi)發(fā)價(jià)值的新型生物資源［1］，其次生代謝產(chǎn)物的檢測(cè)的常見(jiàn)方法有酶法、氣相色譜法以及高效液相色譜法（HPLC）。其中，HPLC由于樣品前處理簡(jiǎn)單、直接進(jìn)樣，更加快捷和準(zhǔn)確成為目前應(yīng)用最多的色譜分析方法［2］。蘆丁作為黃酮類的主要成分，很早就被通過(guò)層析色譜法從植物中分離［3］。有學(xué)者采用高效液相色譜法證明了植物的抗氧化性作用是蘆丁成分［4］，說(shuō)明蘆丁的作用以及通過(guò)HPLC 檢測(cè)蘆丁的可行性。但是目前尚未見(jiàn)關(guān)于HPLC 檢測(cè)植物內(nèi)生真菌產(chǎn)蘆丁的條件優(yōu)化的文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以甘草內(nèi)生菌的研究為依托，通過(guò)對(duì)不同流動(dòng)相、柱溫、流動(dòng)相流速、波長(zhǎng)、進(jìn)樣體積等條件的優(yōu)化篩選探索內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物中黃酮（主要是蘆?。┏煞諬PLC 測(cè)定最優(yōu)化組合條件，為后期通過(guò)微生物途徑開(kāi)發(fā)蘆丁來(lái)源提供更多新的候選資源以適應(yīng)生產(chǎn)需要，還可以為后續(xù)從其他植物（如槐米、黑麥等）利用HPLC 法篩選產(chǎn)蘆丁內(nèi)生真菌的研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘草內(nèi)生真菌處理樣品溶液制備：參照文獻(xiàn)的分離方法［5］從寧夏野生甘草中分離出內(nèi)生真菌，對(duì)分離的內(nèi)生真菌采用純化、純培養(yǎng)、刮菌絲、對(duì)菌絲進(jìn)行有效物質(zhì)的提取制備得到樣品提取液作為試驗(yàn)材料。

1.2 試劑與儀器

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品色譜級(jí)（≥98%），購(gòu)自阿拉丁試劑公司；色譜級(jí)甲醇，美國(guó)Fisher公司；乙腈，廣東光華科技股份有限公司。

美國(guó)Waters高效液相色譜儀；Breeze2工作站；Waters2489 紫外／可見(jiàn)光檢測(cè)器；Symmetry columns C18（5μm，4.6 mm ×250 mm）色譜柱。FR－200紫外可見(jiàn)成像分析儀（上海復(fù)日科技公司）；TE2101－L電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司

1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

用電子天平準(zhǔn)確稱取真空干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品4.2mg，用甲醇溶解，稀釋，配制成10mL含蘆丁0.42mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為母液。然后分別準(zhǔn)確移取0.25、2、1、0.5、0.25mL母液置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至0.5、5、5、5、5mL，得到濃度為0.21、0.168、0.084、0.042、0.021mg／mL的濃度梯度溶液，用0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾后備用。

1.4 試驗(yàn)方法

通過(guò)初步試驗(yàn)篩選出一株產(chǎn)蘆丁的甘草內(nèi)生真菌，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作為參照物，分別設(shè)定不同柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相、流動(dòng)相流速、進(jìn)樣量來(lái)進(jìn)行HPLC試驗(yàn)，找到HPLC篩選產(chǎn)蘆丁內(nèi)生真菌的優(yōu)化條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度變化對(duì)HPLC的影響

高效液相色譜設(shè)定條件為：流動(dòng)相流速1.0 mL／min，流動(dòng)相A：B ＝0.2：0.8，進(jìn)樣體積V＝10 μL 波長(zhǎng)λ＝260nm，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 溫度變化對(duì)HPLC的影響Table 1 Influence of temperature on HPLC

當(dāng)其他條件固定時(shí)隨著溫度的增加在檢測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)色譜柱的柱壓逐漸減少，由2329psi降低到1576psi。樣品和標(biāo)品的出峰保留時(shí)間逐漸提前，由7.1min提前到5.2min左右，并呈現(xiàn)規(guī)律性遞減。當(dāng)選取溫度為50 ℃時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的液相圖如圖1。

圖1 在50 ℃條件下蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和菌絲提取液的HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of standard rutin and mycelium extraction in 50 ℃

2.2 流動(dòng)相變化對(duì)HPLC的影響

高效液相色譜設(shè)定條件為：流動(dòng)相流速1.0 mL／min，流動(dòng)相A：B ＝0.2：0.8，流動(dòng)相A1為乙腈，流動(dòng)相A2為甲醇，流動(dòng)相B 為0.05%磷酸，進(jìn)樣體積V＝10μL 波長(zhǎng)λ＝260nm 柱溫T＝40℃，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 流動(dòng)相變化對(duì)HPLC的影響Table 2 Influence of mobile phase on HPLC

當(dāng)其他條件固定時(shí)根據(jù)流動(dòng)相極性大小關(guān)系改變流動(dòng)相會(huì)影響色譜圖的效果。當(dāng)選取甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)柱壓在3562psi－3655 psi范圍內(nèi)變化。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間也維持在2.5min左右。而換成是乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)柱壓在1859psi－1882psi范圍內(nèi)變化。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間也維持在5.8min左右。比較后發(fā)現(xiàn)，盡可能選取柱壓比較小、出峰時(shí)間比較延遲些的流動(dòng)相作為試驗(yàn)流動(dòng)相，所以盡可能選取乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，具體液相圖如圖2。

圖2 在流動(dòng)相為乙腈條件下蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和菌絲提取液的HPLC分析Fig.2 HPLC analysis of standard rutin and mycelium extraction in mobile phase of acetonitrile

2.3 流動(dòng)相A：B流速比例變化對(duì)HPLC的影響

流動(dòng)相流速為1.0mL／min。進(jìn)樣體積V＝10 μL 波長(zhǎng)λ＝260nm 柱溫T＝40 ℃（表3）。

當(dāng)其他條件固定時(shí)改變流動(dòng)相流速會(huì)影響色譜圖的出峰效果。當(dāng)改變流動(dòng)相A∶B流速時(shí)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)柱壓和出峰時(shí)間隨著流動(dòng)相比例逐漸增大而出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象。在流動(dòng)相比例為0.20∶0.80時(shí)出現(xiàn)最大出峰時(shí)間5.80min（圖3）。

表3 流動(dòng)相A∶B流速變化對(duì)HPLC的影響Table 3 Influence of mobile phase A∶B speed on HPLC

圖3 在流動(dòng)相比例為0.2∶0.8條件下蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和菌絲提取液的HPLC分析Fig.3 HPLC analysis of standard rutin and mycelium extraction in 0.2∶0.8of mobile phase

2.4 進(jìn)樣體積變化對(duì)HPLC的影響

高效液相色譜設(shè)定條件為：流動(dòng)相流速1.0 mL／min，流動(dòng)相A：B ＝0.2：0.8，波長(zhǎng)λ＝260nm柱溫T＝40℃，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

當(dāng)其他條件固定時(shí)改變進(jìn)樣體積后獲得的液相色譜圖和改變之前獲得圖基本一致。由此可以初步斷定進(jìn)樣體積的改變不會(huì)對(duì)液相色譜圖產(chǎn)生影響。所以在試驗(yàn)中為了方便條件統(tǒng)一，選取進(jìn)樣體積為20μL為合適的進(jìn)樣體積進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表4 進(jìn)樣體積變化對(duì)HPLC的影響Table 4 Influence of injection volume on HPLC

2.5 波長(zhǎng)變化對(duì)HPLC的影響

高效液相色譜設(shè)定條件為：流動(dòng)相流速1.0 mL／min，流動(dòng)相A：B ＝0.2：0.8，進(jìn)樣體積V＝10 μL 柱溫T＝40℃，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。

首先對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在紫外可見(jiàn)成像分析儀上進(jìn)行一次全波段掃描，從圖4可以看出，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)大約在260nm 和360nm。所以試驗(yàn)選取了這兩個(gè)波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表5 波長(zhǎng)變化對(duì)HPLC的影響Table 5 Influence of wavelength on HPLC

當(dāng)其他條件固定時(shí)改變檢測(cè)器的波長(zhǎng)后樣品和標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)柱壓和出峰時(shí)間幾乎沒(méi)有什么變化，一直持續(xù)在柱壓1575psi左右，出峰時(shí)間持續(xù)在5.20 min左右。

通過(guò)HPLC檢測(cè)，菌絲提取液在設(shè)定條件下與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間幾乎一致，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間是5.794min（圖6A），樣品出峰時(shí)間為5.813min（圖5B）。設(shè)定條件∶流動(dòng)相為A：乙腈、流動(dòng)相B∶0.05%磷酸、柱溫T＝50℃、流動(dòng)相比例有機(jī)相A（乙腈）：水相B（0.05%磷酸）＝0.20∶0.80、流動(dòng)相流速為1mL／min、波長(zhǎng)λ＝360nm、進(jìn)樣體積V＝20μL，得到的液相見(jiàn)圖5。

圖4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收光譜圖Fig.4 Ultra Violet Spectrophotometry of standard rutin

圖5 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和GC11a菌絲提取液的HPLC分析A.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品；B.GC11a菌絲提取液Fig.5 HPLC analysis of standard rutin and mycelium extraction of GC11aA.Standard of rutin；B.Mycelium extraction of GC11a

3 討論

植物歷來(lái)是篩選天然藥物最主要的原料，但是由于植物的過(guò)度使用，使得許多藥用植物瀕臨滅絕。為了解決資源問(wèn)題，藥用植物新資源研究的熱點(diǎn)已集中在藥用植物內(nèi)生真菌上［6］。研究結(jié)果表明植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分［7］。

近年來(lái)，利用內(nèi)生真菌獲得藥物活性成分的研究已經(jīng)有很多，但是，在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在利用高效液相色譜法進(jìn)行試驗(yàn)的同時(shí)，因?yàn)闂l件設(shè)置不同造成很多文獻(xiàn)報(bào)道的同一種物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不一致（主要是出峰時(shí)間不一致）。本試驗(yàn)中，首先從對(duì)溫度改變的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)奶岣邷囟瓤梢院芎玫慕档椭鶋?，從而延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，但另一方面考慮到甲醇等提取溶劑的溶沸點(diǎn)大小、液相色譜柱的溫度耐受程度和其他一些因素的影響，也不能無(wú)限制提高柱溫。所以，經(jīng)過(guò)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，比較好的柱溫應(yīng)該設(shè)定在50℃。從流動(dòng)相條件觀察發(fā)現(xiàn)，選取甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，柱壓較高，接近極限值4000psi，而乙腈作為流動(dòng)相時(shí)柱壓維持在1859 psi－1882psi范圍內(nèi)，所以為了保護(hù)色譜柱，延長(zhǎng)使用壽命，選擇乙腈作為流動(dòng)相。從流動(dòng)相比例變化情況看，隨著流動(dòng)相比例增大，柱壓和出峰保留時(shí)間呈現(xiàn)先低后高再低的規(guī)律，當(dāng)選取0.2∶0.8作為流動(dòng)相流速比例時(shí)有最大出峰保留時(shí)間出現(xiàn)，而且此時(shí)的柱壓也比較接近液相平衡基線時(shí)候的柱壓1800psi附近，所以應(yīng)該選擇流動(dòng)相流速比例為0.2∶0.8 的比例進(jìn)樣。從進(jìn)樣體積變化和波長(zhǎng)變化看，對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間以及柱壓都幾乎沒(méi)有影響，但是從液相圖中樣品的出峰面積來(lái)看，選擇360nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)比較有利于分離樣品。所以選取20μL作為進(jìn)樣體積、波長(zhǎng)選取360nm 作為掃描波長(zhǎng)。

在本試驗(yàn)中，通過(guò)建立高效液相色譜法定性定量檢測(cè)內(nèi)生真菌產(chǎn)蘆丁的優(yōu)化組合方法，制定最優(yōu)組合（波長(zhǎng)、流動(dòng)相、流速等因素）的試驗(yàn)方法，使得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有科學(xué)性，最大限度排除因試驗(yàn)設(shè)置條件造成的實(shí)驗(yàn)誤差，為后續(xù)相關(guān)科研研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

由本試驗(yàn)可以得出，高效液相色譜法定性定量檢測(cè)內(nèi)生真菌產(chǎn)蘆丁的優(yōu)化組合方法條件為：流動(dòng)相A 為∶乙腈、流動(dòng)相B 為∶0.05%磷酸、柱溫T＝50℃、流動(dòng)相比例有機(jī)相A（乙腈）：水相B（0.05%磷酸）＝0.20∶0.80、流動(dòng)相流速為1mL／min、波長(zhǎng)λ＝360nm、進(jìn)樣體積V＝20μL。

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