抗菌肽對發(fā)酵床飼養(yǎng)仔豬生長性能、消化酶及墊料理化性質(zhì)的影響

白建勇，宦海琳，閆俊書，溫 超，周巖民，周維仁，＊

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇南京210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇南京210014）

抗生素的長期使用引起的細(xì)菌耐藥性和藥殘問題已受到廣泛關(guān)注，許多國家已禁止在飼料中使用抗生素，因此，抗生素替代物的研發(fā)受到高度重視?？咕氖菑V泛存在于動物、植物、微生物等大多數(shù)生物體內(nèi)的天然防御性多肽［1］，其主要特點(diǎn)是不易產(chǎn)生耐藥性，另外還有分子量小、抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)［2］?？咕闹饕峭ㄟ^物理性機(jī)制發(fā)揮作用，其攜帶的正電荷與病原菌細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷產(chǎn)生靜電吸引，使抗菌肽分子聚集在病原菌細(xì)胞膜表面形成離子通道或破壞細(xì)胞膜［3］，從而殺滅病原菌。發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)是以微生物發(fā)酵分解墊料和豬糞便為基礎(chǔ)的一種“零排放”養(yǎng)殖模式，此模式符合豬的拱食習(xí)性，能夠提高仔豬免疫力［4］，改善豬舍環(huán)境及豬肉品質(zhì)［5］，而飼料成分可能影響墊料的性質(zhì)。目前，研究發(fā)酵床飼養(yǎng)模式下飼糧中添加抗菌肽對仔豬及墊料的影響鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)以發(fā)酵床飼養(yǎng)模式為基礎(chǔ)，以35日齡仔豬為研究對象，研究飼糧中添加抗菌肽對仔豬生長性能、腸道消化酶及墊料理化性質(zhì)的影響，以期為抗菌肽在發(fā)酵床養(yǎng)殖模式中的研究與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

抗菌肽由北京中農(nóng)穎泰生物技術(shù)有限公司提供（活性單位為1.0×106U／g）；試驗(yàn)所用抗生素為桿菌肽鋅和硫酸黏桿菌素；發(fā)酵床菌種（主要為芽孢桿菌）由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所提供；發(fā)酵床墊料主要為稻殼、木屑（分別占50%左右）。

1.2 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧參照NRC（1998）豬的營養(yǎng)需要配制?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet（air－dry basis）

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)分為3組，具體分組如下：對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧；抗生素組在基礎(chǔ)飼糧中添加40 mg／kg桿菌肽鋅和20 mg／kg硫酸黏桿菌素；抗菌肽組在基礎(chǔ)飼糧中添加300mg／kg抗菌肽。

1.4 試驗(yàn)動物及其管理

將108頭35日齡，體重13kg左右的蘇鐘豬，按公母各半的原則，隨機(jī)分成3組，每組3重復(fù)，每重復(fù)12頭。自由采食及飲水。驅(qū)蟲、免疫及墊料維護(hù)按照常規(guī)程序進(jìn)行。預(yù)試期7d，正試期49d。試驗(yàn)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合基地發(fā)酵床豬場進(jìn)行。

1.5 樣品的采集與制備

在正試期第15d、35d、49d，于發(fā)酵床床面0～20cm 切面采集墊料樣本，裝于自封袋并放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，每欄（重復(fù)）豬舍分別取四周和中間共5個(gè)采樣點(diǎn)。于試驗(yàn)期第49d時(shí)，早上8：00空腹稱重，每重復(fù)選2頭豬進(jìn)行屠宰。分離胰腺，并取1g左右裝于凍存管在液氮中保存。分離十二指腸、空腸、回腸，將內(nèi)容物擠出裝于凍存管在液氮中保存，刮取十二指腸、空腸、回腸黏膜，裝于凍存管在液氮中保存。在測定之前，分別將胰腺、小腸黏膜、小腸內(nèi)容物加生理鹽水10倍稀釋在冰水浴中進(jìn)行機(jī)械勻漿，然后以4000r／min在4℃離心15min，取上清進(jìn)行各指標(biāo)的測定。

1.6 測定指標(biāo)及方法

1.6.1 生長性能 于正試期第1天早上8∶00進(jìn)行空腹稱重，每天記錄每個(gè)重復(fù)的采食量，于試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，早上8∶00 再進(jìn)行空腹稱重，并計(jì)算日采食量、日增重和料重比。

1.6.2 消化酶 淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶、黏膜二糖酶均采用試劑盒進(jìn)行測定（購于南京建成生物工程研究所）。

1.6.3 墊料蛋白酶 墊料中蛋白酶的測定采用滴定法［6］，根據(jù)每消耗0.2 mL 三氯化鐵溶液相當(dāng)于10個(gè)酪蛋白單位計(jì)算，以1g墊料的酪蛋白分解單位數(shù)表示蛋白酶的活性。

1.6.4 墊料脲酶 墊料中脲酶的測定采用比色法［6］，其原理為脲酶將尿素分解為氨，在堿性介質(zhì)中（以亞硝基鐵氰化鈉為催化劑）生成的氨與苯酚－次氯酸鈉反應(yīng)生成藍(lán)色的靛酚，生成的靛酚在波長578nm 處有最大吸收峰，且靛酚的量與氨的濃度成正比。脲酶活性以酶促反應(yīng)24h后，單位質(zhì)量墊料中銨態(tài)氮的毫克數(shù)表示。

1.6.5 墊料銨態(tài)氮 墊料銨態(tài)氮的測定采用2 M KCl浸提－靛酚藍(lán)比色法［7］。其原理為2 M KCl溶液能夠?qū)⑽皆趬|料膠體上的NH4＋及水溶性NH4＋浸提出來，銨態(tài)氮在強(qiáng)堿性介質(zhì)中與次氯酸鹽和苯酚反應(yīng)生成靛酚藍(lán)，在波長578nm 處吸光度與銨態(tài)氮成正比。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 2003 對原始數(shù)據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（one－way ANOVA），并用Duncan法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽對仔豬生長性能的影響

由表2可知，與對照組相比，飼糧中添加抗菌肽能夠在一定程度上提高仔豬平均日增重、平均日采食量，降低料重比，但差異均不顯著（P＞0.05），其中，平均日增重比對照組提高3.97%；抗生素組仔豬生長性能也比對照組有所提高（P＞0.05）。

2.2 抗菌肽對仔豬胰腺消化酶活性的影響

如表3所示，與對照組相比，飼糧中添加抗菌肽能夠極顯著提高仔豬胰腺中淀粉酶活性（P＜0.01）；胰蛋白酶活性比對照組、抗生素組分別提高12.76%、25.73%，但差異均不顯著（P＞0.05）；各組脂肪酶活性差異不顯著（P＞0.05）。

表2 抗菌肽對仔豬生長性能的影響Table 2 Effect of antimicrobial peptides on growth performance in piglets

表3 抗菌肽對仔豬胰腺消化酶活性的影響Table 3 Effect of antimicrobial peptides on the activity of digestive enzymes in pancreas of piglets

2.3 抗菌肽對仔豬小腸內(nèi)容物消化酶活性的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧中添加抗菌肽顯著提高了仔豬十二指腸內(nèi)容物淀粉酶、空腸內(nèi)容物淀粉酶和胰蛋白酶活性（P＜0.05）。

表4 抗菌肽對仔豬小腸內(nèi)容物消化酶活性的影響Table 4 Effect of antimicrobial peptides on the activity of digestive enzymes in intestinal digesta of piglets

2.4 抗菌肽對仔豬小腸黏膜二糖酶活性的影響

由表5可知，與對照組相比，飼糧中添加抗菌肽極顯著地提高了仔豬十二指腸黏膜麥芽糖酶的活性（P＜0.01），顯著提高了空腸黏膜麥芽糖酶、空腸黏膜乳糖酶以及回腸黏膜蔗糖酶的活性（P＜0.05）。與抗生素組相比，抗菌肽組十二指腸黏膜麥芽糖酶的活性極顯著地提高（P＜0.01）。

2.5 抗菌肽對發(fā)酵床墊料蛋白酶、脲酶活性及氨態(tài)氮含量的影響

但差異均不顯著（P＞0.05）；飼糧添加抗菌肽對墊料脲酶活力無顯著影響（P＞0.05），但抗菌肽組15 d、35d墊料脲酶活力比對照組分別提高12.82%、9.92%，到49d時(shí)二者基本相等；抗菌肽組全期墊料銨態(tài)氮分別比對照組提高12.65%、5.61%、3.34%，但均未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。

3 討論

如表6所示，試驗(yàn)第15d墊料蛋白酶活力以對照組最低，抗菌肽組最高，49d時(shí)以抗菌肽組最低，

3.1 抗菌肽對仔豬生長性能的影響

研究表明，傳統(tǒng)水泥地面飼養(yǎng)方式下飼糧中添加抗菌肽能提高斷奶仔豬生長性能［8－10］。而針對飼養(yǎng)方式的研究表明，發(fā)酵床養(yǎng)豬能夠提高豬的生長性能［11－12］。本試驗(yàn)中仔豬生長性能以對照組最差，抗生素組最好，抗菌肽組居中，這與程蕾等［13］的研究結(jié)果類似，說明在發(fā)酵床飼養(yǎng)模式下，飼糧中添加抗菌肽對仔豬生長性能有提高的趨勢。

表5 抗菌肽對仔豬小腸黏膜二糖酶活性的影響Table 5 Effect of antimicrobial peptides on the activity of disaccharidase in intestinal mucosa of piglets

表6 抗菌肽對發(fā)酵床墊料蛋白酶、脲酶及氨態(tài)氮的影響Table 6 Effect of antimicrobial peptides on the activity of enzymes and the content of ammonium in fermentation bed litters

3.2 抗菌肽對胰腺和小腸內(nèi)容物中消化酶的影響

進(jìn)入消化道的營養(yǎng)物質(zhì)主要是在酶的作用下被消化［14－15］，而胰腺和小腸內(nèi)容物中消化酶活性是衡量機(jī)體消化能力的最佳指標(biāo)之一［16］。都海明等［17］報(bào)道，飼糧中添加4 000U／kg的抗菌肽能夠顯著提高肉雞十二指腸和空腸內(nèi)容物中脂肪酶活性，蛋白酶活性也有升高趨勢。而何林丹等［18］的研究結(jié)果顯示，抗菌肽對粵黃雞小腸內(nèi)容物中淀粉酶和蛋白酶活性無顯著影響。本研究表明，與對照組比，飼糧中添加抗菌肽能夠顯著提高發(fā)酵床仔豬胰腺、十二指腸內(nèi)容物及空腸內(nèi)容物中淀粉酶的活性，顯著提高空腸內(nèi)容物中胰蛋白酶的活性。胰液的分泌受十二指腸黏膜中肽類激素的調(diào)節(jié)，而腸黏膜完整性是保證此類激素正常分泌的先決條件［14－15］；抗菌肽能夠抑制腸道有害微生物的生長繁殖［19－21］，提高腸黏膜免疫力［22］，維持腸黏膜的完整性［23－25］，提高腸道消化能力，從而間接促進(jìn)胰腺消化酶的合成與分泌，但其具體作用機(jī)理尚不清楚。本試驗(yàn)中，抗菌肽組空腸內(nèi)容物胰蛋白酶活性顯著提高，而胰腺中胰蛋白酶活性卻未達(dá)到顯著水平，這可能與對照組和抗菌肽組仔豬腸道內(nèi)有益菌的數(shù)量不同有關(guān)。

3.3 抗菌肽對仔豬小腸黏膜二糖酶的影響

碳水化合物的最終消化階段發(fā)生在小腸黏膜上皮細(xì)胞表面，淀粉等多糖分解產(chǎn)生的二糖只有在黏膜二糖酶的作用下再次分解為單糖才能被機(jī)體吸收［26］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，相比于對照組，飼糧中添加抗菌肽能夠極顯著提高仔豬十二指腸黏膜麥芽糖酶活性，顯著提高空腸黏膜蔗糖酶、乳糖酶活性，顯著提高回腸黏膜蔗糖酶活性?？咕奶岣咝∧c黏膜二糖酶活性的具體作用機(jī)制尚不清楚，但可能與抗菌肽能夠維持腸壁和腸黏膜的完整性有關(guān)。抗菌肽能夠增加腸道成熟細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)腸道的發(fā)育［27］，而黏膜二糖酶正是由成熟的腸上皮細(xì)胞合成［26］?？咕倪€可能通過提高小腸絨毛高度、增加腸黏膜上皮表面積來提高黏膜上皮細(xì)胞數(shù)量［24－25，28］，從而促進(jìn)二糖酶的分泌。同時(shí)，抗菌肽能夠抑制有害菌繁殖，降低有害代謝產(chǎn)物對腸黏膜的刺激［19，29］，也有利于腸黏膜結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。另外，小腸中淀粉酶活性的提高，促進(jìn)淀粉分解為麥芽糖，使二糖酶相應(yīng)底物量增加，根據(jù)“酶－底物”理論，小腸黏膜上皮細(xì)胞必須分泌更多的二糖酶來適應(yīng)消化的需要［30］。

3.4 抗菌肽對發(fā)酵床墊料蛋白酶、脲酶的影響

蛋白酶能夠?qū)|料中的蛋白質(zhì)分解為小肽、氨基酸等小分子物質(zhì)，脲酶能夠?qū)⒛蛩胤纸鉃榘薄⒍趸己退?。墊料中蛋白酶和脲酶是由微生物合成，二者與墊料氮素轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，其活性的高低能夠反映墊料糞便的降解速率［31］。尹紅梅［32］在室內(nèi)模擬條件下，將微生物制劑接種到鋸木屑－稻殼墊料中，發(fā)現(xiàn)接種組比未接種組蛋白酶、脲酶活性都顯著提高，說明墊料中蛋白酶和脲酶來源于微生物。同時(shí)，仔豬發(fā)酵床墊料中的芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶和脲酶［33］。本研究結(jié)果顯示，飼糧中添加抗菌肽對發(fā)酵床墊料蛋白酶和脲酶活性無不良影響，說明飼糧中抗菌肽的利用不會影響墊料的微生態(tài)平衡，不會降低墊料對糞便的降解效率。

3.5 抗菌肽對發(fā)酵床墊料銨態(tài)氮含量的影響

銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、氨氣氮、氧化氮是墊料中無機(jī)氮的主要存在形式［34］。銨態(tài)氮能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NH3。通常用銨態(tài)氮來反映墊料中NH3的生成狀況。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧中添加抗菌肽使發(fā)酵床墊料中銨態(tài)氮含量有上升的趨勢。脲酶能夠?qū)⒛蛩胤纸獬砂保黾訅|料銨態(tài)氮含量［31］。而發(fā)酵良好的墊料中存在一定的孔隙，在有氧條件下硝化細(xì)菌能夠?qū)@態(tài)氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮或硝態(tài)氮［35］，同時(shí)，墊料中的有益菌如芽孢桿菌能以銨態(tài)氮和硝態(tài)氮為氮源直接將無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白［36］。本試驗(yàn)中抗菌肽組墊料銨態(tài)氮含量沒有比對照組顯著提高，說明飼糧中抗菌肽的利用不會影響墊料硝化細(xì)菌和芽孢桿菌的數(shù)量。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加300mg／kg的抗菌肽，能夠在一定程度上提高仔豬的生長性能；提高胰腺和小腸內(nèi)容物中淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性，提高小腸黏膜二糖酶活性；同時(shí)，不影響發(fā)酵床墊料蛋白酶、脲酶活性和墊料銨態(tài)氮含量。

［1］Diamond G，Beckloff N，Weinberg A，et al.The roles of antimicrobial peptides in innate host defense［J］.Current Pharmaceutical Design，2009，15（21）：2 377－2 392.

［2］Haug B E，Stensen W，Stiberg T，et al.Bulky nonproteinogenic amino acids permit the design of very small and effective cationic antibacterial peptides［J］.Journal of Medicinal Chemistry，2004，47（17）：4 159－4 162.

［3］Li Y，Qi X，Zhang Q H，et al.Overview on the recent study of antimicrobial peptides：origins，functions，relative mechanisms and application［J］.Peptides，2012，37（2）：207－215.

［4］符利輝，賀月林，陳 微.益生菌發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)養(yǎng)豬效果研究［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，31（3）：41－45.

［5］Groenestein C M，Van Faassen.Voiatilization of ammonia，nitrous oxide and nitric oxide in deep－litter systems for fattening pigs［J］.Journal of Agricultural Engineering Research，1996，65（4）：269－274.

［6］關(guān)松蔭.土壤酶及其研究方法［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1980.

［7］中國土壤學(xué)會農(nóng)業(yè)化學(xué)專業(yè)委員會.土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)常規(guī)分析方法［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1980.

［8］Andra J，Berning H O，Leippe M.Cecropins，antibacterial peptides from insects and mammals，are petently fungicidal against Candida albicants［J］.Medical Microbiology and Immunology，2001，189（3）：169－173.

［9］Robert B，Wang X R，Meegalla R L，et al.Mouseβ－defensin 3is an inducible antimicrobial peptide expressed in the peithelia of multiple organs［J］.Infection and Immunity，1999，67（7）：3 542－3 547.

［10］劉顯軍.抗菌肽和抗生素對斷奶仔豬生長性能的影響［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（7）：252－256.

［11］陳長樂.發(fā)酵床飼養(yǎng)模式對豬肉品質(zhì)、血液生化指標(biāo)及消化生理的影響研究［D］.福建福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2012.

［12］郭炎芳.發(fā)酵床養(yǎng)殖模式對豬舍環(huán)境及豬肉品質(zhì)的影響研究［D］.湖南長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［13］程 蕾，劉曉華，王肆玖，等.不同菌種和抗菌成分對生物發(fā)酵床養(yǎng)豬效果的影響［J］.長江大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，8（4）：226－229.

［14］Boron W F，Boulpaep E L.Medical Physiology［M］.Saunders：Elsevier Science，2003.

［15］Randall D.Animal Physiology［M］.New York：W H.Freeman and Company，2002.

［16］Krogdahla A，Sell J L.Influence of age on lipase，amylase activities in pancreatic tissue and intestinal contents of young turkeys［J］.Poultry Science，1989，68（11）：1 561－1 567.

［17］都海明.抗菌脂肽對AA 肉雞生產(chǎn)性能、養(yǎng)分消化率及抗氧化機(jī)能的影響［D］.江蘇南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［18］何林丹，溫劉發(fā)，鄧春柳，等.蠶抗菌肽AD－酵母制劑對粵黃雞腸道消化酶和飼料品質(zhì)的影響［J］.中國家禽，2004，26（7）：9－10.

［19］谷 娟.復(fù)合多肽對早期斷奶仔豬生長性能、血液理化指標(biāo)和腸道主要菌群數(shù)量的影響［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2013，25（3）：579－586.

［20］Hancock R，Rozek A.Role of membranes in the activities of antimicrobial cationic peptides［J］.Fems Microbiology Letters，2002，206（2）：143－149.

［21］Brogden K A.Antimicrobial peptides：pore formers or metabolic inhibitors in bacteria？［J］.Nature Reviews Microbiology，2005，3（3）：238－250.

［22］Allaker R P.Host Defence Peptide－a Bridge between the Innate and Adaptive Immune Responses［J］.Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene，2008，102（1）：3－4.

［23］彭 翔，孫全友，李 杰，等.抗菌肽和姜黃素對1～21日齡肉仔雞生長性能和免疫功能的影響［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，26（2）：474－481.

［24］劉莉如，楊開倫，滑 靜，等.抗菌肽對海蘭褐公雞小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)及免疫活性細(xì)胞數(shù)量的影響［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2013，25（1）：190－197.

［25］郭志強(qiáng)，楊奉珠，雷 岷，等.抗菌肽對肉兔小腸黏膜形態(tài)、盲腸菌群和免疫功能的影響［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2012，24（9）：1 778－1 784.

［26］陳 杰.家畜生理學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

［27］Kelsall B L，Strober W.Distinct population of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine peyper，s patch［J］.The Journal of Experimental Medicine，1996，183（1）：237－247.

［28］馬衛(wèi)明.豬小腸抗菌肽對雛雞的促生長作用及其機(jī)理初探［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（8）：1 723－1 728.

［29］劉莉如.抗菌肽對蛋用仔公雞血液免疫指標(biāo)和腸道菌群的影響［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2012，24（9）：1 812－1 818.

［30］周國城.酶－底物結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)［J］.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1977，9（1）：79－94.

［31］Tiquia S M.Evolution of extracellular enzyme activities during manure composting［J］.Journal of Applied Microbiology，2002，92：764－775.

［32］尹紅梅.發(fā)酵床微生物接種試驗(yàn)研究［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，31（6）：49－54.

［33］張慶寧，胡 明，朱榮生，等.生態(tài)養(yǎng)豬模式中發(fā)酵床優(yōu)勢菌群的微生物學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用研究［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（4）：99－105.

［34］Tiquia S M.Further composting of pig－manure disposed from the pig－on－litter（POL）system in Hong Kong［D］.香港：香港大學(xué)，1996.

［35］焦洪超，欒炳志，宋志剛，等.發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料基礎(chǔ)參數(shù)變化規(guī)律研究［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，33（10）：1 610－1 615.

［36］朱 玉.用于發(fā)酵床養(yǎng)殖的細(xì)菌分離鑒定及應(yīng)用效果研究［D］.四川雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.