濃縮蘋果汁生產(chǎn)過程中cAMP分布規(guī)律研究

冉仁森，郭玉蓉，劉永峰，仇農(nóng)學，牛鵬飛

濃縮蘋果汁生產(chǎn)過程中cAMP分布規(guī)律研究

冉仁森，郭玉蓉，劉永峰*，仇農(nóng)學，牛鵬飛

（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710 062）

探究濃縮蘋果汁生產(chǎn)過程中3’,5’-環(huán)磷酸腺苷（3’,5’-cyclic adenosine monophosphate，cAMP）含量的分布規(guī)律。利用HPLC方法測定水浸提和乙醇浸提兩種不同方式處理榨汁后的蘋果果渣的cAMP含量和濃縮果汁中cAMP的含量，分析不同稀釋倍數(shù)、不同可溶性固形物含量的濃縮蘋果汁cAMP變化規(guī)律，并利用cAMP分配系數(shù)（DCcAMP）描述榨汁過程中cAMP含量的分布規(guī)律。結果表明：榨汁后蘋果果渣中cAMP含量為（63.444 1±2.323 6）?g/g，70°Brix的濃縮蘋果汁成品中cAMP含量為（58.611 3±1.349 3）?g/mL，30°Brix的濃縮蘋果汁半成品中cAMP含量為（12.018 3±0.583 9）?g/mL；建立了濃縮蘋果汁中cAMP含量與可溶性固形物含量之間的關系方程為y= 0.808 5x-1.218 5；測定得到70°Brix和30°Brix濃縮蘋果汁的DCcAMP分別為92%和19%。因此，在濃縮蘋果汁生產(chǎn)過程中，cAMP更趨向于存在蘋果果渣中，且濃縮工藝對cAMP有富集作用。

濃縮蘋果汁；蘋果果渣；cAMP；高效液相色譜

3’,5’-環(huán)磷酸腺苷（3’,5’-cyclic adenosine monophosphate，cAMP）溶于水，具有環(huán)狀結構，對酸、堿、熱都相當穩(wěn)定，不僅參與機體多種酶的代謝過程，對細胞的分裂、分化和發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用，而且還可調(diào)節(jié)基因的表達，促進mRNA的轉錄[1]。研究證實，cAMP作為肽類、兒茶酚胺和前列腺素等激素的“第二信使”發(fā)揮其生物效應[2]，具有中樞抑制作用、松弛平滑肌、擴張血管、抑制血小板聚集、抗炎、調(diào)節(jié)學習記憶等許多生物學功能[3-7]。自從cAMP被發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)生物體內(nèi)都含有cAMP[8-9]。對于紅棗中cAMP的研究，現(xiàn)已取得了一定的進展[10-11]。張明娟等[12]用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定了8 種棗果中cAMP的含量，cAMP含量最高為375.61 ?g/g，最低為46.01 ?g/g；張巖等[13]用HPLC測定濃縮棗汁中cAMP含量為4.56 mg/L；劉孟軍等[14]成功在棗果中提取了cAMP，這一項技術填補了國內(nèi)外天然cAMP提取的空白。然而，對于蘋果中cAMP的研究，幾乎是空白。1991年劉孟軍等[15]研究報道鮮蘋果中cAMP含量為（336.00±95.15）pmol/g，之后鮮有報道。另外，中國濃縮蘋果汁約占世界濃縮蘋果汁市場份額的50%以上，對于蘋果汁副產(chǎn)物進行綜合開發(fā)利用意義重大[16]。因此，本實驗對濃縮蘋果汁生產(chǎn)過程中濃縮蘋果汁半成品、成品、蘋果果渣中cAMP的含量進行了測定，對濃縮蘋果汁生產(chǎn)過程中cAMP的分布規(guī)律進行了探究，以期為蘋果榨汁工藝的改進和蘋果副產(chǎn)物資源的深度開發(fā)提供理論基礎和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅富士蘋果 陜西咸陽市禮泉縣。

cAMP標準品（純度≥99%，色譜純） 德國Sigma公司；甲醇（純度為99.8%，色譜純） 加拿大Promptar公司；乙醇、磷酸二氫鉀均為分析純。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀 美國Waters公司；色譜柱HC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美國Agilent公司；TU-2000型紫外-可見分光光度計 日本日立公司；旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；陜西師范大學濃縮蘋果汁生產(chǎn)線 無錫科安食品機械有限公司、上海神農(nóng)機械有限公司、南京開米科技有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 濃縮蘋果汁生產(chǎn)工藝

原料的前處理：挑選除去病蟲害、霉變的蘋果。

清洗：用鼓泡清洗機洗凈果皮上的泥沙和雜質(zhì)，并用清水淋洗。

破碎打漿：利用打漿機打漿，破碎粒度控制在4～9 mm。

酶解液化：蘋果漿進入酶解罐后，加入果漿酶至質(zhì)量濃度為200 mg/L，攪拌均勻，50～55 ℃保溫酶解40 min。

榨汁：蘋果漿酶解之后，利用帶式榨機進行榨汁，蘋果汁經(jīng)臥螺離心機分離。

前巴氏殺菌：蘋果汁溫度快速升高為85～95 ℃，保溫30 s，進行第一次巴氏殺菌，殺菌后將溫度快速降溫至50～53 ℃。

酶解、澄清：向50～53 ℃的蘋果汁中依次加入果膠酶和淀粉酶，使其質(zhì)量濃度分別達到220 mg/L和60 mg/L；保溫酶解60 min后，用碘試劑做淀粉檢測、酸化酒精做果膠檢測，均顯陰性時，開始超濾。

超濾：通過0.2 μm的超濾膜管進行超濾，超濾控制壓力小于0.065 MPa，截留分子質(zhì)量為60 kD，超濾后再用樹脂柱吸附。

濃縮：通過濃縮蒸發(fā)設備將蘋果汁濃縮至可溶性固形物含量為70°Brix。一效蒸發(fā)溫度為80～90 ℃，二效蒸發(fā)溫度為60～70 ℃，真空度為0.09 MPa。

后巴氏殺菌：對濃縮的蘋果汁進行第二次巴氏殺菌45 s，溫度為（85±2）℃。

無菌灌裝：殺菌后的濃縮蘋果汁溫度快速降至30 ℃，然后用自動化灌裝設備進行無菌灌裝。

貯存：0～5 ℃儲藏室內(nèi)存放。

1.3.2 濃縮蘋果汁生產(chǎn)過程中樣品的采集

實驗樣品分別在榨汁后、超濾后及貯存過程中采集。榨汁工藝完成后取樣，采集榨汁之后的蘋果果渣，稱為果渣樣本。超濾后蒸發(fā)、濃縮2 h左右得到可溶性固形物為30°Brix的濃縮蘋果汁，稱為濃縮蘋果汁半成品樣本。貯存過程中取樣，采集存放在儲藏室內(nèi)的最終灌裝的可溶性固形物為70°Brix濃縮蘋果汁，稱為濃縮蘋果汁成品樣本。

1.3.3 cAMP樣本溶液的制備

果渣樣本cAMP樣品溶液的制備：水浸提方法是按1∶20（m/V）加入蒸餾水，于40 ℃水浴環(huán)境下提取24 h，每隔8 h攪拌一次；乙醇浸提方法是按1∶20加入20%乙醇溶液，于40 ℃水浴環(huán)境下提取24 h，每隔8 h攪拌一次。兩種方法浸提完成后，將浸提液于（50±5）℃、0.096 MPa的條件下真空濃縮，冷卻至室溫后，定容至50 mL，放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

半成品樣本cAMP樣品溶液的制備：取濃縮過程中的濃縮蘋果汁半成品樣本，吸取5、2、1 mL樣本于10 mL容量瓶中，用流動相分別定容至刻度，分別獲得稀釋倍數(shù)為2、5、10 倍的半成品樣本cAMP樣品溶液，放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

成品樣本cAMP樣品溶液的制備：取濃縮后的濃縮蘋果汁成品樣本，吸取5、2、1 mL樣本于10 mL容量瓶中，用流動相分別定容至刻度，分別獲得稀釋倍數(shù)為2、5、10 倍的成品樣本cAMP樣品溶液，放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 不同樣本中cAMP含量的測定

1.3.4.1 色譜條件

色譜柱為HC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇與含0.05 mol/L磷酸二氫鉀的雙蒸水（10∶90，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：室溫；進樣量：20 ?L；檢測波長：259.00 nm。

1.3.4.2 蘋果中cAMP的定性檢測

采用保留時間法[17]，在相同的色譜條件下，以待測物質(zhì)的保留時間與標準品的保留時間相比對，相同的物質(zhì)應具有相同的保留時間，進行所要分析組分的定性。

1.3.4.3 繪制標準曲線

精密稱取cAMP標準品0.014 3 g，用雙蒸水溶解并定容至250 mL，搖勻得57.2 ?g/mL的儲備液，分別吸取5、15、25、35、45 mL的儲備液于50 mL容量瓶中，加流動相定容至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜。分別精密吸取系列標準溶液20 ?L注入色譜儀，記錄色譜圖。

1.3.4.4 果渣樣本中cAMP含量的測定

將水浸提蘋果渣所獲得的樣品溶液分為3 組，過0.45 μm濾膜，分別進樣測定；將20%乙醇浸提蘋果渣所獲得的樣品溶液分為3 組，過0.45 μm濾膜，分別進樣測定。根據(jù)式（1），計算出果渣樣品中cAMP含量（CS）。

式中：V為制備樣品溶液濃縮定容后的體積/mL；ρ為HPLC測定樣品溶液中cAMP的質(zhì)量濃度/（?g/mL）；m為制備樣品溶液所用樣品的質(zhì)量/g。

1.3.4.5 濃縮蘋果汁半成品、成品樣本中cAMP含量的測定

分別將半成品樣本cAMP樣品溶液、成品樣本cAMP樣品溶液過0.45 μm濾膜后，精密吸取20 ?L注入色譜儀，分別進樣測定。根據(jù)式（2）計算出果汁樣品中cAMP的含量（CL）。

式中：n為稀釋倍數(shù)；ρ為HPLC測定樣品溶液中cAMP質(zhì)量濃度/（?g/mL）。

1.3.5 蘋果cAMP分配系數(shù)的計算

借鑒雙水相體系中物質(zhì)的分配系數(shù)的定義[18]，濃縮蘋果汁和蘋果果渣中cAMP分配系數(shù)（DCcAMP）為單位體積濃縮蘋果汁中cAMP含量（CL）與單位質(zhì)量蘋果果渣中cAMP含量（CS）的百分比值，根據(jù)式（3）計算。

2 結果與分析

2.1 cAMP含量的測定

2.1.1 蘋果cAMP的定性檢測

圖1 cAMP標準品（A）、蘋果果渣（B）及濃縮蘋果汁（C）高效液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of cAMP standard (A), apple pomace (B) and apple juice concentrate (C)

由圖1可知，cAMP標準品保留時間為3.389 min，蘋果果渣樣品溶液中為3.363 min，濃縮蘋果汁樣品溶液中為3.362 min，樣品中與cAMP標準品的保留時間一致。而且，樣品中的目標峰與其他峰分離效果都較好，故證明樣品中的目標峰為cAMP峰。

2.1.2 不同樣本中cAMP的含量

表1 蘋果果渣中cAMP的含量Table 1 cAMP contents in apple pomace

由表1可知，用蒸餾水浸提制備樣品溶液，測定蘋果果渣中cAMP含量為（63.444 1±2.323 6）?g/g；用乙醇溶液浸提制備樣品溶液，測定蘋果果渣中cAMP含量為（44.706 4±1.672 9）?g/g。由此可見，不同的浸提方式對測定結果有所影響，用蒸餾水浸提測定的cAMP含量高于用20%乙醇溶液浸提測定的cAMP含量。導致水浸提方法cAMP含量較高的原因可能有：一是由于cAMP在水溶液中的溶解度比在一定體積分數(shù)乙醇溶液中的溶解度高；二是由于cAMP的6 種不同的分子結構在蒸餾水浸提液中的優(yōu)勢構象與乙醇溶液中的優(yōu)勢構象不同，溶劑化作用不同，所以測定結果有明顯差異。

表2 不同稀釋倍數(shù)濃縮蘋果汁中cAMP含量Table 2 cAMP contents in concentrated apple juice with different dilution facttoorrss

濃縮蘋果汁成品樣本經(jīng)稀釋10、5、2倍后，可溶性固形物含量為7、14、35°Brix；濃縮蘋果汁半成品樣本經(jīng)稀釋10、5、2倍后，可溶性固形物含量為3、6、15°Brix。由表2可知，可溶性固形物含量為70°Brix的濃縮蘋果汁中cAMP含量最高為（58.611 3±1.349 3）?g/mL，可溶性固形物含量為30°Brix的濃縮蘋果汁中cAMP含量最高為（12.018 3±0.583 9）?g/mL。表2同時也表明，成品、半成品濃縮蘋果汁中cAMP含量的測定結果均呈現(xiàn)隨著稀釋倍數(shù)增大而增大的趨勢?？扇苄怨绦挝锖繛?0°Brix的成品濃縮蘋果汁，cAMP含量隨著稀釋倍數(shù)增大而增大，當稀釋倍數(shù)為5～10 倍時，達到最大而趨于穩(wěn)定，且不同稀釋倍數(shù)cAMP含量差異不顯著（P＞0.05）?？扇苄怨绦挝锖繛?0°Brix的半成品濃縮蘋果汁， cAMP含量也隨著稀釋倍數(shù)增大而增大，當稀釋倍數(shù)為5～10 倍時，cAMP含量達到最大而趨于穩(wěn)定，且不同稀釋倍數(shù)cAMP含量差異不顯著（P＞0.05）?？梢?，在用HPLC檢測濃縮蘋果汁中cAMP含量時，需要至少稀釋5 倍才能進行測定。

圖2 不同可溶性固形物含量的濃縮蘋果汁中cAMP含量變化Fig.2 cAMP contents of in concentrated apple juice with different soluble solid contents

對半成品、成品濃縮蘋果汁用流動相分別稀釋10、5和2 倍，使可溶性固形物含量分別達到了3、6、15、7、14、35°Brix，因2倍稀釋倍數(shù)的HPLC測定結果差異較大（P＜0.05），所以去除15°Brix和35°Brix的檢測結果。由圖2可見，隨著可溶性固形物含量的增大，稀釋后濃縮蘋果汁cAMP的含量隨之增大。本研究擬合出了濃縮蘋果汁cAMP含量與可溶性固形物含量之間的方程y=0.808 5x－1.218 5（R2= 0.922 6）。從而，可以通過此方程，簡單推測出不同可溶性固形物的濃縮蘋果汁cAMP的含量。

2.2 蘋果cAMP分配系數(shù)的計算結果

根據(jù)蘋果DCcAMP的計算公式得到，30°Brix半成品濃縮蘋果汁DCcAMP為19%，70°Brix成品濃縮蘋果汁DCcAMP為92%?？梢?，70°Brix成品濃縮蘋果汁中DCcAMP明顯大于30°Brix半成品濃縮蘋果汁的DCcAMP。

3 討 論

3.1 不同可溶性固形物含量、不同稀釋倍數(shù)濃縮蘋果汁中cAMP的含量

濃縮蘋果汁的可溶性固形物含量不同，cAMP含量亦不同；濃縮蘋果汁稀釋倍數(shù)在一定范圍內(nèi)，濃縮蘋果汁可溶性固形物含量越大，cAMP含量越高。濃縮蘋果汁的可溶性固形物含量主要由葡萄糖、阿拉伯糖、果糖等單糖組成的多糖或是單糖構成，其中葡萄糖占絕大多數(shù)[19]。濃縮蘋果汁的可溶性固形物含量與生產(chǎn)工藝中的濃縮工藝密切有關，不同的濃縮工藝會生產(chǎn)出不同可溶性固形物含量的濃縮蘋果汁。另外，本研究所擬合的濃縮蘋果汁cAMP含量與可溶性固形物含量之間的方程y=0.808 5x－1.218 5，可用于預測已知可溶性固形物含量的濃縮果汁或稀釋果汁中cAMP的含量。因此，通過改進濃縮蘋果汁的生產(chǎn)工藝，用純水調(diào)整濃縮蘋果汁可溶性固形物含量，從而改善蘋果汁中cAMP的含量，達到改善蘋果汁營養(yǎng)價值的目的。

濃縮蘋果汁的稀釋倍數(shù)對cAMP含量的測定也有一定的影響，溶液中溶劑通過范德華力、電荷轉移相互作用、疏水力和氫鍵結合等分子間的相互作用產(chǎn)生溶劑效應來影響光譜吸收[20]。所以可能是由于隨著稀釋倍數(shù)的增大，濃縮蘋果汁中的可溶性固形物含量相對減小，從而使?jié)饪s蘋果汁體系中的糖、水等分子與cAMP分子之間的相互作用會大大減弱，以至于不再影響濃縮蘋果汁中cAMP含量的測定，這種現(xiàn)象可以稱之為糖的溶質(zhì)效應。因此，當濃縮蘋果汁稀釋5～10 倍時，cAMP含量的測定結果基本上沒有明顯變化。

3.2 濃縮工藝對cAMP分布規(guī)律的影響

在本研究中，濃縮蘋果汁生產(chǎn)過程中cAMP的分布規(guī)律用DCcAMP作為指標。DCcAMP直接反映了濃縮蘋果汁生產(chǎn)過程中cAMP的分布規(guī)律。DCcAMP越大，說明濃縮蘋果汁中cAMP占的比例越高，濃縮蘋果汁對cAMP的利用率越高；反之，DCcAMP越小，說明蘋果果渣中cAMP的比例越高，濃縮蘋果汁對cAMP的利用率越低。

由實驗結果可知，70°Brix濃縮蘋果汁的DCcAMP值為92%，遠大于30°Brix濃縮蘋果汁的DCcAMP值19%，這說明70°Brix濃縮蘋果汁中cAMP含量高于30°Brix的濃縮蘋果汁中的cAMP含量，濃縮蘋果汁的可溶性固形物含量越高，cAMP含量也可能越高。也就是說，濃縮工藝對cAMP有富集作用，這為生產(chǎn)高cAMP含量濃縮蘋果汁的生產(chǎn)工藝研究提供了理論依據(jù)。

4 結 論

以兩種浸提方式制備蘋果果渣樣品溶液，并利用HPLC測定蘋果果渣中cAMP含量：用蒸餾水浸提制備樣品溶液，測定蘋果果渣中cAMP含量為（63.444 1±2.323 6）?g/g；用20%乙醇溶液浸提制備樣品溶液，測定蘋果果渣中cAMP含量為（44.706 4±1.672 9）?g/g。

利用H P L C測定了濃縮蘋果汁中c A M P的含量，70°Brix的成品濃縮蘋果汁cAMP含量為（58.611 3±1.349 3）?g/mL；30°Brix的半成品濃縮蘋果汁cAMP含量為（12.018 3±0.583 9）?g/mL；分析了不同稀釋倍數(shù)、不同可溶性固形物含量的蘋果汁中cAMP的變化規(guī)律，擬合出了濃縮蘋果汁cAMP含量與可溶性固形物含量之間的方程y= 0.808 5x－1.218 5。

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Distribution of cAMP during Production of Concentrated Apple Juice

RAN Ren-sen, GUO Yu-rong, LIU Yong-feng*, QIU Nong-xue, NIU Peng-fei
(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

The distribution pattern of 3’,5’-cyclic adenosine monophosphate(cAMP) during the production of concentrated apple juice was investigated. HPLC was employed to determine the cAMP content in apple pomace left after juice extraction with water or aqueous ethanol and in concentrated apple juice. The change trend of cAMP content in concentrated apple juice was analyzed as a function of dilution factor and soluble solid content. Distribution coefficient (DCcAMP) was calculated to describe the distribution regularity of cAMP. The result showed that cAMP contents in apple pomace, 70 °Brix concentrated apple juice, and 30 °Brix concentrated apple juice were (63.444 1 ± 2.323 6) ?g/g, (58.611 3 ± 1.349 3) ?g/mL and (12.018 3 ± 0.583 9) ?g/mL, respectively. An equation indicating cAMP content (y) as a function of soluble solid content (x) in concentrated apple juice was established as follows: y = 0.808 5x - 1.218 5. Furthermore, the DCcAMPof 70 °Brix and 30 °Brix concentrated apple juice were 92% and 19%, respectively. Thus, during the production of concentrated apple juice, cAMP preferred to exist in apple pomace and could be enriched by the concentration process

apple juice concentrate; apple pomace; 3’,5’-cyclic adenosine monophosphate; HPLC

TS275.5

A

1002-6630（2014）09-0096-05

10.7506/spkx1002-6630-201409020

2013-07-03

陜西省科技計劃攻關項目（2012NY2-17）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（蘋果）產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（CARS-28）

冉仁森（1990—），男，本科，主要從事食品科學與營養(yǎng)學研究。E-mail：sankeshumy@163.com

*通信作者：劉永峰（1981—），男，副教授，博士，主要從事食品生物技術及營養(yǎng)學研究。E-mail：yongfeng200@126.com