參附注射液對(duì)膿毒癥大鼠外周血CD3⁺和γδT細(xì)胞的影響

金水芳 江榮林 邢茜 伍萬 朱美飛

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.12.012

基金項(xiàng)目：浙江省中醫(yī)藥防治重大疾病攻關(guān)計(jì)劃（2012ZGG001）

作者單位：310006杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

通信作者：江榮林，Email： jiangronglin@126.com

膿毒癥（Sepsis）是一種非常兇險(xiǎn)的疾病，是各種感染、重度燒創(chuàng)傷、休克及外科大手術(shù)后等臨床危急重癥患者常見的并發(fā)癥之一，其免疫功能常受到嚴(yán)重抑制，導(dǎo)致繼發(fā)嚴(yán)重感染。近年研究表明，膿毒癥的主要病機(jī)為邪毒內(nèi)陷、或內(nèi)傷臟氣、或亡津失血所致的氣機(jī)逆亂，正邪交爭(zhēng)，陽氣未復(fù)，陰經(jīng)耗損，正氣虛衰。參附注射液源于中藥湯劑參附湯，由人參和附子組成，具有益氣扶正，補(bǔ)氣通陽，使陽氣暢達(dá)的功效。參附注射液治療膿毒癥的療效已被既往研究證實(shí)，但其能否消除膿毒癥過程中的免疫抑制，尚未見報(bào)道。因此本研究通過檢測(cè)膿毒癥大鼠外周血CD3+和γδ T細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化，觀察參附注射液對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與分組

清潔級(jí)Sprague-Dawley（SD）大鼠80只，體質(zhì)量250～300 g，雌雄各半，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行，且經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。依照人與動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值，折算出中劑量治療組大鼠的給藥量。低中高3個(gè)劑量治療組按1∶2∶4比例分配。大鼠隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為假手術(shù)組、模型組、參附注射液低劑量治療組（5 mL/kg）、參附注射液中劑量治療組（10m L/kg）、參附注射液高劑量治療組（20 mL/kg），每組16只。

1.2藥物、試劑與儀器

參附注射液（紅參和附片，輔料聚山梨酯80）購自雅安三九藥業(yè)有限公司。大鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液LTS1083購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司;FITC-CD3和PE-TCR γ/δ 大鼠抗體購自美國(guó)BioLegend公司。Epics Altra流式細(xì)胞儀為美國(guó)BECKMAN COULTER公司生產(chǎn)。

1.3模型制備和給藥與處置

SD大鼠按照盲腸結(jié)扎穿孔法（cecal ligation and puncture， CLP）制備大鼠膿毒癥模型。步驟如下：大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水，選用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射法將大鼠麻醉，固定、備皮、消毒、鋪無菌洞巾，在腹部正中做一長(zhǎng)約1.5 cm的切口，暴露盲腸，在盲腸中外1/3處結(jié)扎，然后在被結(jié)扎盲腸的正中位置用16號(hào)針對(duì)穿2次，擠出少量糞便，還納盲腸，逐層縫合腹壁切口、皮膚，再次消毒切口周圍皮膚，術(shù)畢。建模過程中要確保每只大鼠的結(jié)扎位置和穿孔位置相似。假手術(shù)組開腹后僅翻動(dòng)十二指腸。實(shí)驗(yàn)后大鼠放回籠中喂養(yǎng)，可自由進(jìn)食和飲水。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)熱（肛溫超過自身正常對(duì)照值1 ℃）、心率加快（增加50%，或約2倍于自身正常對(duì)照值）、呼吸頻率增加（2倍于自身正常對(duì)照值）、白細(xì)胞總數(shù)變化（正常對(duì)照值的2倍或減少50%）等。按照造模成功標(biāo)準(zhǔn)確保動(dòng)物造模成功，觀察期間出現(xiàn)造模不成功或死亡的動(dòng)物被排除并重新造模補(bǔ)充。

假手術(shù)組及模型組大鼠于術(shù)后2 h給予生理鹽水20 mL/kg腹腔注射，各治療組在造模成功后2 h分別給予含量為5、10、20 mL/kg的參附注射液（用生理鹽水稀釋成20mL/kg）腹腔注射。全部大鼠禁食、自由飲水。各組分別于術(shù)后12 、24 h隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）處死8只大鼠，收集全血2 mL置于抗凝管，處理后送流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+、γδ T細(xì)胞百分率。

1.4血中CD3+和γδ T細(xì)胞檢測(cè)

將大鼠麻醉后，打開腹腔，分離腹主動(dòng)脈。取全血2 mL置于抗凝管中混勻，另取干凈離心管一支，加入2 mL淋巴細(xì)胞分離液，將2 mL全血沿管壁緩慢加入離心管中;采用密度梯度離心法1900 r/min離心25 min;取中間淋巴細(xì)胞層，用PBS稀釋至10 mL;再用1500 r/min離心10 min，棄上清，加入PBS 0.5 mL重懸;經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取流式試管，加入細(xì)胞懸液100 μL，加入抗體，混勻，冰上避光孵育30 min;洗滌后，4 ℃避光1 h內(nèi)送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件包，各組均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），均數(shù)間兩兩比較采用Scheffe法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠基本情況

假手術(shù)組大鼠麻醉清醒后，飲水、體溫正常，反應(yīng)靈敏，呼吸均勻平穩(wěn)，被毛順滑有光澤，喜扎堆取暖，大便正常。模型組大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)活動(dòng)呆滯、嗜睡、豎毛、呼吸急促、腹脹等現(xiàn)象并逐漸加重，CLP術(shù)后12 h內(nèi)，存活大鼠軀體蜷縮，精神萎靡，基本無活動(dòng)，不進(jìn)水，對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍。12 h后開始有少量活動(dòng)，呼吸較12 h前平穩(wěn)，少量飲水，被毛蓬松少光澤，大便稀軟。各個(gè)治療組大鼠的活動(dòng)性、反應(yīng)性以及飲水狀況明顯優(yōu)于模型組。

2.2各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血中CD3+細(xì)胞

百分率比較

術(shù)后12 h，假手術(shù)組和低、中、高劑量治療組術(shù)后外周血中CD3+細(xì)胞百分率分別為（31.6±6.8）%、（53.3±3.0）%、（54.3±7.0）%、（51.1±3.1）%，均高于模型組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。術(shù)后24 h，假手術(shù)組和低、中、高劑量治療組術(shù)后外周血中CD3+細(xì)胞百分率分別為（55.4±4.2）%、（48.5±4.8）%、（49.0±4.9）%、（49.1±8.6）%，均高于模型組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低、中、高劑量治療組外周血中CD3+細(xì)胞百分率相同時(shí)間點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P>0.05）。見表1。

2.3各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血中γδ T細(xì)胞百分率比較

術(shù)后12 h，假手術(shù)組和低、中、高劑量治療組術(shù)后外周血中γδ T細(xì)胞百分率分別為（4.64±0.30）%、（3.31±0.60）%、（3.38±0.19）%、（3.76±0.40）%，均高于模型組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。術(shù)后24 h，假手術(shù)組和低、中、高劑量治療組術(shù)后外周血中γδ T細(xì)胞百分率分別為（4.59±0.22）%、（3.06±0.42）%、（3.28±0.21）%、（3.64±0.31）%，均高于模型組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低、中、高劑量治療組外周血中γδ T細(xì)胞百分率相同時(shí)間點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P>0.05）。見表2。

3討論

重癥膿毒癥存在著患病率高、病死率高、治療費(fèi)用高的“三高”現(xiàn)象，已經(jīng)對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[1- 2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，在受到嚴(yán)重感染、外傷打擊后，機(jī)體可能開始處于一種免疫激活狀態(tài)，隨著病情的發(fā)展，則進(jìn)入免疫抑制狀態(tài)，促炎和抗炎介質(zhì)失去平衡而產(chǎn)生一系列連鎖反應(yīng)或瀑布效應(yīng)，最終將導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（MODS），所以消除免疫抑制狀態(tài)，提高免疫活性是治療膿毒癥的關(guān)鍵。

中醫(yī)藥學(xué)上，膿毒癥是邪毒內(nèi)陷、正邪交爭(zhēng)，陰經(jīng)耗損，正氣虛衰所致^[3-5]，治療以補(bǔ)氣溫陽為主，使陽氣暢達(dá)。膿毒癥患者本有正虛，猝然外邪侵襲，則正氣更虧虛，急用人參大補(bǔ)元?dú)?，固脫生津。選用附子取其回陽救逆、辛散通行諸經(jīng)。兩藥合用，補(bǔ)氣溫陽，急固欲散之氣，補(bǔ)充經(jīng)脈氣血，扶助正氣，有助驅(qū)邪外出。文獻(xiàn)[6-7]研究表明，參附注射液通過抑制炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8 過度表達(dá)，以其扶正固本功效應(yīng)對(duì)膿毒癥的虛證。以前的研究也證明了參附注射液可通過抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)控細(xì)胞炎癥因子，減輕和保護(hù)組織損傷，降低膿毒癥發(fā)生^[8-11]。

CD3是全部成熟T細(xì)胞的共同分化抗原， 表達(dá)于成熟T細(xì)胞表面。T細(xì)胞是一類重要的免疫活性細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。γδ T細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞的一個(gè)特殊亞群，在正常人外周血T淋巴細(xì)胞中一般不超過5%，但在表皮及腸黏膜組織中大量存在（約占40%），在病原菌感染狀態(tài)時(shí)活化和增殖，因此作為機(jī)體抵抗外界病原菌的第一道防線。文獻(xiàn)[12-14]研究發(fā)現(xiàn)γδ T細(xì)胞通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，在機(jī)體抗感染免疫、自身免疫疾病以及器官移植免疫耐受的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮重要作用。在腸道，γδ T細(xì)胞通過分泌白細(xì)胞介素2、4、6等細(xì)胞因子促進(jìn)黏膜淋巴組織中的B細(xì)胞活化、增殖，分泌大量抗原特異的sIgA，增強(qiáng)黏膜免疫，阻止病原菌的進(jìn)一步入侵，從而有力地調(diào)節(jié)著機(jī)體的免疫應(yīng)答的類型和強(qiáng)弱，協(xié)助αβ T細(xì)胞在特異免疫應(yīng)答中的功能發(fā)揮。本研究結(jié)果表明，膿毒癥模型組大鼠12 h和24 h的外周血中CD3+和γδT細(xì)胞百分率與假手術(shù)組比較均顯著降低（P<0.05），提示膿毒癥時(shí)其免疫功能受到抑制。而參附注射液可顯著提高CD3+和γδ T細(xì)胞百分率（P<0.05），提示其可促進(jìn)機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而改善其免疫保護(hù)作用。

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（收稿日期：2014-06-01）

（本文編輯：沈惠云）

p1355-1357