雞卵黃免疫球蛋白的糖基化及其構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展

佟晨瑤，賀真蛟，耿 放，馬美湖，黃 茜，蔡朝霞*

（國(guó)家蛋品加工技術(shù)研發(fā)分中心，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

雞卵黃免疫球蛋白的糖基化及其構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展

佟晨瑤，賀真蛟，耿 放，馬美湖，黃 茜，蔡朝霞*

（國(guó)家蛋品加工技術(shù)研發(fā)分中心，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

雞卵黃免疫球蛋白（egg yolk immunoglobulin，IgY）是雞卵黃中的一種免疫球蛋白。由于其具有原料易得、制備簡(jiǎn) 單、不與類風(fēng)濕因子以及哺乳動(dòng)物的補(bǔ)體發(fā)生交叉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，IgY是一種頗具潛力的抗生素替代品，但由于IgY性質(zhì)不穩(wěn)定，易受溫度、pH值、酶的影響，從而限制了其實(shí)際應(yīng)用。糖鏈在維持IgY理化性質(zhì)、抗原特性等功能中扮演著重要角色。因此，對(duì)IgY進(jìn)行糖基化修飾，從而改善其理化性質(zhì)和抗原特性，不僅能使雞蛋資源得到充分利用，也為開發(fā)蛋黃保健食品、添加劑以及相應(yīng)的醫(yī)藥產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。本文歸納幾種常見的IgY的糖基化方法，并論述IgY糖基化與其結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)之間的關(guān)系。

糖基化；雞卵黃免疫球蛋白；功能活性；構(gòu)效關(guān)系

蛋白質(zhì)糖基化是真核生物最重要的修飾之一，具體是指合成后的或正在合成的蛋白質(zhì)在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下將活化的糖加到肽鏈上的過程[1]。蛋白質(zhì)的糖基化不僅在維持空間構(gòu)象、穩(wěn)定糖蛋白結(jié)構(gòu)、保護(hù)其免受某些蛋白酶裂解、增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子的溶解性以及增加蛋白質(zhì)的生物半衰期等方面有重要作用，而且還能改變某些蛋白質(zhì)的生物活性和抗原特性。因此對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化修飾，具有十分重要的意義。

雞卵黃免疫球蛋白（egg yolk immunoglobulin， IgY）是一種在雞蛋黃里發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白，其結(jié)構(gòu)類似于哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白IgG，但相較于IgG，IgY具有無需采血，不與類風(fēng)濕因子、哺乳動(dòng)物的補(bǔ)體發(fā)生交叉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，另外，特異性IgY在中和蛇毒，抗輪狀病毒等方面也有廣泛的應(yīng)用[2-5]。一般情況下，當(dāng)其他哺乳動(dòng)物在對(duì)抗高度保守表位蛋白質(zhì)無法產(chǎn)生免疫應(yīng)答時(shí)，由于鳥類和哺乳動(dòng)物物種間的隔離，IgY有可能可以產(chǎn)生應(yīng)答[6]。對(duì)IgY進(jìn)行糖基化修飾，可以改善其對(duì)熱、酸度、酶解的穩(wěn)定性和免疫活性，從而拓展其應(yīng)用領(lǐng)域，并為IgY代替哺乳動(dòng)物的IgG提供一定的理論基礎(chǔ)。因此，IgY的糖基化修飾具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 蛋白質(zhì)的糖基化方法

蛋白質(zhì)糖基化修飾的常用方法有3種，分別是隨機(jī)的會(huì)聚式糖基化反應(yīng)、化學(xué)選擇性及位置專一性的糖基化反應(yīng)、定點(diǎn)突變型的糖基化反應(yīng)[7-8]。

1.1 隨機(jī)的會(huì)聚式糖基化反應(yīng)

隨機(jī)的會(huì)聚式糖基化反應(yīng)是通過化學(xué)反應(yīng)，對(duì)蛋白質(zhì)糖鏈上的某類官能團(tuán)進(jìn)行糖基化修飾，產(chǎn)生一組糖基化位點(diǎn)不確定的混合物。主要包括2-亞氨基甲氧基甲基硫苷法[9]、還原型胺化法[10]和美拉德反應(yīng)[11]。前兩種方法都是通過將糖基連接到賴氨酸殘基上來實(shí)現(xiàn)的。2-亞氨基甲氧基甲基硫苷法，即把2-亞氨基甲氧基甲基硫苷連接到蛋白表面賴氨酸上[9]。還原型胺化法是在還原劑作用下，糖還原端醛基和蛋白中的氨基縮合形成希夫堿，生成穩(wěn)定的擬糖蛋白的過程[10]。美拉德反應(yīng)是隨機(jī)會(huì)聚式糖基化反應(yīng)中的主要類型，在此反應(yīng)中，蛋白質(zhì)中的氨基與糖分子中的羧基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，不需要添加任何化學(xué)試劑作為催化劑，僅加熱就可使反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行。由于美拉德反應(yīng)機(jī)理十分復(fù)雜，其反應(yīng)歷程、產(chǎn)物的性質(zhì)及組成受到多種因素的影響，糖基化位點(diǎn)不易確定，但正因如此，該方法糖基化類型豐富，對(duì)蛋白質(zhì)的凝膠性、乳化性、過敏原性等多方面功能性質(zhì)均可產(chǎn)生影響，故應(yīng)用廣泛[11]。影響美拉德反應(yīng)的因素非常多，除了反應(yīng)物種類、反應(yīng)pH值和溫度以外，研究發(fā)現(xiàn)在真空中進(jìn)行糖基化比常壓下進(jìn)行糖基化效果要好，這主要是由于在真空中避免了不完整糖化作用、美拉德反應(yīng)末端終產(chǎn)物的生成、由于溶劑誘導(dǎo)使蛋白質(zhì)變性以及酶失活等問題[12]。

1.2 化學(xué)選擇性及位置專一性的糖基化反應(yīng)

化學(xué)選擇性及位置專一性的糖基化反應(yīng)是通過化學(xué)或酶法進(jìn)行糖基化修飾[7]。其中化學(xué)法是通過化學(xué)方法標(biāo)記肽鏈中需要反應(yīng)的位置或針對(duì)肽鏈的某個(gè)特異性基團(tuán)進(jìn)行糖基化[13]。該方法條件比較溫和，可以在不影響其他官能團(tuán)的情況下確定反應(yīng)位置[14]，并且能夠在蛋白骨架中導(dǎo)入非天然的氨基酸，在擬糖肽/擬糖蛋白藥物改造研究領(lǐng)域有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，但是由于其是通過化學(xué)方法合成，所以肽鏈的長(zhǎng)度受到限制[8]。酶法是糖基化工程研究中另一種重要的方法，具有高效、專一、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，催化反應(yīng)速度快，與化學(xué)法相比，所需酶量極其微小。但酶的價(jià)格昂貴，且很多酶法糖基化需要特定的識(shí)別序列，所以對(duì)很多蛋白質(zhì)不太可能適用[15]。

1.3 定點(diǎn)突變型的糖基化反應(yīng)

定點(diǎn)突變型的糖基化反應(yīng)是指通過定點(diǎn)突變技術(shù)改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，引入糖基化位點(diǎn)，從而改變蛋白質(zhì)的糖鏈[8]。Davis等[16]將分離純化后的糖鏈化合物通過一鍋法合成用于生物體硒代謝中硫硒鍵連接的擬糖蛋白。通過突變技術(shù)控制反應(yīng)位點(diǎn)，合成的糖蛋白和糖肽的長(zhǎng)度不受限制，可以直接作用于天然蛋白質(zhì)[17]。但由于很多蛋白質(zhì)氨基酸結(jié)構(gòu)和糖基化位點(diǎn)尚未清楚，蛋白質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系也未得到闡明，所以定點(diǎn)突變型糖基化存在一定的盲目性。

2 雞卵黃免疫球蛋白的糖基化及其構(gòu)效關(guān)系

2.1 雞卵黃免疫球蛋白和哺乳動(dòng)物IgG結(jié)構(gòu)比較

哺乳動(dòng)物體內(nèi)有5種免疫球蛋白，分別為IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，其中IgG是含量最高，也是研究最多的一種免疫球蛋白。IgY是唯一存在于雞卵黃中的免疫球蛋白，其結(jié)構(gòu)與IgG類似。

圖1A為IgG結(jié)構(gòu)，圖1B為IgY結(jié)構(gòu)[18]。IgG和IgY都是由4條鏈組成的，分別是兩條重鏈（H）和兩條輕鏈（L）。IgG分子質(zhì)量約為150 kD，其中重鏈約為55～77 kD，輕鏈約為25 kD。IgY分子質(zhì)量約為180 kD，其中重鏈約為67～70 kD，輕鏈約為22～30 kD[19]。IgG的重鏈由一個(gè)可變區(qū)（V）和3個(gè)恒定區(qū)（C）組成，而IgY的重鏈由一個(gè)可變區(qū)和4個(gè)恒定區(qū)組成。另外，IgY和IgG可分為兩個(gè)抗原結(jié)合片段（Fab）和一個(gè)可結(jié)晶片段（Fc）。

圖1 免疫球蛋白結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Structural analysis of immunoglobulins

2.2 雞卵黃免疫球蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)分析

免疫球蛋白作為一種糖蛋白，其絕大部分的糖鏈存在于重鏈的穩(wěn)定區(qū)[20]。糖鏈一般由甘露糖、半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰氨基半乳糖、唾液酸等構(gòu)成，此外還存在少量的巖藻糖。免疫球蛋白中的糖鏈數(shù)目、種類以及連接的位置都隨免疫球蛋白的種類而異。糖鏈一般連接在Ig的 Fab、Fc及絞鏈區(qū)。在IgG、IgA、IgD中，連結(jié)Fab與Fc的絞鏈區(qū)由二硫鍵形成；而IgE、IgM的絞鏈區(qū)含有N-聚糖和O-聚糖，這使得IgE和IgM的結(jié)構(gòu)缺乏柔韌性[21]。IgG只含2～3條N-乙酰氨基葡萄糖的聚糖，其含糖量最少；IgA和IgE含4～5條N-乙酰氨基半乳糖的聚糖；IgM每一條重鏈上含5個(gè)糖基化位點(diǎn)，主要存在于Fab區(qū)[20]。雖然IgG、IgM、IgE、IgA結(jié)構(gòu)相似，但是它們的糖基化位點(diǎn)各不相同。IgG其Fc區(qū)的Asn297含有唯一的N-糖基化修飾保守位點(diǎn)，其糖鏈由于核心七糖上連接的末端糖基不同而具有特異性[22]。位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)還推斷出在IgG重鏈的CH2/CH3表位，尤其是殘基362～365和550～553位點(diǎn)在IgG與受體交聯(lián)的反應(yīng)中起著不可忽視的作用[23]。IgM在CH3的Asn394有N-糖基化修飾位點(diǎn)，此位點(diǎn)是IgM唯一的高甘露糖型[19]。

Suzuki等[24]通過高效液相色譜-質(zhì)譜分析顯示IgY有單甘露糖化血紅蛋白、甘露糖寡糖、雙天線寡糖結(jié)構(gòu)，前兩種結(jié)構(gòu)是IgY不同于其他蛋白的主要糖型結(jié)構(gòu)。其中甘露糖型占37.2%，而Glc1Man8-9GlcNAc2占整個(gè)甘露糖型的71.2%，且IgY在Cv2和Cv3區(qū)的Asn308和Asn407有兩個(gè)潛在的N-糖基化修飾位點(diǎn)。

2.3 雞卵黃免疫球蛋白的糖基化與結(jié)構(gòu)、功能的關(guān)系

免疫球蛋白的糖基化在維持空間構(gòu)象、穩(wěn)定糖蛋白結(jié)構(gòu)方面起著重要作用。首先是具有一定氨基酸排列順序的多肽鏈需要進(jìn)一步折疊，形成一定空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子，才能發(fā)揮生物學(xué)功能。另外，在蛋白質(zhì)折疊的過程中，糖蛋白的糖基化位點(diǎn)起到關(guān)鍵作用。同時(shí)，Bechor等[25]在不影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的條件下選擇6個(gè)糖基化位點(diǎn)進(jìn)行糖基化，發(fā)現(xiàn)糖鏈的引入能夠增加蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并且這種穩(wěn)定性與糖基的數(shù)量成正比，受糖鏈大小影響較小。

另外，有學(xué)者比較了不同來源的免疫球蛋白（人、山羊、兔、鼠、水牛、雞卵黃）對(duì)果糖基化的敏感程度[26]。結(jié)果表明雖然不同來源的免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)都十分相似，但它們對(duì)果糖基化的敏感性程度卻各不相同。其中卵黃來源的IgY對(duì)果糖基化最為敏感，而山羊IgG最不敏感，說明糖基化程度可能是與免疫球蛋白暴露的氨基酸基團(tuán)有關(guān)。同時(shí)果糖基化后免疫球蛋白的活性發(fā)生了變化，推測(cè)原因是糖基化的位點(diǎn)會(huì)影響免疫球蛋白與抗原的結(jié)合能力。

蛋白質(zhì)表面的糖鏈還可覆蓋蛋白質(zhì)分子中的某些蛋白酶降解位點(diǎn)，從而增加了蛋白質(zhì)對(duì)于蛋白酶的抗性[27]。在膜型Ig（mIg）中，mIg在參與體液免疫的B細(xì)胞膜上有著嚴(yán)格的立體構(gòu)象，糖基化的程度不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致這種構(gòu)象的改變，就會(huì)直接降低其識(shí)別和結(jié)合抗原的能力[28]。當(dāng)糖基化程度較低時(shí)，會(huì)使mIg肽鏈缺乏剛性。而糖基化過度，就會(huì)遮住mIg的抗原結(jié)合位點(diǎn)，影響其與抗原的結(jié)合[29]。

2.4 雞卵黃免疫球蛋白的糖基化與理化性質(zhì)的關(guān)系

目前已有大量研究表明糖基化可提高蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，防止蛋白質(zhì)的相互聚集，主要是改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、對(duì)酶以及pH值的敏感性[30]。Pham等[31]于真空條件下將葡萄糖和酶進(jìn)行孵育，將葡萄糖共價(jià)連接到了蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基上，發(fā)現(xiàn)糖基化的胰蛋白酶仍然具有活性，糖基化的糜蛋白酶也保持在45%的活性，而未糖基化的胰蛋白酶和糜蛋白酶都已完全失活，表明了糖基化可使蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。Anbarasan等[32]發(fā)現(xiàn)經(jīng)糖基化修飾的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）具有8個(gè)N-連接的葡聚糖殘基，但是其熱穩(wěn)定性、活性不變。另有文獻(xiàn)表明蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性不僅和糖基化的狀態(tài)及種類有關(guān)，還和pH值有密切關(guān)系。Wang Wei等[33]發(fā)現(xiàn)在pH 4.0處糖基化，白介素2（interleukin 2，IL-2）突變蛋白其熱穩(wěn)定性會(huì)下降，而在pH 5.5處糖基化其熱穩(wěn)定性上升。這些研究成果證明糖基化對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有重要的影響。

隨著有關(guān)免疫球蛋白研究報(bào)道的增多，IgY以其獨(dú)特的免疫功能引起了越來越多的國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛重視。但是，作為一種非常有前景的抗生素替代物，IgY性質(zhì)不穩(wěn)定，易受溫度、酸堿、酶的影響，從而限制了IgY的實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域。IgY與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的IgG相比，其酸堿穩(wěn)定性遠(yuǎn)不如IgG，原因是IgY分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵較少[34]，且缺乏靈活的鉸鏈區(qū)域，這個(gè)不靈活的結(jié)構(gòu)也在哺乳動(dòng)物的IgE里被發(fā)現(xiàn)。因此，IgY表現(xiàn)出哺乳動(dòng)物體內(nèi)IgE和IgG共有的結(jié)構(gòu)特征，IgY的Fc區(qū)域的結(jié)構(gòu)分析也支持這一說法[35]。

3 結(jié) 語

我國(guó)雞蛋資源豐富，因此充分利用雞卵黃資源提取出免疫活性成分并使其穩(wěn)定性得到保護(hù)具有重大的經(jīng)濟(jì)及現(xiàn)實(shí)意義，不僅使雞蛋資源得到了充分利用，拓寬雞蛋的利用渠道，提高雞蛋的附加值，開拓市場(chǎng)，給雞殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，同時(shí)也為保健品市場(chǎng)提供功能性食品基料，為禽蛋功能性食品的開發(fā)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。目前對(duì)卵黃來源IgY的研究主要集中在制備、分離純化及其應(yīng)用上；而研究修飾結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性以及免疫活性關(guān)系尚少。由于IgY和IgG的相似性，隨著對(duì)IgG研究的深入，人們?cè)絹碓角宄匾庾R(shí)到免疫球蛋白糖鏈在維持其自身的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、抗原特性等功能中扮演重要角色。在實(shí)際應(yīng)用方面，雞卵黃免疫球蛋白的糖基化研究，在科學(xué)研究的基礎(chǔ)上為開發(fā)蛋黃深加工保健食品、添加劑以及醫(yī)藥產(chǎn)品提供了一定的科學(xué)依據(jù)，從而使我國(guó)蛋品資源的原料優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)，資源優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。

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Research Progress in the Glycosylation and Structure-Function Relationship of Chicken Egg Yolk Immunoglobulin

TONG Chen-yao, HE Zhen-jiao, GENG Fang, MA Mei-hu, HUANG Xi, CAI Zhao-xia*
(National R&D Center for Egg Processing, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Egg yolk immunoglobulin (IgY) is an antibody existing in the egg yolk. It is easy to be obtained and produced. Also, it does not interact with rheumatoid factors or activate mammalian complement. Therefore it has become a potentially promising alternative to antibiotics. However, the application of IgY is limited due to its susceptibility to temp erature, pH and enzymatic degradation. The glycan structure of IgY plays an important role in maintaining the structure, physicochemical properties, antigenic properties and other functions of IgY. Glycosylation in IgY can improve its physical and chemical properties, which not only makes egg resources to be fully utilized but also provides a scientific basis for the development of egg yolk as health food, additives and other pharmaceutically relevant products. This article reviews several approaches for IgY glycosylation and discusses the relationships between glycosylation and the structures and physicochemical properties of IgY.

glycosylation; chicken egg yolk immunoglobulins; functional activity; structure-function relationship

Q51

A

1002-6630（2014）05-0230-04

10.7506/spkx1002-6630-201405045

2013-09-12

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371810）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金優(yōu)秀人才培育項(xiàng)目（2013PY036）

佟晨瑤（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：tongchenyaoyy@163.com

*通信作者：蔡朝霞（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：caizhaoxia@mail.hzau.edu.cn