液化液代替液化糖生產(chǎn)林可霉素的研究

胡彪群，王筱蘭*，鐘益清，肖永梅

(1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌330022;2.江西國藥有限責(zé)任公司，江西南昌330052)

0 引言

林可霉素又稱潔霉素，是林肯鏈霉菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抗革蘭氏陽性菌的能力，主要作用于敏感菌核糖體的50S亞基，達(dá)到阻止肽鏈延長的目的，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成［1－3］.林可霉素與其他抗生素沒有交叉耐藥性，本身毒性較低，因此，林可霉素及其衍生物被廣泛用于醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)，是國內(nèi)外制藥企業(yè)重點(diǎn)生產(chǎn)的抗生素［4－6］.

目前，林可霉素發(fā)酵多采用液化糖，液化糖主要由企業(yè)自己生產(chǎn)，通過α－淀粉酶和糖化酶水解淀粉所得［7］，主要成分為還原糖.液化液是液化糖生產(chǎn)的中間產(chǎn)物，主要成分為糊精和低聚糖.淀粉要徹底糖化需多種水解酶、更多酶量、更長降解時(shí)間，因此，成本提高了.本文比較研究2種不同淀粉水解產(chǎn)物對(duì)林可霉素生產(chǎn)的影響，以期實(shí)現(xiàn)林可霉素生產(chǎn)成本降低和生產(chǎn)周期縮短的目標(biāo).

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

FUS－50L(A)自控發(fā)酵罐(上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司);Eclipse E200光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司);WZZ－2S數(shù)字式自動(dòng)旋光儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司).

豆餅粉、液化液、液化糖等發(fā)酵原材料均由江西國藥有限責(zé)任公司提供;其他化學(xué)試劑均為分析純.

1.2 菌種

Streptomyces lincolnensis 13由江西國藥有限責(zé)任公司提供.

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(質(zhì)量體積比):黃豆餅粉0.60%，可溶性淀粉1.50%，瓊脂1.80%，MgSO4·7H2O 0.05%，NaCl 0.05%，KH2PO40.05%，KNO30.01%，pH值為7.0～7.5.

種子培養(yǎng)基(質(zhì)量體積比):黃豆餅粉1.80%，可溶性淀粉1.50%，葡萄糖1.60%，玉米漿2.00%(體積比)，CaCO30.50%，(NH4)2SO40.30%，pH 值為7.0～7.5.

搖瓶培養(yǎng)基(質(zhì)量體積比):黃豆餅粉1.80%，可溶性淀粉1.50%，葡萄糖6.00%，玉米漿1.50%(體積比)，NaNO30.70%，(NH4)2SO40.80%，NaCl 0.50%，KH2PO40.05%，CaCO30.50%，pH 值為7.0～7.5.

15 L發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基(質(zhì)量體積比):黃豆餅粉2.00%，可溶性淀粉1.50%，葡萄糖3.50%，玉米漿1.50%，NaCl 0.40%，(NH4)2SO40.80%，KH2PO40.10%，CaCO30.50%，泡敵 0.03%～0.04%(體積比)，豆油0.02%～0.03%(體積比)，pH值為7.0～7.5.

50 L實(shí)驗(yàn)發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基(質(zhì)量體積比):黃豆餅粉2.00%，液化液6.00%，玉米漿1.50%(體積比)，NaCl 0.50%，(NH4)2SO40.20%，KH2PO40.02%，CaCO30.80%，泡敵0.03%～0.04%(體積比)，豆油0.02%～0.03%(體積比)，pH值為7.0～7.5.

50 L對(duì)照發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基(質(zhì)量體積比):黃豆餅粉2.00%，液化糖6.00%，玉米漿1.50%(體積比)，NaCl 0.50%，(NH4)2SO40.20%，KH2PO40.02%，CaCO30.80%，泡敵0.03%～0.04%(體積比)，豆油0.02%～0.03%(體積比)，pH值為7.0～7.5.

1.4 培養(yǎng)方法

斜面孢子培養(yǎng):將菌種從沙土管中接到斜面培養(yǎng)基于30℃恒溫培養(yǎng)7 d.

發(fā)酵種子培養(yǎng):將斜面孢子懸浮液接種到裝有30mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，于220 r·min－1、30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d.

搖瓶發(fā)酵:將10%接種量接種于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL 搖瓶中，于220 r·min－1、30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d.

15 L發(fā)酵罐上發(fā)酵:將10%搖瓶接種量接種于15 L發(fā)酵罐中，進(jìn)行二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，30℃恒溫培養(yǎng)2 d，罐壓為0.03～0.05 MPa，轉(zhuǎn)速為350 r·min－1.

50 L發(fā)酵罐上發(fā)酵:將15 L罐的種子按15%的接種量接種至50 L發(fā)酵罐中，30℃恒溫發(fā)酵8 d，罐壓為 0.03～0.05 MPa，轉(zhuǎn)速為 350 r·min－1.

1.5 分析方法

用旋光法測(cè)定生物效價(jià)［8－9］、斐林試劑法測(cè)定總糖與還原糖［10］、甲醛氧化法測(cè)定氨基氮［11］.采用美蘭染色法檢查菌絲形態(tài).取l0mL發(fā)酵液于3000 r·min－1、離心 10min，倒出上清液，計(jì)算濕菌體濃度［12］.

2 結(jié)果與分析

2.1 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以液化液代替液化糖發(fā)酵

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行林可霉素的發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)罐用液化液，對(duì)照罐用液化糖，其他成分、培養(yǎng)條件、接種量及菌種批次都相同.接種8 h后每隔8 h取樣，進(jìn)行總糖、還原糖、氨基氮、濕菌體濃度的測(cè)定及菌絲形態(tài)檢查.根據(jù)檢測(cè)到的還原糖和氨基氮含量進(jìn)行碳源和氮源的補(bǔ)充，還原糖濃度控制在3.2～8.0 g·L－1，氨基氮濃度控制在0.462～0.700 g·L－1.

如圖1(數(shù)據(jù)為3批實(shí)驗(yàn)平均值)所示，在基礎(chǔ)料中液化液的濕菌體濃度在前期比液化糖的低，但在中后期始終比液化糖的高.如圖2所示，24 h時(shí)實(shí)驗(yàn)罐的菌絲少，對(duì)照罐的菌絲多，但96 h時(shí)實(shí)驗(yàn)罐的菌絲比對(duì)照罐的菌絲多且菌絲舒展，168 h時(shí)實(shí)驗(yàn)罐及對(duì)照罐的菌絲都開始自溶，林可霉素生產(chǎn)能力下降.由此可知，基礎(chǔ)料中液化液在前期菌絲生長不如液化糖的快，但在中后期卻比液化糖的快.

圖1 實(shí)驗(yàn)罐和對(duì)照罐發(fā)酵過程中濕菌體濃度變化

接種40 h后每隔24 h進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，發(fā)酵效價(jià)變化情況如圖3所示(3批實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù))，發(fā)酵前期實(shí)驗(yàn)罐的發(fā)酵效價(jià)低于對(duì)照罐，但發(fā)酵中后期實(shí)驗(yàn)罐的效價(jià)高于對(duì)照罐.實(shí)驗(yàn)罐的最終放罐效價(jià)分別為6517、6398 和6300 μg·mL－1，平均值為 6405 μg·mL－1，對(duì)照罐的最終放罐效價(jià)分別為6018、5896和5777 μg·mL－1，平均值為5897 μg·mL－1，實(shí)驗(yàn)罐的平均發(fā)酵效價(jià)比對(duì)照罐的提高了8.6%.

2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基及補(bǔ)糖中均用液化液代替液化糖發(fā)酵

實(shí)驗(yàn)方法如本文2.1節(jié)所述，只是在進(jìn)行碳源補(bǔ)充時(shí)，實(shí)驗(yàn)罐用液化液，對(duì)照罐用液化糖.濕菌體濃度變化如圖4(數(shù)據(jù)為3批實(shí)驗(yàn)平均值)所示，結(jié)果和2.1節(jié)類似，此時(shí)實(shí)驗(yàn)罐中后期的濕菌體濃度略高于2.1節(jié)中的實(shí)驗(yàn)罐.如圖5所示，48、96和144 h時(shí)實(shí)驗(yàn)罐的菌絲均比對(duì)照罐的菌絲長得更好，菌絲更多、更舒展.

接種40 h后每隔24 h進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，發(fā)酵效價(jià)變化情況如圖6(3批實(shí)驗(yàn))所示，前期實(shí)驗(yàn)罐的發(fā)酵效價(jià)低于對(duì)照罐，但中后期實(shí)驗(yàn)罐高于對(duì)照罐.實(shí)驗(yàn)罐最終放罐效價(jià)分別為6789、6614和6511 μg·mL－1，平均值為 6638 μg·mL－1，對(duì)照罐最終放罐效價(jià)分別為6054、5875 和5789 μg·mL－1，平均值為5906 μg·mL－1，實(shí)驗(yàn)罐平均發(fā)酵效價(jià)比對(duì)照罐的提高了12.4%.

圖2 實(shí)驗(yàn)罐和對(duì)照罐菌絲形態(tài)

圖3 實(shí)驗(yàn)罐和對(duì)照罐3個(gè)批次的發(fā)酵效價(jià)

圖4 實(shí)驗(yàn)罐和對(duì)照罐發(fā)酵過程中濕菌體濃度變化

3 討論

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基或基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)糖中都用液化液代替液化糖生產(chǎn)林可霉素，通過濕菌體濃度檢測(cè)及菌絲形態(tài)顯微觀察，結(jié)果表明，40 h之前菌體長勢(shì)均沒有使用液化糖的好，這是因?yàn)橐夯哼€原糖很少，即遠(yuǎn)低于液化糖中的還原糖，而還原糖是林可霉素發(fā)酵中的速效碳源，在中后期使用液化液的發(fā)酵罐卻比使用液化糖的長勢(shì)更好，因?yàn)榱挚湘溍咕赡艽嬖诶枚替湹矸鄣拿赶担夯旱闹饕煞质呛偷途厶?，液化液中的速效碳源和持續(xù)碳源的比例相對(duì)于液化糖來說，可能更利于林肯鏈霉菌在發(fā)酵過程中的生長以及林可霉素的釋放.

圖5 實(shí)驗(yàn)罐和對(duì)照罐菌絲形態(tài)

圖6 實(shí)驗(yàn)罐和對(duì)照罐3個(gè)批次的發(fā)酵效價(jià)

通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基及補(bǔ)糖中用液化液代替液化糖進(jìn)行林可霉素發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中用液化液代替液化糖進(jìn)行發(fā)酵，最終放罐平均發(fā)酵效價(jià)提高了8.6%;在基礎(chǔ)培養(yǎng)基及補(bǔ)糖中均用液化液代替液化糖進(jìn)行發(fā)酵，最終放罐平均發(fā)酵效價(jià)提高了12.4%.因此，使用液化液代替液化糖進(jìn)行林可霉素的發(fā)酵，可降低生產(chǎn)林可霉素的成本，提高效率及產(chǎn)能，今后將在生產(chǎn)上對(duì)該工藝進(jìn)行驗(yàn)證及完善.

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