蛇足石杉中石杉堿甲含量測定及其時空動態(tài)

賴 政，李希茜，2，汪 涯，顏日明，張志斌，朱 篤，*

(1.江西師范大學生命科學學院，江西省亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室，江西南昌330022;2.江西中醫(yī)藥大學科技學院，江西南昌330025;3.江西科技師范大學生命科學學院，江西省生物加工過程重點實驗室，江西南昌330013)

0 引言

石杉堿甲(HuperzineA，簡稱HupA)是20世紀80年代劉嘉森等從石杉科Huperiaceae石杉屬Huperzia Bemh珍貴藥用蕨類植物蛇足石杉［Huperzia serrata(thumb)Trex.］中率先分離獲得的具有抑制乙酰膽堿酯酶活性的新型石松類生物堿，是目前治療老年癡呆癥最具有前景的藥物之一［1-2］.由于其還不能工業(yè)化合成生產(chǎn)，目前幾乎全從石杉科植物蛇足石杉中提取，而蛇足石杉在自然界生長又極其緩慢，植株矮小，HupA含量極低，野生資源十分有限［3-4］.近年來，隨著國內(nèi)外市場對HupA需求的日益增大，蛇足石杉資源遭受了嚴重的破壞，進而使得自然資源變得極為緊缺［5］.鑒此，為使其得到合理有效的保護和科學持續(xù)的利用，開展高含量的優(yōu)質(zhì)種源勘探篩查對蛇足石杉人工繁育以及生物工程技術的研究運用都有重大意義.

目前，已有研究報道對我國蛇足石杉中HupA含量進行了初步的測定，但研究多為植株全株的含量測定，而有關植株不同組織部位及時期變化過程中HupA含量的研究較少，其中鮮見采集自我省植株的此類研究報道［6-14］.本研究采用HPLC法系統(tǒng)測定了江西廬山和井岡山蛇足石杉中HupA在不同時期和不同組織部位中的含量，在此基礎上探討蛇足石杉中HupA含量的時空動態(tài)變化規(guī)律，從而為勘探篩查高含量的優(yōu)良種源和確定合適的植株采收時機及采集部位提供科學參考依據(jù)，對實現(xiàn)有效保護和合理利用蛇足石杉資源具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 材料

供試蛇足石杉樣品分別于2013年的3月、6月、9月和12月采自江西廬山和井岡山，樣品采集的樣地及生境見表1.每次采樣均選擇長勢基本相同的植株隨機采集約20株，并經(jīng)江西廬山植物園張樂華研究員鑒定為蛇足石杉，現(xiàn)標本存放于江西師范大學江西省亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室.

1.2 儀器與設備

Waters1525高效液相色譜儀，Waters 2996二極管陣列檢測器.RE-25AA旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，KQ5200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，GG-17分液漏斗(四川蜀牛玻璃儀器)，電子天平CP114(奧豪斯儀器).

表1 蛇足石杉采樣地理位置及生境

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 參照馬曉強等［14］的方法，C18柱(5 μm，4.6mm ×150mm)，流動相:甲醇-水-三乙醇胺體積比為60.00∶40.00∶0.02，流速:0.5mL·min-1，柱溫 30 ℃，檢測波長310 nm，進樣量20μL，分析時間15min.

1.3.2 標準品溶液的制備 精密稱取HupA標準品5mg于10mL容量瓶中以甲醇溶解并定容，制備成 500 μg·mL-1貯備液，再分別稀釋成 10，20，40，60，80 μg·mL-1溶液.

1.3.3 供試品溶液的制備 將采集的新鮮蛇足石杉樣品洗凈并將根、莖和葉分開，置于50℃烤箱中烘至恒重，粉碎后過40目篩.加入2%的酒石酸30mL，浸泡過夜，超聲提取1 h，離心取上清液，取殘渣重復上述操作2次，合并濾液.濃縮濾液至原來體積的1/3，用氨水調(diào)pH值至9～10.再將上述溶液移至分液漏斗中，用氯仿反復萃取3次.合并氯仿相并濃縮至浸膏，再用10mL甲醇定容，HPLC測定前用0.22 μm濾膜過濾.

1.4 數(shù)據(jù)分析

對檢測獲得的數(shù)據(jù)，按照樣地和時期的不同進行歸類，用SPSS軟件分別進行單因素方差分析，用最小顯著差異法LSD檢驗差異顯著性.分析主要包括樣地內(nèi)不同時期植株組織中HupA含量差異性分析、不同樣地間相同時期植株中HupA含量顯著差異性分析，以及不同樣地間植株中HupA含量差異顯著性分析.

2 結果

2.1 色譜條件的優(yōu)化

參照馬曉強等的方法，在流動相中加入微量的三乙醇胺，并調(diào)低流速，以峰面積按外標法定量分析.蛇足石杉不同組織供試品溶液中HupA出峰時間與標準品溶液相吻合，出峰時間約為10.9min左右，在上述色譜條件下，各組分之間分離良好(見圖1).

圖1 標準品(A)和12月份廬山(B)及井岡山樣品(C)中HupA的HPLC分析圖譜

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系 取濃度分別為10、20、40、60、80 μg·mL-1的HupA標準品溶液，按本文1.3.1節(jié)所述，分別進樣20μL，測定峰面積.以HupA標準品峰面積為縱坐標(y)、HupA標準品濃度為橫坐標(x)制定標準曲線(圖2)，線性回歸方程:y=91403x+7920.2，R2=0.9921.結果表明，HupA 進樣量在10～80 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關系.

圖2 HupA標準曲線

2.2.2 精密度試驗 取40 μg·mL-1HupA標準品溶液，按本文1.3.1節(jié)所述，重復進樣6次，每次20μL，計算HupA色譜峰面積的相對標準偏差為2.8%，結果表明，儀器精密度良好.

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 隨機選取1份蛇足石杉供試樣品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h，在本文1.3.1 節(jié)所述色譜條件下分別進樣，計算HupA色譜峰面積的相對標準偏差為2.2%.結果表明，樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.2.4 重復性試驗 隨機選取6份蛇足石杉樣品，按本文1.3.3節(jié)的方法制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下分別進樣，計算HupA色譜峰面積的相對標準偏差為0.51%，結果表明，方法重復性良好.

2.2.5 回收率試驗 精密稱取已知HupA含量的蛇足石杉樣品6份，每份精密加入濃度為50 μg·mL-1的標準品溶液10mL，按1.3.3節(jié)方法制備供試品溶液，按1.3.1節(jié)色譜條件下進行分析測定，計算回收率，結果HupA的平均回收率為95.58%，相對標準偏差為1.36%(n=6)，實驗結果見表2.

表2 HupA加樣回收率實驗結果(n=6)

2.3 蛇足石杉中HupA含量的時空動態(tài)變化

采用線性回歸方程分別計算廬山和井岡山蛇足石杉不同時期、不同組織HupA含量，并進行方差分析.結果表明，江西廬山和井岡山蛇足石杉植株中HupA含量均較高，2個樣地的含量隨著時期的推移有統(tǒng)計學意義上極顯著性差異(P﹤0.01)，HupA含量的動態(tài)變化規(guī)律為12月﹥9月﹥6月﹥3月，且井岡山蛇足石杉植株中HupA含量顯著高于廬山植株(見圖3).此外，井岡山蛇足石杉在4個時期內(nèi)HupA含量均有統(tǒng)計學意義上極顯著性差異(P﹤0.01)，其中在12月份含量最高;而廬山9月和12月的蛇足石杉植株中HupA含量較高，但2個月份間無統(tǒng)計學意義上顯著性差異(P﹥0.05).

圖3 不同時期廬山和井岡山蛇足石杉植株HupA含量

研究結果還顯示，廬山和井岡山蛇足石杉均為地上部分(莖和葉)中的HupA含量高于地下部分(根)的含量，并且廬山和井岡山蛇足石杉在莖、葉及全株中HupA含量隨著季節(jié)的推移而呈現(xiàn)出相同的變化趨勢，它們的含量均為3月最低，依次分別為178.7、85.7、141.3 μg· g-1與 122.1、105.4、117.7 μg·g-1，而在 12 月達到最大，依次分別為246.0、188.1、211.9 μg· g-1與 369.6、298.9、325.9 μg·g-1(見圖4和圖5).根中 HupA含量的變化趨勢與莖和葉不同，2地蛇足石杉根中HupA含量均在 6月最低，分別僅為 24.5 μg·g-1和17.5 μg·g-1，廬山蛇足石杉根中 HupA含量在3月季最高，達到149.7 μg·g-1(見圖 4)，井岡山地區(qū)蛇足石杉根中 HupA含量在12月最高，達到97.1 μg·g-1(見圖 5).

3 討論

3.1 HPLC分析方法的改進

本研究中HupA含量的測定方法是在參照馬曉強等方法的基礎上，經(jīng)比較和優(yōu)化多種不同溶劑系統(tǒng)和比例的流動相后，最終確定甲醇-水-三乙醇胺按體積比60.00∶40.00∶0.02為流動相效果最好.采用該流動相，在流速為0.5mL·min-1時HupA主峰能與雜質(zhì)峰較好分離開，且峰型對稱無拖尾，重復性良好，適用少量樣品的定量分析檢測.

3.2 蛇足石杉中HupA含量的動態(tài)變化

圖4 廬山蛇足石杉不同時期根(A)、莖(B)、葉(C)中HupA含量

蛇足石杉中HupA的含量極少，在我國已報道的含量中平均值大約僅為 188 μg·g-1［15］，且不同地域的蛇足石杉中HupA含量也存在較大差異(見表3).本研究對江西廬山和井岡山蛇足石杉不同時期、不同組織部位中HupA含量進行了HPLC分析，結果顯示，采集自江西廬山和井岡山的蛇足石杉樣品中HupA的含量均較高，且均在12月達到最高，分別為 211.9 μg·g-1和 325.9 μg·g-1，可作為高HupA含量優(yōu)質(zhì)種源新的潛在資源.本研究發(fā)現(xiàn)蛇足石杉植株中HupA的含量動態(tài)變化規(guī)律為12月﹥9月﹥6月﹥3月，HupA含量隨季節(jié)更替而有相應的變化(見圖3)，這與馬曉強等報道的蛇足石杉中HupA含量隨時期變化研究結果基本一致，即在10月至12月的含量較高.本研究還發(fā)現(xiàn)HupA的含量在植株的地上部分(莖和葉)明顯高于地下部分(根)，這與文獻［7-8］的研究報道一致.上述的這些研究結果都為勘探篩選高HupA含量的優(yōu)質(zhì)蛇足石杉種源奠定了基礎，也為科學確定蛇足石杉的最佳采收時機和采集部位提供了參考依據(jù).

圖5 井岡山蛇足石杉不同時期根(A)、莖(B)、葉(C)中HupA含量

3.3 HupA含量差異的原因

在比較江西廬山和井岡山蛇足石杉中HupA含量時發(fā)現(xiàn)，井岡山植株中HupA含量顯著高于廬山植株(P﹤0.01)，這在一定程度上印證了不同地域來源的蛇足石杉植株中HupA含量存在一定的差異性.究其原因，生境條件可能是決定HupA含量高低的主要因素之一［16-17］.采樣的廬山蛇足石杉多分布在潮濕樹林群落下，而采樣的井岡山蛇足石杉多分布在山腳陰面，潮濕灌木下，靠近水源的公路巖石和青苔上，2地的生境條件有較大的差異(見表1).2地環(huán)境條件和生態(tài)氣候類型迥異，以及微環(huán)境的差異等因素長期共同自然選擇，極有可能導致蛇足石杉中HupA含量存在一定的差異.另外，蛇足石杉植株本身的遺傳因素同樣不能被忽視.文獻［16］對浙江、廣西和重慶3個居群的蛇足石杉引種至同一生境后，HupA含量基本與原先未引種時的含量一致，說明HupA含量的高低是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結果，因而選育高含量品系植株，同時選擇適宜的生境條件對于植株中HupA的累積具有積極的意義.

目前，HupA生產(chǎn)幾乎完全依賴野生蛇足石杉資源，價格昂貴，長期開采勢必破壞蛇足石杉天然資源和生態(tài)環(huán)境.因此，拓寬HupA來源和選擇新的途徑顯得尤為重要［18］.倘若能利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)HupA，不僅能豐富HupA的來源途徑、降低藥品價格，而且可以有效地保護生態(tài)環(huán)境.鑒此，本實驗室多年來一直致力于產(chǎn)HupA蛇足石杉內(nèi)生真菌的研究［18-23］，相關的深入研究現(xiàn)正在進行中.

表3 不同產(chǎn)地蛇足石杉中HupA含量

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