冰島刺參巖藻糖基化硫酸軟骨素對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟的保護(hù)作用

周曉春，王靜鳳，胡世偉，石 迪，薛長湖*

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

冰島刺參巖藻糖基化硫酸軟骨素對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟的保護(hù)作用

周曉春，王靜鳳，胡世偉，石 迪，薛長湖*

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

目的：研究冰島刺參巖藻糖基化硫酸軟骨素（fucolysated chondroitin sulfate from Cucumaria frondosa，Cf-CHS）對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟的保護(hù)作用。方法：以高脂高糖飼料飼喂誘導(dǎo)Ⅱ型糖尿病小鼠模型，飼喂含不同劑量Cf-CHS的高脂高糖飼料連續(xù)19 周，檢測空腹血糖并收集尿液，分別檢測小鼠尿液中尿糖、微量白蛋白（microalbumin，mAlb）、尿總蛋白、尿素氮（urea nitrogen，UN）、尿酸（uric acid，UA）、肌酐（creatinine，Cr）濃度和β-N-乙酰葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-glucosaminidase，NAG）排泄率，摘取腎臟觀察腎臟組織的顯微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：Cf-CHS可顯著降低糖尿病小鼠的尿糖、mAlb、尿總蛋白、UN、UA、Cr濃度和NAG排泄率（P＜0.01），改善腎臟組織的顯微結(jié)構(gòu)。結(jié)論：Cf-CHS可顯著改善糖尿病小鼠的腎臟功能。

糖尿病腎病；冰島刺參；巖藻糖基化硫酸軟骨素；尿蛋白；β-N-乙酰葡萄糖苷酶；腎臟保護(hù)

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥[1]，最終引起腎小球病變，目前已成為導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因之一。海參是傳統(tǒng)的珍貴滋補(bǔ)品，海參多糖是海參體壁的主要成分之一，包括巖藻糖基化硫酸軟骨素（fucolysated chondroitin sulfate，CHS）和海參巖藻聚糖硫酸酯兩類[2-3]。其中CHS是一種帶巖藻糖支鏈的酸性黏多糖，糖鏈上有部分羥基發(fā)生硫酸酯化（硫酸酯基類含量在32%左右）[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，海參CHS具有抗凝血[5]、抗血栓[6-7]和抗腫瘤[8-9]等生理活性，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、黏膜細(xì)胞、腎細(xì)胞等具有保護(hù)作用，且活性很大程度上與巖藻糖支鏈含量和硫酸基取代情況相關(guān)[9-11]。冰島刺參（Cucumaria frondosa）是產(chǎn)于冰島水域的深海野生海參，產(chǎn)量大，價(jià)格低廉，本課題組前期對(duì)不同種類海參體壁的CHS含量及單糖組成進(jìn)行了分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以冰島刺參為主的寒帶海參體壁含有豐富的CHS，巖藻糖含量較高[4]，提示其可能具有生理活性。Hu Shiwei等[12]以冰島刺參巖藻糖基化CHS（Cf-CHS）為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)其可以明顯改善Ⅱ型糖尿病小鼠的糖代謝。故本實(shí)驗(yàn)觀察Cf-CHS對(duì)糖尿病并發(fā)癥——糖尿病腎病有無影響，探討其對(duì)以高脂高糖飼料誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟的保護(hù)作用，以期進(jìn)一步發(fā)掘冰島刺參的營養(yǎng)保健作用，為其高值化利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

冰島刺參干品，購于青島市水產(chǎn)品市場。

1.2 動(dòng)物

C57BL/6J小鼠，雄性，體質(zhì)量19～21 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0007。

1.3 試劑

羅格列酮（rosiglitizone，RSG） 美國Sigma公司；氯化十六烷基吡啶（cetylpyridinium chloride，CPC） 生工生物工程（上海）股份有限公司；葡萄糖試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；肌酐（creatinine，Cr）、尿素氮（urea nitrogen，UN）、尿酸（uric acid，UA）、β-N-乙酰葡萄糖苷酶（N-acetyl-βglucosaminidase，NAG）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；尿微量白蛋白（microalbuminuria，mAlb）測定試劑盒 上海太陽生物技術(shù)有限公司；蘇木精 上海藍(lán)季科學(xué)發(fā)展有限公司；醇溶性伊紅 上海試劑三廠。

1.4 儀器與設(shè)備

Model680型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；GL-20M型高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司；ALPHA 1-4 LO型凍干機(jī) 德國Christ公司；LABOROTA 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；1100型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；TSK-gel G4000 PWxl色譜柱 Tosoh Bioscience公司；BH-2型顯微鏡、DP72型顯微照相系統(tǒng) 日本Olympus公司。

1.5 方法

1.5.1 Cf-CHS的制備和檢測

參照文獻(xiàn)[4]制備Cf-CHS。干冰島刺參粉碎，丙酮浸泡脫脂 24 h，室溫晾干。向干物中（以下提取步驟均以1 g干物計(jì)算）加入100 mg木瓜蛋白酶，60 ℃水浴條件下攪拌反應(yīng)24 h，離心得上清。向上清液中加入1.6 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% 的CPC溶液，室溫靜置24 h后離心，棄上清。沉淀溶解于15 mL 3 mol/L NaCl-乙醇（100∶15，V/V）溶液中，4 ℃靜置24 h，離心棄沉淀。向上清液中加入20 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液繼續(xù)沉淀。棄上清，蒸餾水溶解沉淀，用截留分子質(zhì)量為10 kD的透析袋透析脫鹽，濃縮，凍干，得海參粗多糖。粗多糖過DEAE-52陰離子交換柱，以0～1.4 mol/L NaCl緩沖鹽溶液連續(xù)梯度洗脫，每7 mL收集一管。洗脫液過液相TSK4000柱檢測組分單一的管，收集后透析，凍干，得Cf-CHS純品。本課題組前期研究顯示，Cf-CHS分子質(zhì)量為14.76 kD，主要由葡萄糖醛酸、氨基半乳糖和巖藻糖3 種單糖組成，且三者的物質(zhì)的量比為1.00∶1.50∶1.16，其硫酸根含量為31.07%[11]。

1.5.2 動(dòng)物分組及模型建立

C57BL/6雄性小鼠，4～5 周齡，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、純品Cf-CHS組、低劑量Cf-CHS+RSG組和高劑量Cf-CHS+RSG組。正常對(duì)照組飼喂正常飼料，其他組喂高糖高脂飼料。飼料配方參照美國營養(yǎng)學(xué)會(huì)1993年頒布的嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物純化飼料標(biāo)準(zhǔn)（American Institute of Nutrition-93 purified diets for laboratory rodents，AIN-93）。正常飼料中不含糖類，蛋白質(zhì)和脂肪分別占20%和5%，能量3.85 kcal/g；高糖高脂飼料糖類、蛋白質(zhì)和脂肪的相對(duì)含量分別為20%、20%和25%，能量4.85 kcal/g。陽性對(duì)照組、純品Cf-CHS組、低劑量Cf-CHS+RSG組和高劑量Cf-CHS+RSG組飼料中分別以體質(zhì)量為基礎(chǔ)添加RSG（1 mg/（kg?d））、Cf-CHS（80 mg/（kg?d））、Cf-CHS+RSG（20 mg/（kg?d）+1 mg/（kg?d））和Cf-CHS+RSG（80 mg/（kg?d）+1 mg/（kg?d））。喂養(yǎng)期間，每月尾靜脈取血檢測各組小鼠的空腹血糖，每組3 只。第18周檢測數(shù)據(jù)顯示不同組小鼠的空腹血糖出現(xiàn)顯著性差異，提示造模成功。連續(xù)喂養(yǎng)19 周后收集標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食、飲水，每天記錄攝食量，每3 d記錄小鼠體質(zhì)量。

1.5.3 標(biāo)本收集

小鼠代謝籠單只適應(yīng)24 h后，收集24 h 尿液，離心分裝，4 ℃保存待測。小鼠末次給藥后禁食不禁水5 h，尾靜脈取血10 μL，參照試劑盒離心并測定血糖水平。

1.5.4 尿糖濃度的測定

參照試劑盒說明書測定。

1.5.5 尿mAlb、總蛋白含量的測定

尿總蛋白含量的測定采用雙縮脲法；尿mAlb含量的測定參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.6 尿Cr、UN、UA含量的測定

參照試劑盒說明書測定。

1.5.7 尿NAG排泄率的測定

參照試劑盒說明書測定尿NAG濃度。尿NAG排泄率為尿NAG濃度與24 h尿量的乘積。

1.5.8 腎臟組織的顯微觀察

小鼠脫頸椎處死，迅速摘取雙腎，將腎皮質(zhì)小塊置于10%的中性甲醛中固定24 h，脫水、透明、常規(guī)石蠟包埋、切片、染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，同時(shí)進(jìn)行最小顯著差異（least significant difference，LSD）兩兩比較。以P＜0.05為差異顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cf-CHS對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖和尿糖濃度的影響

表1 Cf-CHS對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖和尿糖濃度影響（x ± s，n=10）Table 1 Effect off Cf-CHS on the levels of fasting blood glucose and urinary glucose (x ± s, n =10)

血糖升高和尿糖是糖尿病的主要臨床癥狀之一。如表1所示，模型對(duì)照組小鼠的血糖和尿糖濃度顯著均高于正常對(duì)照組（P＜0.01），提示所造糖尿病小鼠模型成功。喂食含Cf-CHS的高脂飼料后，相對(duì)于模型對(duì)照組，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的血糖濃度和尿糖濃度均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。其中，純品Cf-CHS小鼠的尿糖濃度降低了27.8%，低劑量Cf-CHS+RSG組和高劑量Cf-CHS+RSG組分別降低了33.1%和45.6%。表明Cf-CHS具有與陽性藥物類似的效果，可以顯著改善糖尿病小鼠的尿糖癥狀。

2.2 Cf-CHS對(duì)糖尿病小鼠尿mAlb和總蛋白含量的影響

表 22 CCff-CHS對(duì)糖尿病小鼠mAlb、總蛋白、Cr、UN和UA含量的影響（x± s，n=10）Table 2 Effect of Cf-CHS on the levels of mAlb, total protein, Cr, UN, and UA in urine (x ± s,n=10)

尿mAlb及總蛋白是糖尿病腎臟病變的診斷指標(biāo)，反映腎小球的濾過功能[13]。如表2所示，相比正常對(duì)照組，模型對(duì)照組小鼠的尿mAlb和總蛋白含量顯著升高（P＜0.01），表明小鼠出現(xiàn)了腎臟病變。相對(duì)于模型對(duì)照組，喂食Cf-CHS的純品組、低劑量Cf-CHS+RSG組和高劑量Cf-CHS+RSG組小鼠的尿mAlb含量分別降低了37.3%、41.6%和52.6%（P＜0.01），總蛋白含量分別降低了18.8%、23.9%和35.3%（P＜0.01）。與陽性對(duì)照組相比，復(fù)配高劑量組降低尿總蛋白含量的作用更顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明Cf-CHS可以顯著抑制糖尿病小鼠尿微量白蛋白的排出，降低尿總蛋白的排出量，對(duì)糖尿病腎病有一定治療作用，并且Cf-CHS可以協(xié)同增加RSG的降尿總蛋白作用效果。

2.3 Cf-CHS對(duì)糖尿病小鼠尿Cr、UN、UA含量的影響

Cr、UN和UA分別為體內(nèi)肌酸、蛋白質(zhì)和嘌呤代謝產(chǎn)物，3 種物質(zhì)均經(jīng)腎小球?yàn)V過后隨尿排出，是反映腎小球受損的靈敏指標(biāo)[14]。由表2可知，模型對(duì)照組小鼠尿液中三者的水平均顯著升高（P＜0.01），反映其腎小球已受損。與模型對(duì)照組相比，3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的尿Cr、UN和 UA水平均顯著降低（P＜0.01）。其中，純品組、低劑量Cf-CHS+RSG組和高劑量Cf-CHS+RSG組的尿Cr含量分別下降了31.3%、29.1%和44.6%，UN含量分別下降了33.0%、45.0%和53.5%，UA含量分別下降了8.0%、26.6%和30.1%。與陽性對(duì)照組相比，Cf-CHS與RSG復(fù)配后降尿Cr、UN的作用顯著，表明Cf-CHS有一定修復(fù)腎小球損傷的作用，且與RSG有一定的協(xié)同作用。

2.4 Cf-CHS對(duì)糖尿病小鼠NAG排泄率的影響

圖 11 CCff-CHS對(duì)糖尿病小鼠NAG排泄率的影響（x± s，n=10）Fig.1 Effect of Cf-CHS on the excretion amount of NAG in urine of diabetic mice (x ± s,n=10)

NAG是來自腎近端曲小管溶酶體水解酶，當(dāng)腎小管細(xì)胞受損時(shí)尿NAG活性顯著升高，反映腎小管早期損傷[15]。由圖1可知，模型對(duì)照組的NAG排泄率比正常對(duì)照組顯著升高，有極顯著性差異（P＜0.01）。飼喂含Cf-CHS的高脂高糖飼料后，與模型對(duì)照組相比，純品Cf-CHS組、低劑量Cf-CHS+RSG組和高劑量Cf-CHS+RSG組的NAG排泄率均有所降低，分別降低了13.7%、45.3%和59.1%，作用效果極顯著（P＜0.01）。復(fù)配高劑量組比陽性對(duì)照組效果更優(yōu)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示Cf-CHS能夠降低糖尿病小鼠的尿NAG活性，抑制NAG排出，改善糖尿病腎病引起的腎小管損傷，與RSG復(fù)配后效果更顯著。

2.5 Cf-CHS對(duì)糖尿病小鼠腎臟組織顯微結(jié)構(gòu)的影響

圖2 2 CfCf-CHS對(duì)糖尿病小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響（HE染色，×400）400Fig.2 Effect of Cf-CHS on kidney microstructure of diabetic mice (HE stain, ×400)

如圖2所示，光鏡下正常對(duì)照組小鼠腎小球外形飽滿規(guī)則，腎小囊邊界清晰，腎小管結(jié)構(gòu)正常；模型對(duì)照組小鼠的腎小囊變窄，腎小球體積增大。以Cf-CHS干預(yù)后，3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠的腎小球和腎小囊病變程度較模型組明顯減輕，其中，高劑量Cf-CHS+RSG組小鼠的腎臟組織接近正常。

3 討 論

糖尿病腎病是最嚴(yán)重最常見的糖尿病并發(fā)癥之一，主要臨床特征有尿蛋白和腎功能受損，特征性的病理改變是腎小球系膜區(qū)無細(xì)胞性增寬和腎小球基底膜彌漫性增厚，漸至腎小球硬化和肥大，末期腎功能衰竭[16-17]。DN的檢測以尿指標(biāo)為主，因尿液成分可以直接反映血液成分的變化和腎臟對(duì)血液的濾過能力。尿糖是尿液中糖含量的總稱，只有當(dāng)血糖很高時(shí)才能形成尿糖，而高血糖對(duì)糖尿病病人腎臟發(fā)生病變至關(guān)重要[18]。因此檢測尿糖水平可以了解糖尿病的嚴(yán)重程度和發(fā)生腎病的危險(xiǎn)。DN的主要診斷指標(biāo)有尿mAlb、總蛋白、UN、Cr、UA和NAG等，其中尿mAlb、總蛋白、UN、Cr和UA是反映腎小球受損的指標(biāo)，NAG反映腎小管受損程度[19]。而尿蛋白還對(duì)腎小球系膜有毒性作用，損害腎小管間質(zhì)等[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)以高脂高糖飼料飼喂小鼠以誘導(dǎo)Ⅱ型糖尿病模型，通過檢測尿糖、尿mAlb、總蛋白、UN、Cr、UA和NAG等，綜合評(píng)價(jià)糖尿病小鼠糖尿病和腎臟病變的嚴(yán)重程度。結(jié)果顯示，模型對(duì)照組小鼠各項(xiàng)尿指標(biāo)水平都顯著升高，造模成功。飼喂含Cf-CHS飼料可顯著降低尿液中糖、mAlb、總蛋白、UN、Cr、UA和NAG的水平，說明Cf-CHS可以有效抑制尿糖、尿蛋白和NAG等的排出，對(duì)糖尿病引起的腎臟病變有一定的修復(fù)作用。與糖尿病常規(guī)治療藥物RSG復(fù)配后，降低效果更為顯著，提示Cf-CHS與RSG有一定的協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)RSG對(duì)Ⅱ型糖尿病引起的腎臟變的修復(fù)作用。

糖尿病腎病的發(fā)生是多因素綜合作用的結(jié)果，包括糖代謝異常、腎臟血流動(dòng)力學(xué)的改變和多種細(xì)胞因子的作用[15]。本研究中的冰島刺參硫酸軟骨素富含巖藻糖支鏈，研究表明，巖藻糖分支結(jié)構(gòu)與CHS的多種生物學(xué)活性相關(guān)，其特異性的空間排列是CHS抗凝活性的基礎(chǔ)，還與抗血栓、降血脂、促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和移位、促進(jìn)血管再生和抑癌活性等密切相關(guān)[9,16,20]。本研究結(jié)果顯示，冰島刺參巖藻糖基化硫酸軟骨素可促進(jìn)糖尿病腎病引起的腎細(xì)胞損傷的修復(fù)，可能與可改善糖尿病小鼠的高血糖癥狀，降低某些引起腎小球和腎小管病變的關(guān)鍵細(xì)胞因子的表達(dá)等有關(guān)，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

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Protective Effect of Fucolysated Chondroitin Sulfate from the Sea Cucumber Cucumaria frondosa on Kidney of High Fat Diet-Induced Diabetic Mice

ZHOU Xiao-chun, WANG Jing-feng, HU Shi-wei, SHI Di, XUE Chang-hu*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Objective: In this study, the protective effect of fucolysated chondroitin sulfate from the sea cucumber Cucumaria frondosa (Cf-CHS) on kidney was accessed in high fat diet-(HFD) induced diabetic mice. Methods: To establish diabetic models, mice were fed with HFD. The diabetic mice were administered with different doses of Cf-CHS daily for 19 weeks. Urine was collected to analyze the levels of glucose, microalbumin (mAlb), total protein, urea nitrogen (UN), uric acid (UA), creatinine (Cr) and the excretion of N-acetyl-β-glucosaminidase (NAG). Kidney tissue was collected to make microscope slides. Results: Cf-CHS could significantly (P ＜ 0.01) decrease the levels of glucose, mAlb, total UN, UA, Cr, and NAG in urine and observably improve kidney tissue of diabetic mice. Conclusion: Cf-CHS has a remarkably protective effect on kidney of diabetic mice.

diabetes mellitus; Cucumaria frondosa; fucolysated chondroitin sulfate(CHS); urine protein; N-acetyl-βglucosaminidase(NAG); kidney protection

R285.5

A

1002-6630（2014）13-0236-04

10.7506/spkx1002-6630-201413046

2013-08-29

公益性行業(yè)（海洋）科研專項(xiàng)（2011CX80201）；山東省自主創(chuàng)新專項(xiàng)（2012CX80201）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371876）

周曉春（1989—），女，碩士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊锘钚晕镔|(zhì)。E-mail：yyaimeishi@163.com

*通信作者：薛長湖（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工。E-mail：xuech@ouc.edu.cn