玉米胚芽抗氧化肽的急性毒性和致突變性

張鳴鏑，趙會燕，劉靜波*，王 瑩，趙駿捷，孫曉萌

（吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院，吉林 長春 130062）

玉米胚芽抗氧化肽的急性毒性和致突變性

張鳴鏑，趙會燕，劉靜波*，王 瑩，趙駿捷，孫曉萌

（吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院，吉林 長春 130062）

研究玉米胚芽抗氧化肽在小鼠體內(nèi)的急性毒性及致突變性，為其開發(fā)應(yīng)用提供安全保障。采用最大耐受量法、小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)、骨髓微核實(shí)驗(yàn)和Ames實(shí)驗(yàn)對玉米胚芽抗氧化肽進(jìn)行急性毒性和致突變性研究。結(jié)果表明：玉米胚芽抗氧化肽對小鼠的急性經(jīng)口最大耐受劑量（maximum tolerated dose，MTD）大于34 g/kg（以體質(zhì)量計(jì)）；3 項(xiàng)致突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性，故玉米胚芽抗氧化肽無急 性毒性和致突變性。

玉米胚芽抗氧化肽；精子畸形；骨髓微核；鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)（Ames實(shí)驗(yàn)）

玉米胚芽粕是玉米油廠生產(chǎn)加工過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物[1]，富含多種人體所必需的氨基酸、多糖和膳食纖維，其粗蛋白含量約為23%[2]，是一種極好的植物蛋白資源。玉米胚芽蛋白具有良好的功能特性[3-6]，國內(nèi)外多利用玉米胚芽蛋白作為食品添加劑，廣泛應(yīng)用于肉制品[7-8]、糕點(diǎn)[9-10]和飲料[11-13]的生產(chǎn)加工中。自由基理論認(rèn)為隨著年齡增長，體內(nèi)抗氧化酶活力下降，過多的自由基影響細(xì)胞物質(zhì)和能量代謝的正常進(jìn)行，導(dǎo)致衰老、腫瘤、心血管疾病、免疫功能低下等很多退行性疾病[14-15]。隨著人民生活水平日益提高，人們對高效、低毒的抗氧化物質(zhì)的訴求也日益增大。因此，對抗氧化肽的研究成為近年來學(xué)者們關(guān)注的重點(diǎn)課題。

玉米胚芽抗氧化肽是以玉米胚芽粕制備的玉米胚芽蛋白為底物，采用生物酶酶解技術(shù)制備的混合肽，具有消化吸收快、水溶性好和抗氧化等良好的功能特性，其分子質(zhì)量主要分布在145.56～3 844.47 D[16]。目前工業(yè)上多采用濕法脫胚和壓榨法、浸出法相結(jié)合的方式提取玉米胚芽油[17]，故玉米胚芽粕中可能殘留二氧化硫和其他有機(jī)溶劑。并且提取玉米胚芽蛋白時(shí)通常采用較高濃度的氫氧化鈉，強(qiáng)堿的使用容易引發(fā)“胱賴反應(yīng)”從而產(chǎn)生有毒物質(zhì)。因此，對玉米胚芽抗氧化肽進(jìn)行系統(tǒng)的毒理學(xué)評價(jià)具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米胚芽抗氧化肽 吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院營養(yǎng)與功能食品研究室自制。

實(shí)驗(yàn)動物配合飼料，由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，許可證編號（SCXK-（吉）2010-0001）；鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 上海桑戈生物科技有限公司；伊紅（醇溶） 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；小牛血清 杭州四季青生物材料研究所；快速姬姆薩染液 南京建成科技有限公司；甲醇、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、磷酸一氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫鈉銨、硫酸鎂均為分析級 北京化工廠；環(huán)磷酰胺、L-組氨酸、D-生物素、輔酶-Ⅱ（氧化型）、葡萄糖-6-硫酸鈉、漿液、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、2-氨基芴（2-amino fluorene，2-AF）、敵克松（dexon fenaminosulf，DAPA）、甲基磺酸甲酯（methyl mathanesulfonate，MMS）、1,8-二羥基蒽醌（1,8-second hydroxyl anthraquinone，1,8-HAQ） 美國Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物和飼養(yǎng)環(huán)境

急性毒性實(shí)驗(yàn)：體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，共40 只；小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)：體質(zhì)量（30±5）g，雄性，共25 只；骨髓微核實(shí)驗(yàn)：體質(zhì)量25～30 g，雌雄各半，共50 只。以上實(shí)驗(yàn)用鼠均為SPF級ICR小鼠，由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。本實(shí)驗(yàn)中，動物飼養(yǎng)室環(huán)境溫度控制在（22±2）℃、相對濕度控制在（50±5）%、換氣頻率≥10 次/h、采用12 h光照/黑暗并控制噪音小于60 dB。

1.3 方法

1.3.1 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)[18]

采用國標(biāo)中最大耐受劑量（maximum tolerated dose，MTD）法，根據(jù)玉米胚芽抗氧化肽的溶解性及其在注射器中的可流動性為指標(biāo)，確定受試物的使用質(zhì)量濃度為0.85 g/mL。實(shí)驗(yàn)小鼠在適應(yīng)環(huán)境3 d后按照體質(zhì)量隨機(jī)分為2 組，即實(shí)驗(yàn)組和空白對照組。首次灌胃前，實(shí)驗(yàn)小鼠隔夜空腹16 h，自由飲水。采用經(jīng)口灌胃的途徑對實(shí)驗(yàn)組小鼠給予受試物，按國標(biāo)要求每次實(shí)驗(yàn)小鼠的灌胃體積為0.2 mL/10 g（以體質(zhì)量計(jì)，下同）。本實(shí)驗(yàn)中2 次給予小鼠受試物，時(shí)間為上午8：00和12：00，故實(shí)驗(yàn)組最終累計(jì)給予玉米胚芽抗氧化肽的量為34 g/kg；給予空白對照組小鼠相同體積的蒸餾水[19]，灌胃2 h后，重新給予食物。給予受試物后密切觀察并記錄實(shí)驗(yàn)小鼠的生理活動表現(xiàn)。觀察期間不限制攝食和飲水，每天記錄實(shí)驗(yàn)小鼠的體質(zhì)量、攝食量和飲水量。7 d后采用脊椎脫臼法處死所有存活的實(shí)驗(yàn)小鼠（處死前禁食4 h），迅速解剖并收集心臟、肝臟、腎臟、胸腺、肺、脾、腎、睪丸、附睪等臟器，稱其質(zhì)量并計(jì)算臟器系數(shù)。對有明顯病變的實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.3.2 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)[20]

實(shí)驗(yàn)小鼠在適應(yīng)環(huán)境4 d后按照體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組，即陰性對照組，玉米胚芽抗氧化肽低、中、高劑量組和陽性對照組。實(shí)驗(yàn)中選取10 g/kg為最高給藥劑量，再下設(shè)中劑量5 g/kg、低劑量2.5 g/kg，陰性對照組給予相同體積的蒸餾水，陽性對照組給予40 mg/kg的環(huán)磷酰胺。連續(xù)5 d經(jīng)口灌胃，首次灌胃后的第35天用頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)小鼠，將兩側(cè)附睪取出，常規(guī)制備小鼠精子涂片。在高倍鏡下觀察，每只實(shí)驗(yàn)小鼠各檢查結(jié)構(gòu)完整的精子1 000 個(gè)，記錄畸形精子數(shù)并計(jì)算精子畸形率。

1.3.3 小 鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)[21]

實(shí)驗(yàn)小鼠在適應(yīng)環(huán)境4 d后按照體質(zhì)量隨機(jī)分成5 組，即陰性對照組，玉米胚芽抗氧化肽低、中、高劑量組和陽性對照組。選取10 g/kg為最高給藥劑量，再下設(shè)中劑量5 g/kg、低劑量2.5 g/kg。陰性對照組給予相同體積的蒸餾水，陽性對照組給與40 mg/kg的環(huán)磷酰胺。本實(shí)驗(yàn)采用30 h給予受試物法，即早8：00第一次給予玉米胚芽抗氧化肽，隔天早8：00第二次給予，當(dāng)日14：00頸椎脫臼處死小鼠，迅速取出胸骨，常規(guī)制備骨髓涂片。在油鏡下觀察計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（polychromatic erythrocyte，PCE）中的微核數(shù)，計(jì)算微核率。

1.3.4 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)（Ames實(shí)驗(yàn)）[22]

將玉米胚芽抗氧化肽在紫外燈下輻照殺菌15 min后，溶于DMSO。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置玉米胚芽抗氧化肽含量分別為8、40、200、1 000、5 000 ?g/plate共5 個(gè)劑量組，分別為實(shí)驗(yàn)組A、B、C、D、E。陽性對照組分別是：加S9活化系統(tǒng)時(shí)，TA97、TA98、TA100均使用2-AF，劑量是10 ?g/plate，TA102使用1,8-HAQ，劑量是60 ?g/plate；不加S9活化系統(tǒng)時(shí)，TA97、TA98、TA102均使用DAPA，劑量是50 ?g/plate，TA100使用MMS，劑量是1 ?L/plate。本實(shí)驗(yàn)采用平板摻入法，同時(shí)設(shè)置5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，陽性對照組、陰性對照組和溶劑對照組。每一菌株的每一劑量組均做3 個(gè)平行皿，37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察每個(gè)培養(yǎng)基上回變菌落數(shù)。若各實(shí)驗(yàn)組的回變菌落數(shù)目是陰性對照組的2 倍以上，并具有一定的劑量反應(yīng)關(guān)系或至少某一測試點(diǎn)有可重復(fù)的并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的陽性反應(yīng)，則可判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，該受試物具有致突變性。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)

小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)中采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，置信區(qū)間百分比為95%；其他3項(xiàng)致突變實(shí)驗(yàn)中均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，設(shè)置P=0.05，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均值進(jìn)行單因素方差分析。先對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊性，則選用LSD法進(jìn)行多個(gè)劑量組與對照組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均值間的兩兩比較，若方差不齊則選用Dunnett’s T3法進(jìn)行數(shù)據(jù)的兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 一般觀察結(jié)果

給予小鼠玉米胚芽抗氧化肽后，實(shí)驗(yàn)小鼠未見明顯中毒現(xiàn)象，7 d內(nèi)無小鼠死亡。實(shí)驗(yàn)期間，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)小鼠的體質(zhì)量、攝食量和飲水量，計(jì)算小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)中小鼠總食物利用率，具體結(jié)果見表1～3。由結(jié)果可知：空白對照組與實(shí)驗(yàn)組的體質(zhì)量、攝食量和飲水量均無顯著性差異。故玉米胚芽抗氧化肽的攝入沒有誘使受試小鼠產(chǎn)生食欲不振等現(xiàn)象，不影響小鼠的正常生長發(fā)育。

表1 急性毒性實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量變化（x±s，n=10）Table 1 Changes in body weight of mice in acute toxicity test (x±s，n=10) g

表2 急性毒性實(shí)驗(yàn)小鼠日攝食量和日飲水量變化（x±s，n=10）Table 2 Changes in daily intake and water intake of mice in acute toxicity tesstt (x ±s, n=10)

表3 急性毒性實(shí)驗(yàn)小鼠食物利用率（x±s，n=10）Table 3 Food utilization of mice in acute toxicity test (x±s，n=10)

2.1.2 臟器系數(shù)分析

實(shí)驗(yàn)第8天處死小鼠，解剖檢查各臟器無明顯異常，剝離臟器稱質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)結(jié)果如表4，玉米胚芽抗氧化肽的攝入并未對實(shí)驗(yàn)小鼠的臟器造成病變性的影響。

綜上所述：玉米胚芽抗氧化肽對雌雄小鼠的MTD值均大于34 g/kg，根據(jù)急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，屬于實(shí)際無毒物質(zhì)。

2.2 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s，n=5）Table 5 Results of sperm abnormality test for mice (x±s，n=5)

玉米胚芽抗氧化肽3 個(gè)劑量組的精子畸形率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果可知：實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組比較均無顯著性差異（P＞0.05）；與陽性對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。故玉米胚芽抗氧化肽無誘發(fā)小鼠精子畸形的作用。

2.3 小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表6可知，相較于陰性對照組，玉米胚芽抗氧化肽的3 個(gè)劑量組的骨髓微核率均無顯著性差異（P＞0.05），而陽性對照組（環(huán)磷酰胺組）具有極顯著差異（P＜0.01）。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對誘變化合物敏感，且玉米胚芽抗氧化肽無誘使小鼠骨髓微核嗜多染紅細(xì)胞增加的作用。

表6 小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s，n=5）Table 6 Results of bone marrow cell micronucleus test for mice (x ±s,n=5)

2.4 Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 玉米胚芽抗氧化肽Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x ±s，n=3）Table 7 Results of of Ames test (x ±s,n=3)

由表7可知，玉米胚芽抗氧化肽每皿劑量在8～5 000 ?g/plate時(shí)，有或者沒有S9代謝活化系統(tǒng)對4 種菌株的平均回變菌落數(shù)均未超過陰性對照組的2 倍，并未見劑量反應(yīng)關(guān)系，而陽性對照組在相同實(shí)驗(yàn)條件下，均顯現(xiàn)出陽性反應(yīng)。以上情況充分說明玉米胚芽抗氧化肽無致突變作用。

3 結(jié)3 論

本實(shí)驗(yàn)為探討玉米胚芽抗氧化肽的安全性，對其進(jìn)行了急性毒性實(shí)驗(yàn)和3 項(xiàng)致突變實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明玉米胚芽抗氧化肽屬實(shí)際無毒物質(zhì)，并且3 項(xiàng)致突變實(shí)驗(yàn)均表明玉米胚芽抗氧化肽不具有誘發(fā)突變的作用。本實(shí)驗(yàn)中的玉米胚芽抗氧化肽的人體推薦日用量為3.6 g/（人?d），假設(shè)人的標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量為60 kg，則推薦攝入量（以體質(zhì)量計(jì)）相當(dāng)于60 mg/（kg?d）。采用的最高劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于人體推薦攝入量的100 倍，說明玉米胚芽抗氧化肽在推薦劑量范圍內(nèi)使用是安全的。本結(jié)果為玉米胚芽抗氧化肽的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供理論依據(jù)。

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Acute Toxicity and Mutagenicity of Corn Germ Antioxidant Peptide

ZHANG Ming-di, ZHAO Hui-yan, LIU Jing-bo*, WANG Ying, ZHAO Jun-jie, SUN Xiao-meng
(College of Quartermaster Technology, Jilin University, Changchun 130062, China)

In order to provide safety guarantee for its development and application, the acute toxicity and mutagenicity of corn germ antioxidant peptide (CGAP) in mice were evaluated by testing maximum tolerable dose (MTD), and mutagenicity of CGAP was studied by sperm abnormality test, bone marrow cell micronucleus test and Ames test. The results showed that MTD of CGAP was larger tha n 34 g/kg in mice and all the results of mutagenicity tests obtained were negative. Thus, CGAP does not show any acute toxicity or mutagenicity.

corn germ antioxidant peptide; sperm abnormal ity; bone marrow cell micronucleus; Salmonella typhimurium reverse mutation test (Ames test)

TS201.6

A

1002-6630（2014）13-0228-04

10.7506/spkx1002-6630-201413044

2014-05-29

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD33B03）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271907）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（博導(dǎo)類）項(xiàng)目（20130061110088）

張鳴鏑（1971—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與功能食品。E-mail：zhangmd@jlu.edu.cn

*通信作者：劉靜波（1962—），女，教授，博士，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與功能食品。E-mail：ljb168@sohu.com