不同等電點沉淀法和超速離心法提取牛奶乳清蛋白的雙向電泳分析

陳靜廷，卜登攀，馬 露，楊永新，李發(fā)弟

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院-世界農(nóng)用林業(yè)中心，農(nóng)用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實驗室，北京 100193；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

不同等電點沉淀法和超速離心法提取牛奶乳清蛋白的雙向電泳分析

陳靜廷1,2，卜登攀1,3,4,*，馬 露1，楊永新1，李發(fā)弟2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院-世界農(nóng)用林業(yè)中心，農(nóng)用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實驗室，北京 100193；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

為探索牛奶乳清蛋白提取的最適方法，以生鮮荷斯坦牛奶為對象，采用不同等電點（pH 4.6和pH 4.8）沉淀法和超速離心法提取牛奶乳清蛋白樣品，并對提取效果進行雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）圖譜分析。依據(jù)凝膠圖譜上蛋白斑點比 較圖譜質(zhì)量，采用PDQuest 8.0凝膠圖像分析軟件進行凝膠圖譜分析。結(jié)果顯示：2 種方法均能有效提取牛奶乳清蛋白，且獲得的2-DE凝膠圖譜背景清晰、蛋白點個體獨立、無明顯的拖尾現(xiàn)象，且重復(fù)性強，但都存在一定的酪蛋白殘留。與超速離心法相 比，pH 4.6沉淀法和pH 4.8 沉淀法提取乳清蛋白的2-DE凝膠圖譜可檢測到較多的蛋白質(zhì)斑點。pH 4.6沉淀法提取乳清蛋白制備的2-DE凝膠圖譜中蛋白點的表達(dá)豐度略高于pH 4.8沉淀法。研究 表明：pH 4.6沉淀法提取乳清蛋白制備2-DE凝膠圖譜略優(yōu)于pH 4.8沉淀法和超速離心法。但2 種等電點沉淀法和超 速離心法都可有效去除牛奶中的高豐度酪蛋白，提高低豐度蛋白的檢出敏感性。

牛奶；乳清蛋白；等電沉淀；超速離心；提取方法；雙向凝膠電泳圖譜

雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）技術(shù)以其具有高通過量、微量分析與制備等性能仍是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的核心技術(shù)之一[1-3]。分離獲得全面、高分辨率的蛋白圖譜是提 高2-DE蛋白質(zhì)組學(xué)研究信息完整性的重要步驟。其中蛋白質(zhì)樣品的制備是2-DE技術(shù)中的關(guān)鍵步驟，是蛋白質(zhì)分離與鑒定的基礎(chǔ)[4-5]。由于蛋白質(zhì)樣品的多樣性及2-DE操作的復(fù)雜性，需要不斷的摸索以尋求不同蛋白樣品2-DE的最適實驗技術(shù)。

乳清蛋白是牛奶乳清中的主要成分，其功能性蛋白含量高、必需氨基酸種類齊全且生物利用效價高[6-7]。但乳清蛋白經(jīng)復(fù)雜的遺傳變異和豐富的翻譯修飾后變得非常復(fù)雜，且與酪蛋白相比，其相對含量較低且穩(wěn)定性較差[8-9]。因此，可采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究牛奶乳清蛋白，以從蛋白質(zhì)組整體水平研究不同的生理、病理及環(huán)境因素等對乳清蛋白的影響。近年來，有關(guān)乳清蛋白質(zhì)作為 奶牛乳房炎、不同泌乳階段和不同物種間等表征性物質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究報道日益增多[10-12]。然而，由于牛奶中存在多種高豐度蛋白（如酪蛋白）以及脂類、乳糖、灰分等[13]，會干擾周圍低豐度蛋白的表達(dá)與鑒別[14-15]，同時會降低電泳結(jié)果的重復(fù)性和分辨率。如何盡量減少或避免高豐度蛋白及其他成分對乳清蛋白表達(dá)的影響成為牛奶乳清蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵步驟之一。

選擇合適的、操作步驟簡便的蛋白質(zhì)樣品制備方法是獲得較多有效蛋白點、原有組分變化小、重復(fù)性高2-DE凝膠圖譜的關(guān)鍵。但目前尚沒有一種方法適用于各種蛋白樣品的制備。用于動植物的體液、組織、細(xì)胞等蛋白質(zhì)樣品制備的沉淀方法多樣，有丙酮沉淀法、三氟乙酸沉淀法、三氟乙酸-丙酮沉淀法、Trizol試劑沉淀法等[16]，其中提取牛奶乳清蛋白樣品常用且較為簡便的方法主要有pH 4.6和pH 4.8 2 種不同等電點沉淀法及超速離心法[17-20]。

因此，本實驗采用不同等電點沉淀酪蛋白（pH 4.6和pH 4.8）和超速離心2 種常用方法對牛奶中乳清蛋白進行提取，并對其2-DE凝膠圖譜效果進行分析，擬對不同牛奶乳清蛋白常用提取方法的提取效果進行比較分析，以期為今后乳清蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供簡便、有效的技 術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采集于北京市周邊牧場，奶牛采用全混合日糧方式飼喂，每天飼喂2 次，自由飲水，早晚擠奶2 次。奶樣為采自于4 ℃奶罐中的健康奶牛的混合乳樣，冷藏帶回實驗室，立即進行乳清蛋白樣品提取處理。

17 cm固相非線性IPG預(yù)制膠條（pH 4～7）、IPG Buffer pH 3～10 美國Bio-Rad公司；3-3-膽酰胺丙基-二甲氨基-1-丙磺酸（3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate，CHAPS）和礦物油、甘油、尿素、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、過硫酸銨（ammonium persulfate，AP）和低熔點瓊脂糖 美國Amresco公司；碘乙酰胺 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TEAN IEF Cell等電聚焦系統(tǒng)、PROTEAN?ⅡXi Cell、光密度掃描儀GS-800 Calibrated Densitometer、PDQuest 8.0凝膠圖像分析軟件 美國Bio-Rad公司；高速低溫冷凍離心機 美國Sigma公司；超速離心機日本Hitachi公司；酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；pH酸度計 德國Sartorius公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國MilliPore公司；P0012BCA蛋白濃度測定試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白樣品的制備

為盡量減少樣品蛋白的損失和修飾，同時提高2-DE凝膠圖譜的重復(fù)性，采用以簡單為原則的乳清蛋白樣品制備方法。選用2 種較常用、較簡單的乳清蛋白提取方法。

2 種提取方法均先將鮮牛奶于3 000×g、4 ℃、離心15 min，棄去上層脂肪，制得脫脂牛奶。

不同等電點法是分別用1 mol/L鹽酸調(diào)脫脂牛奶pH值至4.6與4.8，調(diào)節(jié)pH值過程中不斷攪拌，之后于5 000×g、4 ℃、離心20 min。分別收集pH值至4.6與4.8處理后脫脂牛奶上清液，即為不同等電點（pH 4.6和pH 4.8）沉淀酪蛋白后的乳清蛋白樣品。

超速離心法即將脫脂牛奶于100 000×g、4 ℃、離心1 h，棄去上層脂肪后吸取上清液，即為超速離心所得乳清蛋白樣品。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定

提取乳清蛋白后，直接采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行測定。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9% NaCl為空白，1.0 mg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，參照試劑盒說明書，在酶標(biāo)儀上測A560nm值，用于獲得不同方法制備的牛奶乳清蛋白的含量。分裝乳清蛋白，于－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 2-DE分析

室溫溶解保存的乳清蛋白樣品。取上樣量為250 μg的乳清蛋白樣品與終體積300 μL的水化上樣緩沖液（8 mol/L尿素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% CHAPS、65 mmol/L DTT及質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% IPG緩沖液和痕量溴酚藍(lán)）渦旋混勻，加入等電聚焦盤的聚焦槽內(nèi)。提前取出固相化pH值梯度IPG預(yù)制膠條（17 cm，pH 4～7），室溫放置10 min，棄去保護膜、對應(yīng)正負(fù)極后使膠條覆蓋于聚焦槽的樣品上并與電極緊密接觸。確保無氣泡后置于膠條上覆蓋3 mL礦物油。最后將等電聚焦盤置于等電聚焦電泳儀內(nèi)進行第一向等電聚焦。聚焦環(huán)境為20 ℃，程序如表1所示。

表1 等電聚焦程序與參數(shù)設(shè)置Table1 Isoelectric focusing procedures and parameters

等電聚焦結(jié)束后進行第二向十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），分離膠為質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%。依次用膠條平衡緩沖母液Ⅰ（6 mol/L尿素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% SDS、1.5 mol/L pH 8.8的Tris-HCl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%甘油和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% DTT）和膠條平衡緩沖母液Ⅱ（6 mol/L尿素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% SDS、1.5 mol/L pH 8.8的Tris-HCl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%甘油和2.5%碘乙酰胺）對等電聚焦后的膠條進行平衡處理，平衡時間分別為12 min，之后將膠條置于分離膠上方，用低熔點瓊脂糖封膠進行固定，確保膠條底部與分離膠之間無氣泡存在。待封膠凝固后，將凝膠置于電泳槽內(nèi)進行第二向電泳，程序為：12 ℃循環(huán)水浴，50 V電泳30 min，200 V電泳至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部邊緣時即可停止電泳。取出凝膠，切角標(biāo)記，隨后進行固定、染色，最后脫色至背景清晰。

1.3.4 圖像分析

用光密度掃描儀GS-800 Calibrated Densitometer對2-DE凝膠進行掃描，光學(xué)分辨率為600 dpi。采用Quentity One v4.62和PDQuest 8.0凝膠圖像軟件進行2-DE圖譜分析。使用SAS 9.2和Excel軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)定量

根據(jù)測定樣品的OD值于標(biāo)準(zhǔn)曲線中得出相應(yīng)的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。pH 4.6提取法獲得樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為（11.36±1.1）μg/μL，pH 4.8提取法制備的樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為（11.78±1.5）μg/μL，超速離心法提取的樣品質(zhì)量濃度為（12.88±1.5）μg/μL。

2.2 2-DE凝膠圖譜分析

2.2.1 2-DE凝膠圖譜中蛋白質(zhì)點數(shù)量

為進一步分析不同乳清蛋白提取 方法的 差異，實驗將不同方法提取的牛奶乳清蛋白樣品按2-DE的操作程序分別重復(fù)操作3 次，以獲得蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜（圖2）。由圖2可知，3 種方法均有效提取出牛奶中的乳清蛋白，大部分酪蛋白得以去除。利用PDQuest 8.0凝膠圖像分析軟件進行凝膠位點檢測及統(tǒng)計分析，pH 4.6提取法獲得的2-DE凝膠中分離得到的蛋白質(zhì)點數(shù)為124 個，匹配率為97%；pH 4.8提取法獲得的2-DE凝膠中蛋白點數(shù)為12 7 個，匹配率為100%；超速離心法獲得的蛋白點數(shù)為82 個，匹配率為100%。pH 4.6與pH 4.8提取乳清蛋白獲得的總蛋白點數(shù)目較為接近，均多于超速離心獲得的總蛋白點數(shù)目。

圖2 不同提取方法制備的乳清蛋白的2-DE圖譜Fig.2 2-DE maps of whey protein extracted by different methods

2.2.2 2-DE凝膠圖譜中蛋白質(zhì)點分布

3 種方法提取的乳清蛋白制備的2-DE凝膠圖譜中乳清蛋白在pI 4～7范圍得到較為完整的體現(xiàn)，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量在10～200 kD范圍，蛋白質(zhì)斑點個體獨立、形態(tài)清晰、點數(shù)多且沒有明顯的橫豎條紋。不同方法制備的凝膠圖譜中均存在一定的殘留酪蛋白（圖2c區(qū)）；pH 4.6提取法制備的凝膠中主要蛋白點的染色密度略高于其他2 種方法（圖2b、d、e區(qū)、圖3）；與超速離心法相比，pH 4.6提取法與pH 4.8提取法凝膠圖譜中蛋白質(zhì)位點分布較為接近，而pH 4.8提取法較pH 4.6提取法凝膠中蛋白點略有縱向拖尾現(xiàn)象（圖2Bd區(qū)）；2 種等電點沉淀提取方法凝膠圖譜中高分子質(zhì)量區(qū)域乳清蛋白質(zhì)斑點分離較多（圖2Aa、Ba區(qū)）。由此可見，3 種方法制備的乳清蛋白樣品的2-DE圖譜中蛋白斑點分布基本相同，乳清蛋白點均較為全面地 體現(xiàn)。結(jié)合圖譜中蛋白質(zhì)斑點的獨立性、背景清晰度、雜蛋白量及蛋白點染色密度等綜合考慮，得出采用pH 4.6提取法制備的乳清蛋白樣品獲得的2-DE圖譜整體效果略優(yōu)于pH 4.8提取法與超速離心法。

圖3 不同提取方法制備的乳清蛋白的2-DE圖譜中主要蛋白點的表達(dá)量Fig.3 Expressional changes of major whey proteins in 2-DE maps obtained by different methods

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)是兩性化合物，當(dāng)調(diào)節(jié)牛奶的pH值達(dá)到酪蛋白的等電點時，蛋白質(zhì)所帶正、負(fù)電荷相等，呈電中性。此時酪蛋白的溶解度最小，酪蛋白及其夾雜物就會從牛奶中沉淀出來，上清液中所含蛋白即為乳清蛋白[21]。因此，常采用等電點沉淀法從牛奶中分離酪蛋白。然而有關(guān)酪蛋白等電點的報道不一，一般處于pH 4.6～4.8。邵錦震等[22]研究不同溫度和不同pH值條件下牛奶酪蛋白產(chǎn)率，發(fā)現(xiàn)利用等電點沉淀分離酪蛋白的最適溫度為55 ℃，最適pH值為4.8，與原龍等[23]報道的酪蛋白分離的最佳pH值為4.8的結(jié)果一致。然而，王秀娟等[24]采用等電點沉淀法來提取牛奶中的主要過敏原酪蛋白組分，通過SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，酪蛋白分離最佳條件為：pH 4.6、溫度55 ℃。然而，本研究通過分析2-DE凝膠圖譜發(fā)現(xiàn)，pH 4.6與pH 4.8 2 種不同等電點沉淀方法均能較好地 沉淀酪蛋白獲得較為全面的乳 清蛋白信息，且2 種等電點沉淀方法制備的乳清蛋白凝膠圖譜結(jié)果較為相似、差異較小。

超速離心技術(shù)是生物化學(xué)、分子生物學(xué)中分離、提純、鑒別生物大分子物質(zhì)的重要研究手段，廣泛的應(yīng)用于細(xì)胞器、病毒、核酸、蛋白質(zhì)等生物樣品的分離提純[15]。與其他分離技術(shù)如電泳技術(shù)結(jié)合，可用于蛋白質(zhì)的定性或定量分析。楊永新等[25]研究指出，采用超速離心方法純化乳腺組織蛋白質(zhì)樣品，可獲得相對較多的蛋白質(zhì)斑點2-DE凝膠圖譜，且該方法能夠盡可能地除去多糖、脂類等物質(zhì)的干擾，最大限度地保持組織蛋白質(zhì)成分，是一種高效的蛋白質(zhì)樣品制備方法。Jiang等[26]報道，三氯乙酸-丙酮沉淀法和超速離心技術(shù)均可以有效地用于血清蛋白樣品的提取，并除去樣品中的鹽類等干擾物質(zhì)，獲得較好的凝膠圖譜樣品。本實驗研究結(jié)果表明，超速離心法提取牛奶乳清蛋白的2-DE圖譜背景清晰、蛋白斑點獨立、高豐度蛋白殘留量較少，用于牛奶乳清蛋白的分離提取效果較好，但獲得的蛋白點數(shù)略少于等電點沉淀法。Rood等[27]采用納米膜超濾法、超速離心法和超速離心結(jié)合凝膠排阻法制備腎病患者尿蛋白樣品，經(jīng)MALDITOF-TOF質(zhì)譜檢測結(jié)果表明，相對于單獨采用納米膜超濾法、超速離心法制備的尿蛋白樣品，超速離心結(jié)合凝膠排阻法制備的蛋白樣品中能檢測到更多的低豐度標(biāo)志蛋白。Thongboonkerd等[28]研究表明，丙酮沉淀法獲得的健康人尿蛋白質(zhì)樣品凝膠圖 譜中存在較多的酸性、親水性蛋白，而超速離心法制備的蛋白樣品凝膠中堿性、疏水性和膜蛋白含量較多。上述研究結(jié)果表明，超速離心法用于不同蛋白樣品的提取效果不一。在蛋白樣品制備時應(yīng)根據(jù)樣品自身特點和研究目的來進行提取方法的選擇與優(yōu)化。

本研究在比較分析前人研究方法的技術(shù)上，選取2 種不同的牛奶乳清蛋白的提取方法進行研究。對牛奶乳清蛋白2-DE圖譜效果進行比較分析。結(jié)果表明，2 種方法均可有效提取牛奶乳清蛋白。結(jié)合牛奶乳清蛋白組2-DE圖譜清晰度、蛋白質(zhì)得率和蛋白質(zhì)斑點分離效果等方面綜合考慮，發(fā)現(xiàn)pH 4.6等電點沉淀提取法略優(yōu)于pH 4.8等電點沉淀提取法和超速離心法，更適用于乳清蛋白組2-DE凝膠電泳過程中蛋白樣品的制備。

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2-DE Analysis of Whey Protein Extracted by Different Isoelectric Precipitations and Ultracentrifugation Methods from Cow Milk

CHEN Jing-ting1,2, BU Deng-pan1,3,4,*, MA Lu1, YANG Yong-xin1, LI Fa-di2
(1. State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 3. CAAS-ICRAF Joint Laboratory on Agroforestry and Sustainable Animal Husbandry, Beijing 100193, China; 4. Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrit ion, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

The objective of this study was to investigate the effect of extraction methods on two-dimensional electrophoresis (2-DE) maps of whey proteome in cow milk and to explore an optimal extraction method. Samples were extracted from cow milk by different isoelectric precipitations and ultracentrifugation methods. 2-DE maps were analyzed by PDQuest 8.0 software. The results of 2-DE maps showed that milk whey protein could be effectively extracted by the above methods with less background, no signifi cant strips and good repeatability. However, there were still some residual caseins appearing in each map. 2-DE maps of wh ey protein refi ned by isoelectric precipitations were relatively informative when compared with the gel maps obtained by ultracentrifugation. Moreover, the ri chness of different whey proteins in vari ous maps extracted by adjusting pH to 4.6 as isoelectric point was slightly higher than adjusting pH to 4.8. The results indicated that adjusting pH to 4.6 as isoelectric point to extract whey protein had some advantages than adjusting pH to 4.8 and ultracentrifugation. However, all the methods used in this study could effectively remove high abundant casein to improve the detection sensitivity of low abundance proteins.

cow milk; whey protein; isoelectric precipitation; ultracentrifugation; extraction methods; two-dimensional electrophoresis map

S823

A

1002-6630（2014）20-0180-05

10.7506/spkx1002-6630-201420036

2014-01-23

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目（cxgc-ias-07）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD12B02-5）；動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室自主研究課題（2004DA125184G1103）

陳靜廷（1987—）女，碩士研究生，研究方向為反芻動物營養(yǎng)。E-mail：chenjingting911@163.com

*通信作者：卜登攀（1975—）男，副研究員，博士，研究方向為反芻動物營養(yǎng)與牛奶品質(zhì)改良。E-mail：burdenpan@gmail.com