明膠微球的制備及其對多酚的吸附效果

劉曉曉，劉 彬,2，開 拓，張廣峰，楊 瀟，陳祥貴,*

（1.西華大學生物工程學院，食品生物技術(shù)重點實驗室，四川 成都 610039；2.好醫(yī)生藥業(yè)集團，四川 成都 610031）

明膠微球的制備及其對多酚的吸附效果

劉曉曉1，劉 彬1,2，開 拓1，張廣峰1，楊 瀟1，陳祥貴1,*

（1.西華大學生物工程學院，食品生物技術(shù)重點實驗室，四川 成都 610039；2.好醫(yī)生藥業(yè)集團，四川 成都 610031）

采用乳化法制備明膠微球，利用顯微鏡和掃描電鏡進行形態(tài)表征，研究了明膠微球?qū)Σ煌N類多酚的吸附及解吸附作用，考察了明膠微球的重復(fù)使用率。結(jié)果表明：在pH 3.5、35 ℃條件下吸附120 min時，明膠微球?qū)Ρ頉]食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、安石榴苷和原花青素表現(xiàn)出良好的吸附作用，而對綠原酸吸附能力弱。用蒸餾水80 ℃處理120 min，微球上吸附的多酚可較好地解吸附。當微球多酚質(zhì)量比為5∶1時，除綠原酸外，其他多酚的吸附率約54%～78%、單位明膠微球多酚吸附值約107～156 μg/mg、解吸率約60%～75%。明膠微球重復(fù)利用5 次后對EGCG的吸附率和解吸率仍然可達55%以上，但重復(fù)利用8 次后微球吸附性能急劇下降。因此，明膠微球在食品中多酚的去除和回收中具有潛在的應(yīng)用價值。

明膠微球；多酚；吸附；解吸附；重復(fù)利用

多酚是一類廣泛存在于水果、蔬菜中的多羥基類化合物，具有抗氧化、預(yù)防心腦血管疾病、抗癌等多種生物活性[1-4]。盡管多酚化合物具有保健作用，但它又是導(dǎo)致加工食品尤其是果汁、果醋果酒等產(chǎn)品出現(xiàn)褐變和渾濁的主要原因[5-8]。因此，在果汁加工過程中經(jīng)常需要添加明膠除去果汁中的多酚，維持產(chǎn)品的感官品質(zhì)[9-11]。但是，在液-液作用體系中，明膠和多酚只有在一定的比例范圍內(nèi)才能發(fā)生較強的相互作用形成沉淀，明膠過多或過少都不能充分地去除多酚[12]，而對不同產(chǎn)品中的多酚這個比例可能是不同的，這就給實際的生產(chǎn)實踐帶來不確定的因素。聚乙烯吡咯烷酮在除去食品多酚方面展示了良好的前景[13]，但也存在價格昂貴、不能回收利用等缺陷。樹脂尤其是大孔樹脂、殼聚糖等固相介質(zhì)經(jīng)常用于包括多酚在內(nèi)天然產(chǎn)物的吸附分離[14-17]，也有活性炭、改性纖維等固相介質(zhì)用于食品多酚去除的研究報道[18-19]。盡管明膠對多酚類物質(zhì)存在良好的選擇性，常用于食品多酚的去除，但國內(nèi)外尚未見關(guān)于明膠類固相介質(zhì)用于吸附和回收食品多酚的研究報道。為了克服傳統(tǒng)方法的局限，本研究采用乳化法制備明膠微球，并進行形態(tài)表征，考察明膠微球?qū)Σ煌喾拥奈阶饔茫瑸槭称分卸喾拥娜コ突厥仗峁├碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明膠為生化試劑，液體石蠟、司盤80、戊二醛、丙酮、檸檬酸、檸檬酸鈉、酒石酸亞鐵均為分析純成都市科龍化工試劑廠；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、安石榴苷、原花青素、綠原酸、沒食子酸 成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；TDL-408離心機 星科科技公司；電子分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；GSr-2恒溫水浴鍋 北京醫(yī)療設(shè)備廠；精密增力電動攪拌器、pHs-3C型精密數(shù)字式酸度計 上海雷磁儀器廠；KQ-100DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Eclipse Ti-S倒置熒光顯微鏡 日本尼康公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱上海齊欣科學儀器有限公司；S-3400電子掃描顯微鏡日本日立公司；微量移液器 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚含量測定

采用酒石酸亞鐵分光光度法測定多酚含量，參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》中茶多酚的測定方法[20]。

1.3.2 明膠微球的制備與形態(tài)表征

1.3.2.1 微球的制備

微球的制備參考文獻[21-25]，精密量取30 mL液體石蠟于250 mL錐形瓶中，加入450 μL 0.05 g/mL司盤80，攪拌；水浴加熱至55～60 ℃，加入10 mL 0.05 g/mL明膠溶液，60 ℃條件下乳化10 min。乳化結(jié)束后，冰浴，使溫度降至10 ℃以下，加入50 μL質(zhì)量分數(shù)50%的戊二醛，撤去冰浴，固化2 h，用丙酮洗3～4 次后，將制得的微球浸于10 mL丙酮中，4 ℃條件下放置一段時間，濾去丙酮，晾干即得。

1.3.2.2 微球的形態(tài)表征

制得微球樣品后，取少量在載玻片上，用蒸餾水固定后，放在倒置顯微鏡下觀察微球形態(tài)，測定微球直徑并拍照，得到微球光學照片。再取少量明膠微球粉末黏在雙面導(dǎo)電膠上，在真空下噴金3 min（根據(jù)微球的含水量確定時間），在掃描電子顯微鏡下觀察其形態(tài)，測定微球直徑，拍照，得到微球電子掃描照片。

1.3.3 明膠微球的靜態(tài)吸附

1.3.3.1 微球多酚質(zhì)量比對吸附的影響

采用pH 3.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol/L）將不同種類的多酚（EGCG、安石榴苷、綠原酸、原花青素）分別配制成0.88 g/L的多酚溶液，取多酚溶液10 mL，按照不同的微球多酚質(zhì)量比（0.5∶1、1∶1、5∶1、25∶1、50∶1）分別加入不同質(zhì)量的明膠微球，混勻。于35 ℃恒溫水浴鍋中吸附120 min。2 000 r/min離心10 min，取上清液，測定多酚含量。以浸泡相同質(zhì)量明膠微球的pH 3.5磷酸緩沖液為空白對照，計算吸附率。吸附率和吸附值分別用式（1）、（2）計算。

式中：C1為吸附前多酚溶液質(zhì)量濃度/（mg/mL） ；C2為吸附后離心上清液中多酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

式中：x為單位明膠微球吸附值/（μg/mg）；X為明膠微球吸附值（吸附前后溶液中多酚質(zhì)量的差值）/μg；m為明膠微球質(zhì)量/mg。

1.3.3.2 吸附時間對吸附的影響

在10 mL 0.88 g/L的不同多酚溶液中加入44 mg明膠微球，混勻。設(shè)置0、5、15、30、45、60、90、120、150、180、210、240 min的時間梯度，35 ℃條件下發(fā)生吸附作用，2 000 r/min離心10 min，取上清液測多酚含量。

1.3.3.3 吸附溫度對吸附的影響

在10 mL 0.88 g/L的不同多酚溶液中加入44 mg明膠微球，混勻。設(shè)置25、30、35、40、45、50、55 ℃的溫度梯度，靜態(tài)吸附120 min，2 000 r/min離心10min，取上清液測定多酚含量。

1.3.4 明膠微球的靜態(tài)解吸

取1.3.3.1節(jié)中與不同多酚發(fā)生吸附的明膠微球，向其中均加入10 mL蒸餾水，于80 ℃恒溫水浴鍋中作用120 min。2 000 r/min離心10 min，取上清液，測定多酚含量。以蒸餾水浸泡、質(zhì)量相同未發(fā)生相同吸附的明膠微球為空白對照，如式（3）所示計算解吸率。

式中：C1為吸附前多酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C2為吸附后上清液多酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C3為解吸后多酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 明膠微球的重復(fù)利用

在10 mL 0.88 g/L的EGCG溶液中加入44 mg明膠微球，混勻，35 ℃靜態(tài)吸附120 min，2 000 r/min離心10 min，取上清液，測定多酚含量。取出明膠微球，向其中加入10 mL蒸餾水，混勻。80 ℃靜態(tài)解吸120 min，2 000 r/min離心10 min，取上清液，測定多酚含量。對明膠微球如此重復(fù)利用10 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 明膠微球的形態(tài)表征

圖1 明膠微球的形態(tài)表征Fig.1 Microscopic observations of gelatin microspheres

根據(jù)1.3.2.1節(jié)方法制備明膠微球，用顯微鏡進行觀察，同時對制得的微球用掃描電鏡作形態(tài)表征。圖1a可見，微球基本呈球狀，偶有不規(guī)則形狀，大小不很均勻，但直徑均在微米級水平，細小微球趨于聚集。電鏡掃描觀察表明（圖1b），微球形態(tài)表面光滑，表明制備質(zhì)量較好，可用于進一步的實驗中。

2.2 明膠微球靜態(tài)吸附

2.2.1 微球多酚質(zhì)量比對吸附的影響

表1 微球多酚質(zhì)量比對多酚吸附的影響Table1 Adsorption of gelatin microspheres for polyphenols with different mass ratios

由表1可知，隨著質(zhì)量比的提高，微球?qū)Χ喾拥奈铰手饾u提高。微球?qū)GCG、安石榴苷、原花青素和綠原酸都有一定的吸附作用。其中，微球?qū)Π彩褴盏奈阶饔米畲螅瑢G原酸的吸附作用較小。當質(zhì)量比達到5∶1時，微球?qū)GCG、安石榴苷和原花青素的吸附率均達到50%以上。當質(zhì)量比達到25∶1時，微球?qū)GCG、安石榴苷和原花青素微球的吸附率可達到90%左右。當質(zhì)量比超過25∶1后，多酚吸附率增加速率變緩。

從單位明膠微球吸附值分析，當質(zhì)量比為1∶1時，單位明膠微球吸附的多酚量最大，其中安石榴苷達到488.6 μg/mg；隨著質(zhì)量比的增加，單位明膠微球吸附的多酚量迅速下降，但當質(zhì)量比為5∶1時明膠微球?qū)GCG、安石榴苷、原花青素的單位吸附值仍然維持在較高水平（大于100 μg/mg）。

EGCG、安石榴苷、原花青素和綠原酸相對分子質(zhì)量分別為458.38、1 084.72、594.52、354.31。多酚相對分子質(zhì)量越大，被明膠微球吸附越容易，這與明膠與多酚在液相相互作用的趨勢一致。

2.2.2 吸附時間對多酚吸附的影響

圖2 殘留多酚質(zhì)量濃度隨吸附時間的變化關(guān)系圖Fig.2 Residual concentration of polyphenols as a function of adsorption time

由圖2可以看出，隨著吸附時間的延長，溶液中殘留多酚質(zhì)量濃度逐漸降低，但綠原酸的變化不明顯。對于EGCG、安石榴苷、原花青素3 種多酚，在0～60 min時，多酚質(zhì)量濃度變化速率較快；在60～120 min時，多酚質(zhì)量濃度變化速率減小。當吸附時間超過120 min后，殘留的EGCG質(zhì)量濃度變化趨緩，表明此時微球?qū)Χ喾拥奈揭呀柡汀?/p>

2.2.3 吸附溫度對多酚吸附的影響

圖3 殘留的多酚質(zhì)量濃度隨吸附溫度的變化關(guān)系圖Fig.3 Residual concentration of polyphenols as a function of adsorption temperature

圖3結(jié)果表明，當吸附溫度為25～55 ℃時，溶液中殘留多酚質(zhì)量濃度呈先下降后上升的趨勢，但變化都不很顯著，其中綠原酸質(zhì)量濃度變化最小。在35～45 ℃范圍內(nèi)，殘留的安石榴苷質(zhì)量濃度變化不大。溫度過低不利于分子的擴散和碰撞，從而在既定的時間內(nèi)吸附量不高，溫度過高多酚分子的運動加劇，導(dǎo)致解吸附。故可選35 ℃作為微球吸附多酚的最佳溫度。

2.3 明膠微球多酚的解吸附

表2 明膠微球多酚的解吸Table2 Desorption of gelatin microspheres for polyphenols

表2數(shù)據(jù)表明，隨著微球多酚質(zhì)量比的升高，微球上吸附多酚的解吸率下降。當質(zhì)量比為0.5∶1時，明膠微球吸附的多酚幾乎可100%解吸，當質(zhì)量比為1∶1時，明膠微球吸附的多酚解吸率可達90%左右，當質(zhì)量比為5∶1時，明膠微球吸附多酚解吸率約為60%～75%。當質(zhì)量比進一步提高，解吸率迅速下降。因此，微球多酚質(zhì)量比對解吸率具有重要影響，其原因是質(zhì)量比越大，明膠微球上的多酚結(jié)合位點越多，多酚結(jié)合更緊密，因此也就更難解離。

2.4 明膠微球的重復(fù)利用

圖4 重復(fù)利用次數(shù)與吸附/解吸率的關(guān)系Fig.4 Effect of reuse on adsorption and desorption ratee

圖4結(jié)果表明，明膠微球?qū)Χ喾拥奈铰孰S著明膠微球利用次數(shù)的增加呈先增大后減小的趨勢。當明膠微球被第4次利用時，吸附率達到最大值，被利用次數(shù)增大，吸附率開始下降。在利用次數(shù)為1～8時，明膠微球?qū)Χ喾拥奈铰示?0%以上，最高可達72.6%。解吸率最高可達62.5%。明膠微球第5次利用時，其吸附率為59.1%，解吸率為57.7%；第6次利用時，其吸附率為52.4%，解吸率為51.3%。第8次利用后，明膠微球吸附性能顯著下降，但解吸率基本穩(wěn)定。隨著重復(fù)利用次數(shù)增加，微球的結(jié)構(gòu)逐漸破壞，導(dǎo)致吸附性能下降，但微球上還殘留部分未解吸的多酚，可在后續(xù)過程中逐漸釋放出來，因此使得解吸率能保持相對穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

通過吸附實驗發(fā)現(xiàn)，明膠微球?qū)GCG、安石榴苷和原花青素表現(xiàn)出良好的吸附作用，而對綠原酸吸附能力較弱。微球上被吸附的多酚可較好地解吸附。

微球多酚質(zhì)量比對多酚的吸附和解吸附有顯著影響，隨著微球多酚質(zhì)量比的升高，多酚吸附率升高而解吸率下降。當質(zhì)量比為1∶1時，單位明膠微球吸附的多酚量最大。當質(zhì)量比為5∶1時，除綠原酸外，其他多酚的吸附率約54%～78%、單位明膠微球多酚吸附值約107～156 μg/mg、解吸率約60%～75%。

采用EGCG考察了微球多酚質(zhì)量比為5∶1時明膠微球的重復(fù)利用性能，結(jié)果表明重復(fù)利用5 次后多酚吸附率和解吸率仍然可達55%以上，但重復(fù)利用8 次后微球吸附性能急劇下降。本研究表明明膠微球在食品中多酚的去除和回收中具有潛在的應(yīng)用價值。

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Preparation and of Gelatin Microspheres and Their Adsorption Capacity for Polyphenols

LIU Xiao-xiao1, LIU Bin1,2, KAI Tuo1, ZHANG Guang-feng1, YANG Xiao1, CHEN Xiang-gui1,*
(1. Key Laboratory of Food Biotechnology, School of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. Good Doctor Pharmaceutical Group, Chengdu 610031, China)

Gelatin microspheres were prepared by an emulsification technique and characterized with microscope and scanning electron microscope. The adsorption and desorption of various polyphenols by gelatin microspheres was investigated, and the reusability of the microspheres was also evaluated. The results showed that when the adsorption was carried out at 35 ℃ and pH 3.5 for 120 min, gelatin microspheres exhibited good adsorption efficiency for epigallocatechin gallate (EGCG), punicalagins and proanthocyanidins, but demonstrated a weak adsorption for chlorogenic acid. After being treated by distilled water at 80 ℃ for 120 min, the adsorbed polyphenols could be released effectively. When the mass ratio of polyphenols to microspheres was 5:1, the adsorption rates of the other polyphenols except chlorogenic acid were 54%-78% with the amount of polyphenols adsorbed by per unit mass of the microspheres being 107-156 μg/mg, and the desorption rates of the adsorbed polyphenols were 60%-75%. Moreover, the adsorption and desorption rates for EGCG remained at over 55% after fifth repeated reuse of the microspheres, but sharply declined after eighth reuse. This study reveals that the gelatin microspheres can be potentially applied to remove and recover polyphenols in foods.

gelatin microspheres; polyphenols; adsorption; desorption; reuse

TS201.2

A

1002-6630（2014）20-0048-04

10.7506/spkx1002-6630-201420010

2014-06-15

2010年度國家星火計劃項目（2010GA810002）；四川省學術(shù)帶頭人培養(yǎng)基金項目

劉曉曉（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：hbwhhx2014@163.com

*通信作者：陳祥貴（1967—），男，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：chenxianggui@tom.com