響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶酶解草魚蛋白質(zhì)

石 嶺，趙 利*，袁美蘭，蘇 偉，劉 華，陳麗麗，溫慧芳

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（南昌），江西 南昌 330013）

響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶酶解草魚蛋白質(zhì)

石 嶺，趙 利*，袁美蘭，蘇 偉，劉 華，陳麗麗，溫慧芳

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（南昌），江西 南昌 330013）

用Alcalase堿性蛋白酶對草魚蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，比較酶的添加量、pH值、溫度、料液比以及酶解時(shí)間對草魚蛋白水解進(jìn)程的影響，通過響應(yīng)面法優(yōu)化Alcalase堿性蛋白酶酶解反應(yīng)的工藝條件。結(jié)果表明：Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝條件為：加酶量1.8%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 9.0、料液比1∶15、酶解時(shí)間180 min，此條件下蛋白質(zhì)水解度達(dá)到23.46%。

草魚蛋白；酶解；響應(yīng)面

我國是世界漁業(yè)大國，淡水魚產(chǎn)量已經(jīng)連續(xù)20年居世界第一。近年來隨著我國淡水魚產(chǎn)品出口量逐年增加，淡水養(yǎng)殖的發(fā)展空間更加廣闊。但同時(shí)淡水魚產(chǎn)品中還存在著加工利用率低，低附加值產(chǎn)品多，深加工產(chǎn)品少等現(xiàn)象。魚蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后得到的水解物，其溶解性、乳化性、起泡性和流變性等物理特性得到明顯改善[1-2]，且水解液中氨基酸種類齊全[3]，礦物質(zhì)含量豐富，其中不同長度的肽段具有促進(jìn)氨基酸、礦物質(zhì)元素的吸收[4-5]、調(diào)節(jié)脂肪代謝[6-7]、降血壓[8-12]、抗疲勞[13-14]和抗氧化[15-20]等生理功能。本研究采用Alcalase堿性蛋白酶水解草魚蛋白，通過Box-Behnken試驗(yàn)以及響應(yīng)面分析，優(yōu)化Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白的條件，為淡水魚資源的精深加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚 樂買佳超市；Alcalase堿性蛋白酶(200000U/mL)諾維信生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微波耦合酶反應(yīng)器 江南大學(xué)；JJ-2高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；TDL-5A離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；DELTA-320 pH計(jì) 美國梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 草魚魚肉成分的測定

水分含量：GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；蛋白質(zhì)含量：GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》；灰分：GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；脂肪含量：GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》。

1.3.2 草魚蛋白的酶解工藝流程

新鮮魚→宰殺→清洗→采肉→絞碎→取肉→調(diào)節(jié)溫度和pH值→加酶水解→滅酶→離心取上清液→噴霧干燥

1.3.3 草魚蛋白質(zhì)酶解

1.3.3.1 料液比對蛋白質(zhì)水解進(jìn)程的影響

稱取魚肉180、225、300、450、900 g，分別加入4 500 mL水于酶反應(yīng)器中，即固液比為1∶25、1∶20、1∶15、1∶10、1∶5，攪拌混勻，調(diào)節(jié)水浴溫度為55 ℃，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 8.5，待底物溫度上升至設(shè)定溫度，加入魚肉蛋白質(zhì)質(zhì)量3%的Alcalase堿性蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過程中用1 mol/L氫氧化鈉溶液恒定體系pH值。酶解3 h后95 ℃滅酶5 min，離心取上清液，每個(gè)水平分別重復(fù)3次。

1.3.3.2 pH值對蛋白質(zhì)水解進(jìn)程的影響

稱取魚肉300 g，加入4 500 mL水于酶反應(yīng)器中。調(diào)節(jié)水浴溫度為55 ℃，同時(shí)調(diào)節(jié)體系pH值，分別使底物在pH值為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5條件下酶解，其余條件同1.3.3.1節(jié)。

1.3.3.3 溫度對蛋白質(zhì)水解進(jìn)程的影響

稱取魚肉300 g，加入4 500 mL水于酶反應(yīng)器中。調(diào)節(jié)體系pH值為8.5，調(diào)節(jié)水浴溫度分別為45、50、55、60、65 ℃；其余條件同1.3.3.1節(jié)。

1.3.3.4 加酶量對蛋白質(zhì)水解進(jìn)程的影響

分別稱取魚肉300 g，加入4 500 mL水于酶反應(yīng)器中。調(diào)節(jié)體系pH值為8.5，調(diào)節(jié)水浴溫度為55 ℃；向底物中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、1%、1.5%、2%、3%、6%的Alcalase堿性蛋白酶，其余條件同1.3.3.1節(jié)。

1.3.3.5 酶解時(shí)間對蛋白質(zhì)水解進(jìn)程的影響

稱取魚肉300 g，加入4 500 mL水于酶反應(yīng)器中。調(diào)節(jié)體系pH值為8.5，調(diào)節(jié)水浴溫度為55 ℃；向底物中加入蛋白質(zhì)質(zhì)量1% Alcalase堿性蛋白酶，反應(yīng)過程中用1 mol/L氫氧化鈉溶液恒定體系pH值。當(dāng)反應(yīng)體系的pH值幾乎不再改變時(shí)，停止反應(yīng)，95 ℃滅酶5 min，離心取上清液。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)確定的最佳試驗(yàn)因素水平的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，采用Design Expert v7.1.6軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化以及結(jié)果分析。

1.3.5 水解度的測定

水解度(degree of hydrolysis，DH)的計(jì)算采用pH-state 法并參照袁斌等[21]的方法。

式中：h為每克蛋白質(zhì)水解肽鍵的物質(zhì)的量/mmol；V為所消耗的NaOH體積/mL；Nb為NaOH的濃度/(mmol/mL)；mp為底物中蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；htot為每克蛋白質(zhì)中肽鍵的物質(zhì)的量/mmol，對草魚蛋白而言，該值取8.6 mmol[22]；α為氨基的平均解離度。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚魚肉基礎(chǔ)成分

表1 草魚魚肉的化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of grass carp meat

草魚魚肉的基礎(chǔ)成分如表1所示，以干質(zhì)量計(jì)，草魚魚肉蛋白質(zhì)含量為86.86%、脂肪含量為5.22%，草魚魚肉蛋白質(zhì)含量高脂肪含量低，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源。

2.2 Alcalase堿性蛋白酶水解單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對水解度的影響

圖1 料液比對水解度的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on degree of hydrolysis

由圖1可知，隨著底物添加量的減小，水解度總體呈下降趨勢。因?yàn)榈孜锾砑恿枯^低時(shí)酶與底物結(jié)合的幾率較小，故水解度會(huì)降低。增大底物添加量時(shí)水解度會(huì)相應(yīng)的提高；但當(dāng)?shù)孜锾砑恿窟^大時(shí)蛋白溶液的黏度又會(huì)增大，使得流動(dòng)性變差，不利于操作。因此最終選擇料液比為1∶15較為適宜。

2.2.2 pH值對水解度的影響

圖2 pH值對水解度的影響Fig.2 Effect of pH on degree of hydrolysis

由圖2可知，隨著pH值的增加，水解度呈上升趨勢；當(dāng)pH值超過8.5時(shí)，水解度上升比較緩慢，這是因?yàn)锳lcalase堿性蛋白酶對堿性環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，所以溶液的pH值升高，水解度也會(huì)相應(yīng)的提高。但是由于溶液堿性越大，反應(yīng)后中和水解液時(shí)產(chǎn)生的鹽就越多，這將給后續(xù)的處理帶來不便，所以選pH 8.5作為最優(yōu)條件。

圖3 溫度對水解度的影響Fig.3 Effect of temperature on degree of hydrolysis

2.2.3 溫度對水解度的影響由圖3可以看出，當(dāng)溫度在45～55 ℃時(shí)，水解度隨著溫度的升高而增加；當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，水解度達(dá)到最大值25.02%；當(dāng)溫度超過55 ℃時(shí)，水解度開始下降。溫度升高可以提高酶的活性，且有利于底物折疊結(jié)構(gòu)的展開；當(dāng)溫度繼續(xù)升高，超過了酶的最適宜溫度時(shí)，酶逐漸失活，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解度下降[23]。

2.2.4 蛋白酶添加量對水解度的影響

圖4 加酶量對水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme/substrate ratio on degree of hydrolysis

由圖4可知，蛋白質(zhì)的水解度會(huì)隨著Alcalase堿性蛋白酶添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的增多而增大，但當(dāng)Alcalase堿性蛋白酶的添加量超過蛋白質(zhì)質(zhì)量的2%時(shí)，水解度的增加曲線趨于平緩，所以選擇2%為最優(yōu)條件。又由于在工業(yè)生產(chǎn)中出于成本核算的考慮，酶用量一般不超過2%，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中堿性蛋白酶添加量以2%為上限。

2.2.5 酶解時(shí)間對水解度的影響

圖5 酶解時(shí)間酶解對水解度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

由圖5可知，水解度會(huì)隨著酶解時(shí)間的延長而增大，水解曲線呈先快速上升后緩慢上升的的趨勢，當(dāng)時(shí)間達(dá)到180 min時(shí)，蛋白酶基本和蛋白質(zhì)完全作用，繼續(xù)水解底物濃度會(huì)繼續(xù)減小，隨著水解的進(jìn)行酶的特異性催化位點(diǎn)減少，即水解過程中酶逐漸失活[24]。同時(shí)產(chǎn)生的多肽會(huì)與草魚蛋白競爭作為Alcalase堿性蛋白酶的反應(yīng)底物，從而進(jìn)一步抑制蛋白酶的水解作用[25]。考慮到隨著酶解時(shí)間的延長成本會(huì)增加，所以選擇180 min作為最佳條件。

2.3 Alcalase堿性蛋白酶酶解反應(yīng)的響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對草魚蛋白水解度影響較大的3個(gè)因素：pH值（A）、溫度（B）、加酶量（C）為考察對象，以水解度DH（Y）為指標(biāo)，采用Design Expert v 7.1.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)的因素水平如表2所示。

表2 Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and their coded levels tested in response surface analysis

表3 Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

表4 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the developed regression model

圖6 各因素及交匯作用對水解度的影響Fig.6 Response surface plots for the effects of factors and their interactions on degree of hydrolysis

通過統(tǒng)計(jì)分析軟件Design Expert v 7.1.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型為：DH＝21.38＋2.02A＋0.43B＋1.67C－0.87AB＋0.027AC＋0.66BC－0.31A2－0.91B2－1.34C2，回歸分析與方差分析結(jié)果見表3，交互作用的響應(yīng)面分析見圖6。由表4可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著(P＜0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著，且該模型說明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可用于該反應(yīng)的理論推測。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化Alcalase堿性蛋白酶最佳酶解條件參數(shù)為：加酶量1.8%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 9.0，預(yù)測水解度為23.62%，在此條件下酶解180 min，蛋白水解度為23.46%。所以說明響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測值基本吻合，建立的模型可以對實(shí)際工藝進(jìn)行預(yù)測。

3 結(jié) 論

以水解度為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)確定Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白的料液比、pH值、溫度、加酶量的最適范圍。采用Design Expert v7.1.6軟件，通過Box-Behnken試驗(yàn)得到水解度與p H值（A）、溫度（B）、加酶量（C）關(guān)系的回歸模型，回歸方程為：DH＝21.38＋2.02A＋0.43B＋1.67C－0.87AB＋0.027AC＋0.66BC－0.31A2－0.91B2－1.34C2。Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白的最佳酶解工藝為：加酶量1.8%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 9.0、料液比1∶15、酶解時(shí)間180 min，蛋白質(zhì)水解度達(dá)到23.46%。本實(shí)驗(yàn)采用Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白，研究了響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝，而酶解產(chǎn)生的多肽的分離純化以及結(jié)構(gòu)功能仍有待進(jìn)一步的研究。

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Optimizing Conditions for Alcalase-Catalyzed Hydrolysis of Grass Carp Protein by Response Surface Methodology

SHI Ling, ZHAO Li*, YUAN Mei-lan, SU Wei, LIU Hua, CHEN Li-li, WEN Hui-fang
(National R&D Branch Center for Freshwater Fish Processing, College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China)

This study aimed to optimize the conditions for enzymatic hydrolysis of grass carp proteins. Alcalase was used to hydrolyze grass carp proteins. The effects of enzyme/substrate ratio, pH value, temperature, material/liquid ratio and hydrolysis time on the degree of hydrolysis were analyzed. Box-Behnken design (BBD) and response surface methodology (RSM) were adopted to obtain the optimum hydrolysis conditions on the basis of results of single-factor experiments. The degree of hydrolysis of 23.46% was obtained under the optimum hydrolysis conditions of 1.8%, 55 ℃, 1:15, 180 min and 9.0 for enzyme/substrate ratio, temperature, material/liquid ratio, hydrolysis time, and pH, respectively.

grass carp protein; enzymatic hydrolysis; response surface methodology

TS254.4

A

1002-6630（2014）04-0026-04

10.7506/spkx1002-6630-201404006

2013-04-25

江西省高等學(xué)校科技落地計(jì)劃項(xiàng)目（KJLD12009）

石嶺（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：839066518@qq.com

*通信作者：趙利（1967—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：lizhao618@hotmail.com