響應(yīng)面法優(yōu)化豆乳鏈球菌增殖培養(yǎng)基

劉麗莎，陶國(guó)琴，郭 宏，呂曉蓮，賈建會(huì)，彭義交

（1.北京市食品研究所，北京 100162；2.北京食品科學(xué)研究院，北京 100068；3.北京二商集團(tuán)有限責(zé)任公司，北京 100053）

響應(yīng)面法優(yōu)化豆乳鏈球菌增殖培養(yǎng)基

劉麗莎1,2，陶國(guó)琴2，郭 宏1,2，呂曉蓮3，賈建會(huì)1,2，彭義交1,2

（1.北京市食品研究所，北京 100162；2.北京食品科學(xué)研究院，北京 100068；3.北京二商集團(tuán)有限責(zé)任公司，北京 100053）

針對(duì)優(yōu)良酸豆乳發(fā)酵菌株豆乳鏈球菌（Streptococcus sojalactis）SY1.1增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，研究碳氮源對(duì)豆乳鏈球菌生長(zhǎng)的影響，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化豆乳鏈球菌SY1.1的增殖培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明：以AST為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，優(yōu)選大豆蛋白胨和蔗糖為最適氮源和碳源，質(zhì)量比為1∶2，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)11 種促乳酸菌生長(zhǎng)因子進(jìn)行評(píng)價(jià)，利用中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析確定增殖培養(yǎng)基的配方為：蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨20 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、番茄汁85.8 mL/L、胡蘿卜汁109 mL/L、玉米漿6 g/L，pH 6.8。SY1.1以接種量2%，在37℃培養(yǎng)12h時(shí)，活菌數(shù)可達(dá)（8.9±0.2）×108CFU/mL，較初始豆?jié){培養(yǎng)基的活菌數(shù)（1.03×108CFU/mL）提高了7.64 倍。

豆乳鏈球菌；增殖培養(yǎng)基；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；響應(yīng)面法優(yōu)化

酸豆奶是以大豆為原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵制成的乳狀食、飲兩棲型產(chǎn)品。微生物作用能消除大豆的抗?fàn)I養(yǎng)因子和有害物質(zhì)[1-2]，產(chǎn)生多種多肽、氨基酸和具有香味的有機(jī)酸、醇、酯[3]，還具有抗腫瘤、抗氧化、降低膽固醇等保健功能[4]。此外大豆不含膽固醇和乳糖，是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白發(fā)酵原料[5]。

目前對(duì)酸豆乳發(fā)酵工藝研究較多，研究人員利用乳酸乳球菌[6]、嗜熱鏈球菌[7]、干酪乳桿菌[8]、雙歧桿菌[9]等發(fā)酵酸豆乳。但乳酸菌在豆乳中的生長(zhǎng)不及牛乳，存在發(fā)酵風(fēng)味不佳、乳清析出和質(zhì)地粗糙等問(wèn)題[10]，開發(fā)酸豆乳優(yōu)良菌株及發(fā)酵劑非常重要。本項(xiàng)目組從豆?jié){中分離到天然菌株——豆乳鏈球菌（Streptococcus sojalactis）SY1.1，產(chǎn)酸快，凝乳時(shí)間小于3 h，產(chǎn)生濃郁的酸豆乳清香，是理想的酸豆乳發(fā)酵菌種。優(yōu)良的發(fā)酵劑增殖培養(yǎng)基是制備發(fā)酵劑的前提，應(yīng)具備以下特點(diǎn)：目標(biāo)菌株生長(zhǎng)良好、菌體易分離、成本低廉。研究證明Plackett-Burman試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)相結(jié)合可篩選適合菌株增殖的因素，建立連續(xù)變量曲面模型，研究各因素水平及交互作用的影響，能大幅降低勞動(dòng)強(qiáng)度縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，已應(yīng)用于不同種類培養(yǎng)基成分的快速篩選及復(fù)配[11]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)適合豆乳鏈球菌增殖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，優(yōu)化其碳源和氮源，并采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法篩選優(yōu)化豆乳鏈球菌的生長(zhǎng)強(qiáng)化因子[12]，提高菌體密度，為酸豆乳發(fā)酵劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

菌種：豆乳鏈球菌（Streptococcus sojalactis）SY1.1，分離自中國(guó)傳統(tǒng)食品豆?jié){，由北京市食品研究所食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室選育保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

豆?jié){培養(yǎng)基：大豆→清洗→浸泡（10 h）→打漿（豆、水質(zhì)量比1∶8）→過(guò)濾→滅菌（115 ℃、10 min），用于豆乳鏈球菌菌種活化。

TJA固體培養(yǎng)基[13]：用于豆乳鏈球菌活菌計(jì)數(shù)。

TSB培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、AST培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、MSA培養(yǎng)基按《微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用》[14]配制。

番茄汁、胡蘿卜汁和玉米汁：市售新鮮番茄、胡蘿卜和玉米→清洗→熱燙（90～95 ℃、3 min）→榨汁→過(guò)濾→調(diào)配（1 kg果蔬調(diào)配成2 L果汁）→滅菌備用。

1.1.3 試劑

葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米漿 北京藍(lán)弋化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司；牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、酪蛋白 北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 儀器設(shè)備

SCL-1300型垂直流潔凈工作臺(tái) 北京賽伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；PHS-25型酸度計(jì)（數(shù)顯） 上海精密科學(xué)儀器有限公司；722型可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

將SY1.1接種于豆?jié){培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至凝乳，傳代活化3 次至菌種活力恢復(fù)至3.5 h內(nèi)凝乳。

1.2.2 活菌數(shù)測(cè)定

采用傾注平板TJA平板法，37 ℃培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù)。

1.2.3 生物量測(cè)定

采用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定菌液OD600nm，以相應(yīng)未接菌培養(yǎng)液為空白對(duì)照。

1.2.4 SY1.1生長(zhǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的確定

豆乳鏈球菌SY1.1活化后以 2%（約106CFU/mL）接種量分別接入適合乳酸菌增殖的培養(yǎng)基（MRS、AST、M17、TSB、MSA和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基）中，于37 ℃培養(yǎng)12 h，測(cè)定增殖期間生物量（OD600nm）的變化，選擇最適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2.5 碳源對(duì)SY1.1增殖的影響

在AST中以葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖等分別替代碳源（質(zhì)量濃度10 g/L），接種2%（約106CFU/mL）SY1.1，于37 ℃培養(yǎng)12 h，測(cè)定生物量（OD600nm）變化，研究不同碳源對(duì)豆乳鏈球菌生長(zhǎng)的影響。

1.2.6 氮源對(duì)SY1.1增殖的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中按相同含氮量（1.7 g/L）以多價(jià)胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏和酪蛋白胨，替代AST中氮源，接種2%（約106CFU/mL）SY1.1，于37 ℃培養(yǎng)12 h，研究不同氮源對(duì)豆乳鏈球菌生長(zhǎng)的影響。

1.2.7 碳氮比對(duì)SY1.1增殖的影響

按碳氮質(zhì)量比1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3配制不同培養(yǎng)基，接種2%（約106CFU/mL）SY1.1，于37 ℃培養(yǎng)12 h，研究碳氮比對(duì)豆乳鏈球菌生長(zhǎng)的影響。

1.2.8 Plackett-Burman試驗(yàn)研究生長(zhǎng)因子對(duì)SY1.1增殖的影響

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[15-19]報(bào)道的能促進(jìn)乳酸菌增殖的生長(zhǎng)因子，在培養(yǎng)基中添加11種生長(zhǎng)因子：番茄汁（0～100 mL/L）、胡蘿卜汁（0～100 mL/L）、玉米汁（0～100 mL/L）、啤酒汁（0～100 mL/L）、玉米漿（0～50 g/L）、蜂蜜（0～10 g/L）、硫酸鎂（0～0.2 g/L）、硫酸錳（0～0.15 g/L）、氯化鈣（0～0.2 g/L）、硫酸亞鐵（0～0.1 g/L）、吐溫-80（0～1 mL/L）。采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選豆乳鏈球菌SY1.1生長(zhǎng)強(qiáng)化因子，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析等采用Design Expert軟件完成。

1.2.9 響應(yīng)面法優(yōu)化生長(zhǎng)因子添加量

篩選出影響豆乳鏈球菌SY1.1增殖的關(guān)鍵影響因素，采用旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)（Central Composite Rotatable Design，CCRD）法，優(yōu)化該菌增殖的最佳培養(yǎng)基配方。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析等采用Design Expert軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 SY1.1生長(zhǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的確定

對(duì)幾種適合于乳酸菌增殖的培養(yǎng)基進(jìn)行研究，豆乳鏈球菌的增殖情況如圖1所示。

圖1 菌株SY1.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選Fig.1 Screening of basic medium for strain SY1.1

以O(shè)D600nm為指標(biāo)考察SY1.1在6種培養(yǎng)基中的增殖情況，由圖1可知，菌株SY1.1在AST培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，顯著高于MRS培養(yǎng)基（P＜0.01）。AST培養(yǎng)基成分較簡(jiǎn)單、配制方便、溶液澄清無(wú)沉淀，便于在后期進(jìn)行菌體富集濃縮，因此選擇AST培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 碳源對(duì)SY1.1增殖的影響

以AST培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以葡萄糖、乳糖、淀粉分別替代蔗糖，豆乳鏈球菌培養(yǎng)12h后的增殖情況如圖2所示。

圖2 碳源對(duì)菌株SY1.1增殖的影響Fig.2 Screening of carbon source for strain SY1.1

由圖2可知，菌株SY1.1可以代謝葡萄糖、乳糖、蔗糖進(jìn)行增殖，其中蔗糖的效果最佳，因此將蔗糖作為SY1.1增殖培養(yǎng)基的碳源。

2.3 氮源對(duì)SY1.1增殖的影響

在AST中分別添加8種有機(jī)氮源替代AST中氮源，豆乳鏈球菌培養(yǎng)12h后的增殖情況如圖3所示。

圖3 氮源對(duì)菌株SY1.1增殖的影響Fig.3 Screening of nitrogen source for strain SY1.1

由圖3可知，大豆蛋白胨和酵母浸粉較AST培養(yǎng)基能夠顯著提高豆乳鏈球菌的增殖（P＜0.01），大豆蛋白胨效果最佳，其余氮源的增殖效果較差，其中酪蛋白胨不能作為氮源被豆乳鏈球菌利用。豆乳鏈球菌SY1.1分離自傳統(tǒng)豆?jié){中，大豆蛋白胨的氨基酸組成可能更接近SY1.1原生長(zhǎng)環(huán)境——豆?jié){，適合豆乳鏈球菌的增殖。因此，選擇大豆蛋白胨作為豆乳鏈球菌SY1.1的氮源。

2.4 碳氮比對(duì)SY1.1增殖的影響

改變蔗糖和大豆蛋白胨的添加比例（質(zhì)量百分比），豆乳鏈球菌培養(yǎng)12 h后的增殖情況如圖4所示。碳氮比對(duì)菌株生長(zhǎng)有重要作用，直接影響其生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)物的積累。有報(bào)道表明碳氮比在2～0.5時(shí)，菌體生長(zhǎng)情況良好，菌體密度較高[19]。當(dāng)碳氮比小于1∶2時(shí)，豆乳鏈球菌的生物量隨碳氮比增高而增加，超過(guò)1∶2后，豆乳鏈球菌的生物量保持相對(duì)穩(wěn)定，無(wú)明顯的增長(zhǎng)。因此，將培養(yǎng)基中碳氮比確定為1∶2。

圖4 碳氮比對(duì)菌株SY1.1增殖的影響Fig.4 Screening of C/N ratio for strain SY1.1

2.5 影響豆乳鏈球菌SY1.1增殖的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子的確定

通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)（結(jié)果未列出）從11 種已報(bào)道的乳酸菌生長(zhǎng)因子中篩選出影響豆乳鏈球菌SY1.1增殖的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子。番茄汁（P=0.030 8）、胡蘿卜汁（P= 0.034 1）和玉米漿（P=0.012 7）在95%概率水平差異顯著，其余因子均不顯著，因此選擇番茄汁、胡蘿卜汁和玉米漿作為豆乳鏈球菌SY1.1的生長(zhǎng)強(qiáng)化因子，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化進(jìn)一步考察對(duì)SY1.1增殖的影響。乳酸菌是生長(zhǎng)因子異養(yǎng)型微生物，需要額外提供維生素等多種生長(zhǎng)因子，保證菌株的正常代謝，促進(jìn)其生長(zhǎng)。研究表明，多種果蔬汁可促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)，番茄汁和胡蘿卜汁含有豐富的維生素和礦物質(zhì)離子，能滿足乳酸菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求[20]。

2.6 響應(yīng)面分析優(yōu)化SY1.1增殖培養(yǎng)基

通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)選出SY1.1的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子：番茄汁、胡蘿卜汁和玉米漿，按三因素三水平旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)添加至優(yōu)化后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示。

表1 旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果Table1 CCRD design with experimental and predicted cell population of SY1.1

Box-Behnken設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0.7.1軟件響應(yīng)面分析程序進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得3種關(guān)鍵生長(zhǎng)因子與菌體的二次多項(xiàng)式回歸模型方程：

Y=85.80－3.14A＋3.86B＋2.00C－5.00AB－1.75AC＋2.08BC－7.41A2－15.26B2－13.67C2

由該方程得到的預(yù)測(cè)值如表1所示，二次回歸方程及各項(xiàng)方差分析結(jié)果如表2所示。

表2 活菌數(shù)二次多項(xiàng)模型及各項(xiàng)的方差分析Table2 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

由表2方差分析結(jié)果可知，模型P＜0.000 1表明模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0.108＞0.05，在α=0.05水平上不顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.979 7，表明模型相關(guān)性良好；=0.980 2，表明98%的響應(yīng)面變化可以通過(guò)該模型解釋，與實(shí)際情況擬合良好，可用于SY1.1的生長(zhǎng)增殖情況預(yù)測(cè)。

圖5 各因素及其相互作用對(duì)SY1.1活菌數(shù)影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effect of medium components on the growth of SY1.1

除AC項(xiàng)外，其余因素對(duì)SY1.1活菌數(shù)的影響均顯著，AB、BC交互影響顯著，AC交互作用不顯著。由二次多項(xiàng)方程得到的響應(yīng)面三維立體圖及等高線圖如圖5所示，直接反映出各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，等高線稀疏顯示響應(yīng)面曲面圖的平陡。

SY1.1的活菌數(shù)在各因素設(shè)定范圍內(nèi)都有最大值，采用Optimization對(duì)模型求導(dǎo)得出極值點(diǎn)，當(dāng)各因素添加量為番茄汁8.58 mL/100mL、胡蘿卜汁10.90 mL/100mL、玉米漿0.60 g/100mL時(shí)，模型預(yù)測(cè)最大響應(yīng)值為8.7×108CFU/mL。在上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，按2%接種SY1.1，37℃培養(yǎng)12 h，SY1.1實(shí)際活菌數(shù)為（8.9±0.2）×108CFU/mL，可見該模型能較好預(yù)測(cè)SY1.1的菌體生長(zhǎng)情況。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)從11種生長(zhǎng)強(qiáng)化因子中篩選出番茄汁、胡蘿卜汁和玉米漿為影響SY1.1增殖的關(guān)鍵因素。通過(guò)響應(yīng)面法獲得適合豆乳鏈球菌SY1.1增殖的最佳培養(yǎng)基：蔗糖1 g/100 mL、大豆蛋白胨2 g/100 mL、磷酸氫二鉀0.2 g/100 mL、番茄汁8.58 mL/100 mL、胡蘿卜汁10.90 mL/100 mL、玉米漿0.60 g/100 mL，pH 6.8。豆乳鏈球菌在此培養(yǎng)基中經(jīng)37 ℃培養(yǎng)12 h，活菌數(shù)達(dá)（8.9±0.2）×108CFU/mL，比優(yōu)化前（1.03×108CFU/mL）提高了近7.64 倍，且培養(yǎng)基黏度較小、無(wú)沉淀、菌體易分離，為開發(fā)直投式酸豆乳發(fā)酵劑提供了理論參考。

在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，還需對(duì)SY1.1培養(yǎng)條件及方式進(jìn)行研究，如采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)、細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)等方式[21-22]進(jìn)一步提高活菌數(shù)，并對(duì)其冷凍干燥工藝及保護(hù)劑進(jìn)行研究，以獲得高密度菌體，完成酸豆乳直投式發(fā)酵劑的制備工藝。

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Optimization of Culture Medium for Streptococcus sojalactis SY1.1 Using Response Surf ace Methodology

LIU Li-sha1,2, TAO Guo-qin2, GUO Hong1,2, Lü Xiao-l ian3, JIA Jian-hui1,2, PENG Yi-jiao1,2
(1. Beijing Food Research Institute, Beijing 100162, China; 2. Beijing Academy of Food Sciences, Beijing 100068, China; 3. Beijing Er Shang Group Co. Ltd., Beijing 100053, China)

In this paper, response surface methodology was used to optimize the composition of AST-based culture medium for Streptococcus sojalactis SY1.1 to obtain high density of bacteria. Through single-factor experiments, the optimum carbon source and nitrogen source were found to be sucrose and soy peptone, respectively. The major medium components for SY1.1 were screened by Plackett-Burman design. Then, the optimum culture medium was determined to consist of 10 g/L sucrose, 20 g/L soy peptone, 2 g/L dipotassium phosphate, 85.8 mL/L tomato juice, 109 mL/L carrot juice and 6 g/L corn steep liquor at pH 6.8 by central composite design and response surface analysis. The cell production of SY1.1 cultured in the optimized medium for 12 h at 37 ℃ was (8.9±0.2) ×108CFU/mL, which was 8.64 times higher than that (1.03×108CFU/mL) observed with soymilk as initial medium.

Streptococcus sojalactis; optimum culture medium; Plackett-Burman; response surface optimization

TS214

A

1002-6630（2014）11-0124-05

10.7506/spkx1002-6630-201411025

2013-10-31

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD34B03）；北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Z111100066111007）

劉麗莎（1989—），女，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)槿樗峋l(fā)酵食品開發(fā)。E-mail：liulisha0616@sina.com