苦蕎異槲皮苷對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖及凋亡的影響

李玉英，趙淑娟，白崇智，張立偉，王轉(zhuǎn)花,*

（1. 山西大學(xué) 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006；2.山西省中醫(yī)藥研究院中心實驗室，山西 太原 030012）

苦蕎異槲皮苷對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖及凋亡的影響

李玉英1，趙淑娟1，白崇智2，張立偉1，王轉(zhuǎn)花1,*

（1. 山西大學(xué) 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006；2.山西省中醫(yī)藥研究院中心實驗室，山西 太原 030012）

從苦蕎中提取制備異槲皮苷，研究其對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、凋亡、遷移和細(xì)胞周期的影響。將異槲皮苷作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞和人腎上皮細(xì)胞系293T，通過噻唑藍(lán)法檢測異槲皮苷對其增殖的影響；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamino-2-phenyl indole，DAPI) 熒光染色法觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化；劃痕擦傷遷移實驗檢測異槲皮苷對SGC-7901細(xì)胞遷移能力的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測異槲皮苷對SGC-7901細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明：苦蕎異槲皮苷可以抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖，并呈時間和劑量依賴性，當(dāng)用100 ?mol/L異槲皮苷作用細(xì)胞48 h后，對SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到35.92%， 而對人腎上皮細(xì)胞系293T的增殖抑制率僅為 3.15%；DAPI熒光染色法觀察異槲皮苷處理細(xì)胞后，染色體凝聚，有凋亡小體產(chǎn)生；劃痕擦傷實驗顯示，異槲皮苷能抑制SGC-7901細(xì)胞的遷移；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，異槲皮苷可使G1和S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞增多，且細(xì)胞凋亡率明顯增加。綜上所述，苦蕎麥異槲皮苷能夠誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡，阻斷細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞增殖和遷移。

異槲皮苷；人胃癌細(xì)胞SGC-7901；細(xì)胞周期；凋亡；細(xì)胞遷移

苦蕎是我國傳統(tǒng)的藥食兩用作物，尤其是黑苦蕎，營養(yǎng)價值極高，所含營養(yǎng)成分比較復(fù)雜，主要有生物類黃酮、活性蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、微量元素等[1]，其中黃酮類物質(zhì)的含量較高，并具有極其廣泛的生理和藥理活性，如抗氧化、清除自由基、抗突變、降血糖、抗炎癥、調(diào)節(jié)免疫等功能[2-4]。人體不能自身合成黃酮類化合物，主要從植物中攝取?？嗍w黃酮主要成分為蘆丁，其次還有槲皮素和異槲皮苷等，由于其所在部位不同及提取方法各異，其含量也有所差異，其中異槲皮苷（isoquercetin）是存在于苦蕎中的一種次生代謝產(chǎn)物，主要存在于苦蕎種子、花及麩皮中。到目前為止，已有一些文獻(xiàn)論述了異槲皮苷抗氧自由基作用[5]，但是關(guān)于它抗腫瘤作用的報道較為少見。胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率和死亡率均較高，而失控性生長和增殖及細(xì)胞凋亡受阻是惡性腫瘤細(xì)胞的重要特征[6-7]，因此，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡將有利于胃癌的預(yù)防和治療，其應(yīng)用前景廣闊。本研究將苦蕎異槲皮苷作用于人胃癌 SGC-7901細(xì)胞，并以人腎上皮細(xì)胞系293T作為對照組，研究其對腫瘤細(xì)胞生長及遷移的抑制作用，以及其對細(xì)胞周期及凋亡的影響等，以期為其抗胃癌的分子機制及應(yīng)用開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

苦蕎麥種子為貴州威黑蕎，由山西省農(nóng)科院農(nóng)作物品種資源研究所提供；人胃癌細(xì)胞株 SGC-7901和人腎上皮細(xì)胞系293T購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫。

DMEM培養(yǎng)液 美國HyClone公司；無支原體胎牛血清 杭州四季青公司；胰酶、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 北京索萊寶科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、DAPI、核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）和碘化丙啶（propidium iodide，PI） 美國Sigma公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（annexinV-FITC）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 美國Bio-Vision公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

流式細(xì)胞儀 美國Elite ESP公司；酶聯(lián)免疫檢測儀美國Bio-Rad公司；激光共聚焦顯微鏡 日本Olympus公司；電子天平 上海天平儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 苦蕎異槲皮苷樣品制備

苦蕎異槲皮苷樣品制備按照文獻(xiàn)[8-10]進(jìn)行，以70%的乙醇為溶劑，固液比為1∶20（m/V），采用索氏提取法進(jìn)行加熱回流提取，粗提液進(jìn)一步經(jīng)酶解后經(jīng)高效液相色譜分析證明，其中的主要成分異槲皮苷純度達(dá)96.7%以上，相對分子質(zhì)量為464.38。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和人腎上皮細(xì)胞系293T在含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 ?g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中生長，并置于37℃、5% CO2相對飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.3 噻唑藍(lán)法檢測細(xì)胞的存活率

選取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞和人腎上皮細(xì)胞系293T，以1×104cells/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加100 ?L培養(yǎng)基，37℃、5% CO2過夜培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁，加入不同濃度（25～200 ?mol/L）異槲皮苷[8]分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加20 ?L MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清每孔加入150 ?L DMSO，室溫低速振蕩10 min，待結(jié)晶物溶解后，于酶標(biāo)免疫測定儀測定波長490 nm處的吸光度（A）值。實驗用0.1% DMSO作為對照。每組設(shè)5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。實驗組均與對照組相比，并用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

腫瘤細(xì)胞的生長抑制率/% = （1－A實驗組/A空白對照組）×100

1.2.4 DAPI染色檢測細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化

將對數(shù)期SGC-7901細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜待細(xì)胞貼壁且生長良好，加入終濃度為100 ?mol/L的異槲皮苷， 對照組用等體積的0.1% DMSO代替，37 ℃培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸緩沖溶液洗滌后重懸于固定液中30 min，之后將懸液低速離心，收集沉淀，用同樣緩沖溶液洗滌2次后將細(xì)胞懸液滴到載玻片上，用2 ?g/mL的DAPI避光染色15 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 劃痕法檢測SGC-7901細(xì)胞的遷移能力

細(xì)胞劃痕法是測定腫瘤細(xì)胞遷移的方法之一。在12孔板背后畫直線做標(biāo)記，取對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞（1×106cells/mL）接種于12孔板，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，磷酸緩沖液洗細(xì)胞2次，用10 ?L移液器槍頭在培養(yǎng)孔的中央沿縱軸方向劃一直線，磷酸緩沖液漂洗細(xì)胞2次，以去除漂浮細(xì)胞。加入終濃度為100 ?mol/L的異槲皮苷，對照組設(shè)為等體積的0.1% DMSO， 培養(yǎng)0～24 h，于倒置顯微鏡下觀察劃痕處細(xì)胞的生長情況。每組檢測5個視野，每組3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

將對數(shù)期SGC-7901細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜待細(xì)胞貼壁后，加入終濃度為100 ?mol/L的異槲皮苷，對照組設(shè)為等體積的0.1% DMSO，37 ℃分別培養(yǎng)24 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗2次，400 ?L 1×Binding buffer重新懸浮細(xì)胞后，分別加入5 ?L的Annexin V-FITC和5 ?L的PI并使其混勻，室溫、避光的條件下孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 細(xì)胞周期的檢測

將對數(shù)期SGC-7901細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜待細(xì)胞貼壁后，加入終濃度為100 ?mol/L的異槲皮苷，對照組設(shè)為等體積的0.1% DMSO，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用胰酶消化收集細(xì)胞，于70%乙醇中4 ℃固定1 h，1 200 r/min離心5 m i n，棄去乙醇，并用P B S洗2次，加P I（10 mg/mL）染液懸浮細(xì)胞，然后在避光條件下37 ℃孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 異槲皮苷抑制腫瘤細(xì)胞的MTT法檢測

圖1 不同濃度的異槲皮苷作用不同的時間對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of isoquercetin concentration on cell proliferation of SGC-7901 cells during different treatment times

由圖1的MTT法檢測結(jié)果可知，苦蕎異槲皮苷濃度為25～200 ?mol/L時，能夠抑制人胃癌細(xì)胞的增殖，隨著濃度的增加和時間的延長，異槲皮苷對SGC-7901細(xì)胞的抑制作用也逐漸增強，即呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。

圖2 異槲皮苷對SGC-7901和293T細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Inhibitory effect of isoquercetin on the growth of SGC-7901 and 293T cells

由圖2可知，苦蕎異槲皮苷各濃度對人腎上皮細(xì)胞系293T的增殖影響很小。100 ?mol/L異槲皮苷作用細(xì)胞48 h后，對SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到35.92%，而對人腎上皮細(xì)胞系293T的增殖抑制率僅為3.15%。實驗組與對照組相比較，均呈現(xiàn)顯著性差異。

2.2 SGC-7901細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化檢測

圖3 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化(×100)Fig.3 Morphological changes of nuclei in SGC-7901 cells under fluorescence microscope (×100)

由圖3可知，經(jīng)異槲皮苷作用后的細(xì)胞核形態(tài)與對照組相比發(fā)生了顯著變化，對照組細(xì)胞的細(xì)胞核染色均勻，并呈現(xiàn)均勻的低強度熒光；當(dāng)用100 ?mol/L異槲皮苷作用SGC-7901細(xì)胞24 h后，染色體凝集，并有凋亡小體產(chǎn)生。實驗結(jié)果表明，經(jīng)異槲皮苷作用的SGC-7901細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡信號。

2.3 異槲皮苷對SGC-7901細(xì)胞遷移能力的影響

圖4 劃痕擦傷實驗檢測SGC-7901細(xì)胞遷移Fig.4 Migration of SGC-7901 cells in scratch-recovering tests

在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上劃痕致傷，然后加入藥物觀察其抑制腫瘤細(xì)胞遷移的能力。由圖4、表1可知，分別培養(yǎng)細(xì)胞12 h和24 h后，SGC-7901細(xì)胞發(fā)生遷移，對照組細(xì)胞分別遷移了4.9 ?m和10.5 ?m，而加入100 ?mol/L異槲皮苷作用后，細(xì)胞分別遷移了2.8 ?m和 6.1 ?m, 細(xì)胞的遷移能力較對照組減弱，當(dāng)用100 ?mol/L異槲皮苷作用細(xì)胞12 h和24 h時，其抑制率分別為42.8%和41.9%，由此可見，苦蕎異槲皮苷可以抑制SGC-7901細(xì)胞的遷移。

表1 異槲皮苷作用SGC-7901細(xì)胞后的遷移距離（x ±s, nn==33）Table 1 Migration distance of SGC-7901 cells in the presence of isoquercettiinn ((x ±s,, n == 33))

2.4 SGC-7901細(xì)胞的凋亡檢測

為了檢測異槲皮苷對胃癌細(xì)胞凋亡的影響，分別用0.1%的DMSO和100 ?mol/L異槲皮苷作用于SGC-7901細(xì)胞24 h，用Annexin V/FITC 和 PI染色，收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測。由圖5可知，對照組早期凋亡率為0.5%，晚期凋亡率為1.3%，用100 ?mol/L的異槲皮苷處理細(xì)胞后的早期凋亡率為6.0%，晚期凋亡率為23.0%，凋亡率均較對照組明顯升高，可見異槲皮苷可以誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測異槲皮苷對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of isoquercetin from F. tataricum on apoptosis of SGC-7901 cells examined by flow cytometric analysis

2.5 異槲皮苷對SGC-7901細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測異槲皮苷對SGC-7901細(xì)胞周期的影響，結(jié)果如圖6所示，用100 ?mol/L的異槲皮苷作用SGC-7901細(xì)胞24 h后，與對照組相比，細(xì)胞在G2/M期的比率增加，而在G1和S期的細(xì)胞比率減少，由此推斷，苦蕎異槲皮苷可能通過阻斷細(xì)胞周期于G2/M期，從而抑制細(xì)胞的增殖。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測異槲皮苷對SGC-7901細(xì)胞周期分布的影響Fig.6 Effect of isoquercetin from F. tataricum on cell cycle distribution of SGC-7901 cells examined by flow cytometric analysis

表2 異槲皮苷對SGC-7901細(xì)胞周期的影響分析Table 2 Effect of isoquercetin fromF. tataricum on cell cycle distribution of SGC-7901 cells

3 討 論

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重威脅著人們的健康，近年來，胃癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢。由于其早期診斷困難、手術(shù)機會低、對放射及化療均不敏感，而植物來源的抗腫瘤藥具有種類多、毒副作用小、不良反應(yīng)少的特點，因此從植物中尋找高效的抗腫瘤藥物已成為一種新的研究思路。從蕎麥中分離出的天然黃酮類小分子物質(zhì)異槲皮苷具有成本低、毒副作用小的特點，提示異槲皮苷可以作為抑制胃癌細(xì)胞生長的一個輔助性藥物，在胃癌的藥物治療方面具有潛在應(yīng)用價值。

細(xì)胞凋亡是機體細(xì)胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的程序化的死亡過程，它的發(fā)生受到機體的嚴(yán)密調(diào)控，許多抗癌藥物都是通過觸發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡通路而達(dá)到抑制腫瘤生長的目的[11-12]。本研究用一定濃度的異槲皮苷作用于胃癌細(xì)胞SGC-7901，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞核中染色體凝集，有凋亡小體產(chǎn)生。

腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性生物學(xué)行為的主要特征，是一個復(fù)雜的多步驟的生物學(xué)過程[13-15]，惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移是引起腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因之一。而遷移是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中必不可缺的環(huán)節(jié)之一，細(xì)胞遷移是多步驟協(xié)同作用的結(jié)果[16]，它不僅是細(xì)胞進(jìn)行很多重要生理活動的基礎(chǔ)，同時也是腫瘤發(fā)生等病理過程中的重要步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)異槲皮苷處理后，可以有效抑制SGC-7901細(xì)胞遷移，其具體機制有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)是一個復(fù)雜的過程，阻滯細(xì)胞增殖周期進(jìn)程會引起凋亡，而凋亡也常伴有細(xì)胞生長阻滯[17-18]。細(xì)胞在一定的條件下，可使細(xì)胞周期進(jìn)程阻斷，導(dǎo)致有絲分裂異常或停滯，使癌細(xì)胞無法繼續(xù)分裂，致使癌細(xì)胞的生長受到抑制[19-20]。當(dāng)用一定濃度的苦蕎異槲皮苷處理SGC-7901細(xì)胞后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞周期分布存在異常，處于G1期和S期的細(xì)胞數(shù)比例減少，而處于G2/M期的細(xì)胞比率增加，提示異槲皮苷可能通過阻滯細(xì)胞在G2/M期來抑制細(xì)胞增生。

本研究采用噻唑藍(lán)和流式細(xì)胞儀等，檢測了異槲皮苷對 SGC-7901 細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，噻唑藍(lán)法檢測結(jié)果表明異槲皮苷可以抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖，并具有時間和劑量依賴性；異槲皮苷作用 SGC-7901細(xì)胞后，可見染色體凝集，并出現(xiàn)凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，異槲皮苷作用SGC-7901 細(xì)胞24 h后， 它可以阻斷細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。由此推斷，阻斷細(xì)胞周期和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡可能是異槲皮苷抗腫瘤作用的重要機制，而本實驗為進(jìn)一步研究異槲皮苷的抗腫瘤作用及苦蕎保健、藥用價值的開發(fā)可提供有參考意義的實驗依據(jù)。

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Effect of Isoquercetin from Fagopyrum tataricum on the Proliferation and Apoptosis of Human Gastric Carcinoma Cell Line SGC-7901

LI Yu-ying1, ZHAO Shu-juan1, BAI Chong-zhi2, ZHANG Li-wei1, WANG Zhuan-hua1,*
(1. Key Laboratory for Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry of Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Central Laboratory of Shanxi Academy of Traditional Chinese Medicine, Taiyuan 030012, China)

Isoquercetin was extracted from Fagopyrum tataricum and investigated for its effect on cell proliferation, apoptosis and migration of human gastric carcinoma cell line SGC-7901. Cell proliferation was examined by using MTT assay. The morphological changes of SGC-7901 were observed by DAPI nuclear staining. The effect of Fagopyrum tataricum isoquercetin on cell migration was investigated by scratch-recovering tests in cell culture plates, as well as its effect on cell apoptosis by flow cytometry. As a result, MTT assay showed that the isoquercetin could inhibit the viability of SGC-7901 cells in time- and dose-dependent manners. SGC-7901 cell growth was inhibited by 35.92% or more at isoquercetin concentration of 100 μmol/L for 48 h, compared to only 3.15% for 293T cells under the same conditions of concentration and culture duration. DAPI nuclear staining showed chromosomal condensation and the production of apoptotic bodies. Scratch-recovering tests indicated that the isoquercetin could suppress cell migration. Flow cytometry showed that the number of cells at the G1phase and S phase decreased and increased at the G2/M phase and the apoptotic cell population exhibited a signifi cant increase. Taken together, isoquercetin from F. tataricum can induce apoptosis, arrest cell cycle and inhibit cell proliferation and migration of SGC-7901 cells.

isoquercetin; human gastric carcinoma cell line SGC-7901; cell cycle; apoptosis; cell migration

R965

A

1002-6630（2014）03-0193-05

10.7506/spkx1002-6630-201403039

2013-03-20

國家自然科學(xué)基金項目（31171659）；山西省自然科學(xué)基金項目（2011011035-4）；山西省高?？萍奸_發(fā)項目（2012004）

李玉英（1969—），女，副教授，博士，研究方向為生物活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)工程。E-mail：lyy9030@sxu.edu.cn

*通信作者：王轉(zhuǎn)花（1956—），女，教授，博士，研究方向為生物活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)工程。E-mail：zhwang@sxu.edu.cn