離子交換固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆制品中烏洛托品殘留量

馬雪濤，牛之瑞，馮 雷，譚健林

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650223）

離子交換固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆制品中烏洛托品殘留量

馬雪濤，牛之瑞，馮 雷，譚健林

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650223）

建立了離子交換固相萃取結(jié)合超高 效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定豆制品中烏洛托品殘留量的分析方法。通過0.4%高氯酸提取，固相萃取凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在正離子模式下，通過多反應(yīng)監(jiān)測方式進(jìn)行檢測。比較了Strata-SCX、SepPak C18和Cleanert PCX三種不同的固相萃取小柱對豆制品中烏洛托品殘留量的凈化和富集，其中Cleanert PCX凈化效果最好。在添加水平為5.0 μg/kg和50.0 μg/kg時(shí)，3種豆制品中烏洛托品的回收率范圍在76.0%～83.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于6%。方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性較好的特點(diǎn)，適合于日常大批量樣品的測定。

烏洛托品；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；豆制品

烏洛托品即六亞甲基四胺是一種化工產(chǎn)品，可用作酚醛塑料的固化劑、氨基塑料的催化劑等用途[1-3]。由于烏洛托品在酸性溶液中能分解放出甲醛和氨而具有殺菌作用，常用于醫(yī)學(xué)上消毒防腐藥物。近些年來有些不法豆制品生產(chǎn)廠家為了延長其產(chǎn)品的保質(zhì)期和保持產(chǎn)品的色澤違規(guī)使用烏洛托品作為防腐保鮮劑，對豆制品質(zhì)量安全和消費(fèi)者身體健康帶來安全隱患[4]。因此，對豆制品中烏洛托品含量檢測與控制顯得尤為必要。

烏洛托品的分析方法主要有分光光度法[5]、離子電極法[6]、氣相色譜法[7-8]、液相色譜法[9]等，實(shí)際應(yīng)用中以氣相色譜法和液相色譜法居多，這兩種方法都存在靈敏度不高，且溶液出現(xiàn)假陽性結(jié)果的弊端[10-12]。液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜的聯(lián)用，使得檢測結(jié)果的靈敏度顯著提高，同時(shí)對陽性樣品進(jìn)行確認(rèn)。

本實(shí)驗(yàn)研究固相萃取對烏洛托品的凈化和富集，建立離子交換固相萃取結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometer，UPLC-MS-MS）對豆制品中烏洛托品殘留量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆腐皮樣品購于昆明市場；烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.2%） 德國Dr. Ehrenstorfer GmnH公司；乙腈、甲醇、乙酸、乙酸銨（均為色譜純） 美國Fisher公司；氨水（分析純） 重慶川東化工有限公司；高氯酸（分析純） 金鹿化工有限公司；Strata-SCX固相萃取小柱（3 mL/60 mg） 美國Phenomenex公司；SepPak C18固相萃取小柱（6 mL/500 mg） 美國Waters公司；Cleanert PCX固相萃取小柱 美國Agela Technologies公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UFLC-20A高效液相色譜 日本Shimadzu公司；API3200三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Applied Biosystems公司，CAPCELL PAK（CR）色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 ?m） 日本Shiseido公司；Shim-pack XR-ODS色譜柱 （75 mm×3.0 mm，2.2 ?m）日本Shimadzu公司；GL-12B高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；N-EVAP氮吹儀 美國Organomation公司；CPA225D電子天平 德國Sartorius公司；十二孔固相萃取裝置 美國Waters公司；Omni均質(zhì)機(jī) 美國Pulsafeeder公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備溶液，避光保存于-20 ℃冰箱中。準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.0 mL，V（體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸）：V（乙腈）=8：2溶解并定容至100 mL，質(zhì)量濃度相當(dāng)于1.0 μg/mL，使用時(shí)，以V（體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸）：V（乙腈）=8：2稀釋成2.0、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 μg/L供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.2 樣品的制備

取樣品中有代表性的約200 g，用組織搗碎機(jī)搗碎，準(zhǔn)確稱取2 g試樣（精確到0.01 g）于10 mL比色管中，加入體積分?jǐn)?shù)0.4%高氯酸溶液定容至10 mL，用均質(zhì)器以10 000 r/min均質(zhì)2 min，再以10 000 r/min離心5 min，取出上清液于50 mL離心管中，加入10 mL石油醚，用均質(zhì)器以10 000 r/min均質(zhì)2 min，再以10 000 r/min離心5 min，用滴管吸去有機(jī)相，留水相備用。

1.3.3 凈化

固相萃取柱使用前分別用3 mL甲醇和體積分?jǐn)?shù)0.4%高氯酸溶液預(yù)處理，并保持柱體濕潤。準(zhǔn)確吸取4.0 mL水相溶液過固相萃取柱，依次用3.0 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸，1.0 mL甲醇淋洗固相萃取柱，棄去流出液，在2 kPa以下減壓抽3 min使柱體干涸；用6.0 mL V（氨水）：V（甲醇）=5：95洗脫，洗脫液在40 ℃下用氮吹儀濃縮至近干，用1.0 mL V（體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸）：V（乙腈）=8：2溶解殘?jiān)?jīng)0.22 μm濾膜過濾，供LC-MSMS測定。

1.3.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：流動(dòng)相A相為10 mmol/L乙酸銨溶液（用乙酸調(diào)pH值到4.5），流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相梯度見表1。流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫：40 ℃。

表1 流動(dòng)相的梯度洗脫程序Table1 Mobile phase composition for gradient elution

質(zhì)譜條件：掃描方式：電噴霧正離子模式（electrospray ionization mass，ESI+）；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；噴霧電壓：5 500 eV；氣簾氣：68.9 kPa；碰撞氣：68.9 kPa；去溶劑溫度：450 ℃；霧化氣：413.5 kPa；輔助氣：344.6 kPa；其他參考條件參見表2。

表2 烏洛托品的質(zhì)譜分析參數(shù)Table2 Mass spectral parameters for urotropine analysis in MRM mode

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離條件的優(yōu)化

分別比較了CR和XR-ODS兩種不同類型的色譜柱，前者分離效果較好。烏洛托品屬于低分子質(zhì)量高極性化合物，在反相材料C18的色譜柱上保留時(shí)間較短，無法和干擾物質(zhì)完全分離，需要使用離子對試劑才能獲得較好的分離效果，而離子對試劑會(huì)對質(zhì)譜產(chǎn)生損害，所以無法應(yīng)用。在CR色譜柱上，由于其分子結(jié)構(gòu)中含有氨基活性基團(tuán)，保留時(shí)間相對較長，峰型較好，而且，可以通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值調(diào)節(jié)烏洛托品在色譜柱上的保留時(shí)間。相對于標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2226—2008《進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中烏洛托品殘留量的檢測方法：液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法》中推薦使用的HILIC色譜柱，實(shí)驗(yàn)組對峰型也進(jìn)行了比較，二者相差不多。因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇使用CR色譜柱進(jìn)行分離。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

同時(shí)考察了不同溶劑對烏洛托品質(zhì)譜響應(yīng)的影響，包括V（水）：V（乙腈）=9：1、0.1%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸水溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸銨溶液（pH 4.5）-乙腈等溶液對質(zhì)譜響應(yīng)的影響，結(jié)果證明采用10 mmol/L乙酸銨溶液（pH 4.5）-乙腈體系時(shí)烏洛托品的響應(yīng)最強(qiáng)，同時(shí)考慮到烏洛托品在酸性溶液中較為穩(wěn)定，因此采用10 mmol/L乙酸銨溶液（pH 4.5）-乙腈體系作為流動(dòng)相，以體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸水溶液-乙腈水溶液作為樣品定容溶液。

采用10 μg/mL烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)溶液以針泵直接進(jìn)樣的方式，分別在正負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子掃描，以確定烏洛托品的準(zhǔn)分子離子，烏洛托品在正離子模式下靈敏度比負(fù)離子模式下響應(yīng)要高，且穩(wěn)定性好。然后再以準(zhǔn)分子離子m/z 141.1作為母離子，對其子離子進(jìn)行全掃描。對碰撞能量、去簇電壓等質(zhì)譜條件優(yōu)化后得到子離子m/z 112.1和m/z 85.1，選取干擾小、豐度強(qiáng)的離子對141.1/85.1作為定量離子對，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.3 固相萃取小柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)研究了SN/T 2226—2008中的樣品前處理方法[13]，發(fā)現(xiàn)該方法相對繁瑣，且在處理豆制品樣品時(shí)油脂較難去除干凈，所以選擇采用水相提取的辦法。分別選用乙腈、甲醇和體積分?jǐn)?shù)0.4%高氯酸溶液進(jìn)行提取效率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明三者提取效率均能滿足要求，其中用乙腈、甲醇提取樣品基質(zhì)時(shí)，樣品中油脂較多，對接下來進(jìn)行的凈化和儀器測定有一定的影響，體積分?jǐn)?shù)0.4%高氯酸溶液提取時(shí)，溶出雜質(zhì)少，對大分子基質(zhì)具有一定的沉降作用，同時(shí)可以簡化操作步驟，最終采用體積分?jǐn)?shù)0.4%高氯酸溶液作為提取溶劑。

表3 3種固相萃取小柱的回收率精密度實(shí)驗(yàn)（n=5）Table3 Effect of solid-phase extraction cartridges on the recovery and precision (n=5)

質(zhì)譜MRM模式下，樣品基質(zhì)對測定的干擾較大，故在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)考慮采用SPE小柱對樣品進(jìn)行凈化[14-18]。采用相同的提取方法，分別采取Strata-SCX、SepPak C18和Cleanert PCX固相萃取小柱對樣品進(jìn)行凈化，通過對回收率及RSD的比較，選擇出最佳的處理方案。通過反復(fù)試驗(yàn)，對確定凈化操作的淋洗和洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定步驟為用3.0 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸、1.0 mL甲醇淋洗，用6.0 mL V（氨水）：V（甲醇）=5：95洗脫，洗脫液在40 ℃下用氮吹儀濃縮至近干，用1.0 mL V（體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸）：V（乙腈）=8：2溶解殘?jiān)?。這樣操作，一方面可以最大程度地降低基質(zhì)干擾，另一方面保證了較好的回收率及重復(fù)性。通過比較，發(fā)現(xiàn)C18柱效果較差；在使用Strata-SCX和Cleanert PCX固相萃取小柱時(shí)，回收率都相對較高，3種固相萃取小柱的回收率結(jié)果見表3。這是由于烏洛托品在C18小柱硅膠基的硅烷化填料上保留時(shí)間很短，極易被洗脫，所以整個(gè)凈化過程也較難控制，烏洛托品的回收率較差。烏洛托品分子結(jié)構(gòu)中帶有氨基，呈弱堿性，利用其在酸性條件下帶正電，具有陽離子交換特性，選擇帶有強(qiáng)陽離子交換反相吸附劑的固相萃取柱進(jìn)行選擇性交換吸附，再通過氨化甲醇將其替換洗脫下來，能夠取得更好的富集濃縮效果。但相比較而言，Strata-SCX檢測時(shí)，其采用的填料過細(xì)，極易堵塞，不適合批量樣品檢測；而Cleanert PCX操作簡便，因此更加適用于豆制品中烏洛托品殘留量的檢測工作。

2.4 方法線性范圍和定量限

以空白豆腐皮作為基質(zhì)空白，將烏洛托品配制成相應(yīng)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白樣品當(dāng)中，以烏洛托品的峰面積作為縱坐標(biāo)，烏洛托品的質(zhì)量濃度2.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500.0 ?g/L作為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回得方程y=397x-976，結(jié)果表明烏洛托品在2.0～500.0 ?g/L時(shí)，相關(guān)系數(shù)為0.999，相關(guān)系數(shù)良好。根據(jù)3 倍信噪比確定該方法的檢出限為2 μg/kg，10倍信噪比確定該方法的定量限為5 ?g/kg。烏洛托品的50.0 μg/L基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖見圖1。

圖1 烏洛托品總離子流圖Fig.1 TIC chromatogram of urotropine standard solution at 50.0 μg/L

2.5 回收率、精密度實(shí)驗(yàn)

分別進(jìn)行5.0、50.0 μg/kg的回收率實(shí)驗(yàn)，每份樣品重復(fù)測定3 次，結(jié)果見表4。從表4可知，其平均回收率分別為76.0%～83.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6%。

表4 回收率精密度實(shí)驗(yàn)（n=6）Table4 Average recoveries and precision (RSD) of urotropine in real samples (n=6)

2.6 實(shí)際樣品的測定

通過對昆明市場上的30個(gè)樣品進(jìn)行測定，并未發(fā)現(xiàn)陽性樣品，結(jié)果表明昆明市場上豆制品未發(fā)現(xiàn)非法添加烏洛托品的違法行為。

3 結(jié) 論

本方法采用Cleanert PCX固相萃取小柱對樣品進(jìn)行處理，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)聯(lián)用方法檢測豆制品中的烏洛托品。本方法具有分析速度快、操作簡單、高選擇性和高靈敏度的特點(diǎn)。

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Determination of Urotropine Residue in Processed Soybean Products by Ion Exchange Solid-Phase Extraction Coupled with Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

MA Xue-tao, NIU Zhi-rui, FENG Lei, TAN Jian-lin
(Yunnan Institute of Product Quality Supervision and Inspection, Kumming 650223, China)

An analytical method for the determination of urotropine residue in processed soybean products was developed using ion exchange solid-phase extraction coupled with ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS). Samples were extracted with 0.4% perchloric acid followed by clean-up using solid-phase extraction. The analysis was carried out under negative electrospray ionization mode using multiple reaction monitoring. Cleanert PCX cartridge showed better clean-up and enrichment than Strata-SCX and SepPak C18cartridges for urotropine residue. The average recoveries of urotropine in three kinds of processed soybean products at spiked levels of 5.0 and 50.0 μg/kg ranged from 76.0% to 83.6% with relative standard deviations (RSDs) smaller than 6%. This method is rapid, sensitive, accurate, repeatable and suitable for routine analysis of large-scale samples.

urotropine; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS); processed soybean products

O657.63；O657.7

A

1002-6630（2014）10-0166-04

10.7506/spkx1002-6630-201410031

2013-09-16

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013QK078）

馬雪濤（1974—），女，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。E-mail：mxt_1926@163.com