山梨酸納米防腐顆粒的制備、表征及其緩釋性能

武 陶，丁 武

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

山梨酸納米防腐顆粒的制備、表征及其緩釋性能

武 陶，丁 武*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

為擴(kuò)大山梨酸在肉品保鮮上的應(yīng)用范圍，克服其水溶性差的缺陷，采用離子凝膠法制備山梨酸殼聚糖納米防腐顆粒。以顆粒粒徑與包封率為參考指標(biāo)，通過單因素及正交試驗(yàn)考察殼聚糖質(zhì)量濃度、三聚磷酸鈉質(zhì)量濃度、交聯(lián)時(shí)間、山梨酸質(zhì)量濃度、攪拌時(shí)間等因素對(duì)顆粒粒徑與包封率的影響，確定最優(yōu)制備工藝。通過傅里葉變換紅外光譜，透射電鏡對(duì)顆粒進(jìn)一步表征，并考察其體外釋放性能。結(jié)果表明，制備山梨酸殼聚糖納米粒的最佳工藝為殼聚糖質(zhì)量濃度1 mg/mL、三聚磷酸鈉質(zhì)量濃度0.5 mg/mL、交聯(lián)時(shí)間30 min、山梨酸質(zhì)量濃度 1 mg/mL，該條件下山梨酸顆粒平均粒徑為337.2 nm，包封率為74.3%；紅外光譜表明殼聚糖與山梨酸靜電吸附，山梨酸被包封；透射電鏡圖表明所制顆粒大小均勻，呈規(guī)則球形；緩釋實(shí)驗(yàn)表明：24 h山梨酸的釋放量為50%，納米防腐顆粒具有一定的緩釋特性。

山梨酸；納米顆粒；優(yōu)化；表征

納米顆粒是運(yùn)用納米技術(shù)將物質(zhì)制作成粒徑大小在1～100 nm之間的粒子，具有表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)等特性，目前，納米技術(shù)應(yīng)用廣泛，它能夠給農(nóng)業(yè)以及食品業(yè)帶來全新的思路與方法。將食品材料納米化，可使一些宏觀尺度特征發(fā)生改變，包括質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、加工性能以及貨架期的穩(wěn)定性等[1]。因此納米材料在生物技術(shù)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品工業(yè)等領(lǐng)域大放異彩[2]。

殼聚糖是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，是一類由2-氨基-2-脫氧葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的帶正電荷直鏈多糖。殼聚糖無毒、無刺激性，具有良好的生物相容性和生物可降解性?；谄湮⑿〉念w粒尺寸，殼聚糖納米顆粒可以通過毛細(xì)血管而穿透組織，此特征為活性物質(zhì)在體內(nèi)的遞送提供了保證[3-5]。因而殼聚糖納米粒作為活性物質(zhì)的載體受到了廣泛的關(guān)注[6]。

殼聚糖納米粒的主要制備方法包括共價(jià)交聯(lián)、沉淀析出、大分子復(fù)合、自組裝構(gòu)筑和離子凝膠法等[3]。與其他方法相比，離子凝膠法能在溫和條件下生成粒徑幾十至數(shù)百納米的殼聚糖納米粒，不需使用有機(jī)溶劑和醛類交聯(lián)固化劑，反應(yīng)過程簡便迅速，極具實(shí)用價(jià)值[7]。該法首先由Bodmeier等[8]提出，后經(jīng)Calvo等[9]改進(jìn)。其基本原理為：殼聚糖（chitosan, CS）為聚陽離子電解質(zhì)，當(dāng)它與帶相反電荷的三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）作用時(shí)，通過CS的氨基和TPP的磷酸基團(tuán)之間的靜電吸引作用而產(chǎn)生CS/TPP納米微粒。

山梨酸是國際糧農(nóng)組織和衛(wèi)生組織推薦的高效安全的防腐保鮮劑，是一種分子結(jié)構(gòu)特殊的不飽和有機(jī)酸類，基于結(jié)構(gòu)的共軛雙鍵，山梨酸的化學(xué)反應(yīng)活性高，易于進(jìn)行加成、鹵代、加氫、脫羧及共聚等多種反應(yīng)。對(duì)于霉菌和酵母的生長有很好的抑制作用[10]，但其水溶性較差，限制了其應(yīng)用范圍。目前應(yīng)用較廣的山梨酸類防腐劑為山梨酸鉀，但山梨酸鉀中的山梨酸根需在酸性環(huán)境中結(jié)合H+轉(zhuǎn)變?yōu)樯嚼嫠岬男问讲拍馨l(fā)揮其防腐作用，在堿性或者中性條件下幾乎無效。因此，制備山梨酸納米防腐顆粒是改善山梨酸的分散性，使山梨酸直接發(fā)揮作用，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍的一種手段。

本實(shí)驗(yàn)選擇山梨酸作為被包封活性物質(zhì)，通過離子凝膠法形成山梨酸殼聚糖納米粒，考察影響山梨酸顆粒形成的主要因素，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝，檢測其包封率，分析其體外釋放性能，以期使山梨酸以納米粒的形式直接發(fā)揮其抗菌防腐作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（脫乙酰度≥95%） 上海阿拉丁試劑有限公司；TPP、山梨酸、HAc（均為分析純）；蒸餾水；超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

85-2恒溫測速磁力攪拌器 金壇榮華儀器制造公司；LGJ-10D冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；UV-2500紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；Malvern Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；HT7700透射電子顯微鏡 日立高新技術(shù)公司；Vetex 70 FTIR傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 山梨酸納米顆粒的制備

稱取適量的CS粉末，室溫下溶于1% HAc溶液，用NaOH調(diào)pH值為5，0.45 μm微孔濾膜過濾，后在室溫下攪拌過夜，形成5 mg/mL的殼聚糖溶液。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將CS溶液用超純水稀釋到不同質(zhì)量濃度，交聯(lián)劑TPP溶于超純水，用0.45 μm微孔濾膜過濾。配成0.5 mg/mL TPP溶液。量取一定量的CS溶液加入三角瓶中，放入轉(zhuǎn)子，置于恒溫磁力攪拌器上，逐滴滴加TPP溶液，滴加速率為2～3滴/s，室溫下攪拌30 min（600 r/min），溶液經(jīng)陰陽離子靜電作用交聯(lián)成CS/TPP微粒，作為空白對(duì)照。

稱取適量山梨酸粉末，溶于乙醇，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)配成不同質(zhì)量濃度梯度的溶液，緩慢逐滴將其加入CS溶液中，室溫下溫和攪拌30 min（600 r/min），后逐滴加入TPP溶液，同前溫和攪拌30 min，CS與TPP的質(zhì)量比為5：1，形成山梨酸殼聚糖納米顆粒[11]。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

攪拌速率600 r/min、CS質(zhì)量濃度2 mg/mL、TPP質(zhì)量濃度1.5 mg/mL、CS與TPP質(zhì)量比5：1、CS與TPP交聯(lián)時(shí)間30 min、 山梨酸質(zhì)量濃度0.3 mg/mL，固定以上條件，考察單一因素影響，分別考察CS質(zhì)量濃度（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）、TPP質(zhì)量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）、攪拌速率（400、500、600、700、800 r/min）、交聯(lián)時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）山梨酸質(zhì)量濃度（0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）對(duì)山梨酸殼聚糖納米顆粒粒徑及包封率的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)山梨酸殼聚糖納米顆粒的制備條件，選取CS質(zhì)量濃度、TPP質(zhì)量濃度、交聯(lián)時(shí)間和山梨酸質(zhì)量濃度，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，每個(gè)重復(fù)3 次，取均值，考察因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.4 山梨酸殼聚糖納米粒平均粒徑及表面外觀的測定

平均粒徑的測定：將交聯(lián)一定時(shí)間的膠體溶液通過超聲波分散儀在25 ℃條件下分散60 min，冷卻后用電位分析儀測定其水力學(xué)半徑以及分散度[12]。

表面外觀測定：通過透射電子顯微鏡觀察納米粒的形態(tài)：取一滴懸浮液，用2%的磷鎢酸復(fù)染1.5～2 min，后將其置于鋪有碳支持膜的銅網(wǎng)上，使其自然風(fēng)干。待完全干燥后，置于樣品臺(tái)上，觀察其形態(tài)[13]。

1.3.5 納米顆粒的紅外光譜分析

利用傅里葉變換紅外光譜檢測CS、CS/TPP以及山梨酸殼聚糖納米顆?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)的變化。

取適量CS粉末，以及凍干的CS/TPP與山梨酸殼聚糖納米顆粒粉末，分別與KBr混合壓片，測定其紅外光譜[14]。

1.3.6 山梨酸殼聚糖納米粒的包封率

采用膜分離方法測定游離山梨酸的含量[11]，將山梨酸殼聚糖納米懸浮液置于超濾離心管中，4 000×g離心40 min，游離山梨酸進(jìn)入外層離心管中，在254 nm處測其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定游離山梨酸的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.7 山梨酸殼聚糖納米粒的體外釋放性能

山梨酸殼聚糖納米粒的體外釋放實(shí)驗(yàn)在P B S（pH 7.4）緩沖溶液中進(jìn)行[15]。稱取一定質(zhì)量的納米顆粒（5～10 mg），用2.5～5 mL PBS（pH 7.4）溶液將其重新分散，將分散好的溶液置于經(jīng)過預(yù)處理的截留分子質(zhì)量為12 kD的透析袋中，封口后，將透析袋置于50 mL PBS溶液中，整個(gè)體系保持在37 ℃條件下，100 r/min振搖。每隔一段時(shí)間取出4 mL液體，并向體系中補(bǔ)充4 mL新鮮的PBS溶液，保持體系的總體積不變。在254 nm條件下測定其吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定釋放出的山梨酸含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 山梨酸殼聚糖納米粒制備單因素試驗(yàn)

2.1.1 CS質(zhì)量濃度對(duì)于粒徑及包封率的影響

圖1 CS質(zhì)量濃度對(duì)顆粒粒徑及包封率的影響Fig.1 Effect of CS concentration on particle size and EE

如圖1所示，顆粒粒徑隨CS質(zhì)量濃度的增加而增大。這是由于隨著CS溶液的質(zhì)量濃度增大，當(dāng)TPP溶液加入到其中時(shí)，過量的CS分子與少量的TPP分子互相交聯(lián)，單個(gè)TPP分子交聯(lián)多個(gè)CS分子，從而增大了顆粒的粒徑[16]。同時(shí)，隨著CS質(zhì)量濃度的升高，質(zhì)子化的CS增多，其表面所帶正電荷量增多，CS與TPP交聯(lián)的機(jī)會(huì)增多，形成的顆粒量增大，而山梨酸在酸性溶液中帶負(fù)電，因而包封率會(huì)有所增大，且在CS質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，有最大包封率48%。

2.1.2 TPP質(zhì)量濃度對(duì)于顆粒粒徑及包封率的影響

由圖2可得知，當(dāng)TPP質(zhì)量濃度較低時(shí)，據(jù)CS與TPP的質(zhì)量比，加入TPP的量會(huì)增加，TPP的局部質(zhì)量濃度過高，納米懸浮液的乳光加重，形成的納米粒粒徑增大。當(dāng)TPP質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí)，CS與TPP比例搭配合適，形成顆粒粒徑最小，且山梨酸能很好的與CS/TPP體系結(jié)合，包封率也較高。當(dāng)TPP質(zhì)量濃度大于1.5 mg/mL時(shí)，顆粒粒徑逐漸增大，這可能由于過量TPP分子與少量的CS分子相互交聯(lián)，使得兩者的比例不均，增大了粒徑。

圖2 TPP質(zhì)量濃度對(duì)顆粒粒徑及包封率的影響Fig.2 Effect of TPP concentration on particle size and EE

2.1.3 攪拌速率對(duì)于顆粒粒徑的影響

圖3 攪拌速率對(duì)顆粒粒徑的影響Fig.3 Effect of stirring speed on particle size

由圖3可得知，當(dāng)攪拌速率很低時(shí)，由于TPP滴加到CS溶液中后，轉(zhuǎn)速不能使其充分分散，造成TPP局部質(zhì)量濃度過高，顆粒粒徑較大。隨著攪拌速率的增加，顆粒粒徑降低，說明適宜的速率可使滴加到CS中的TPP溶液分散均勻，兩者的基團(tuán)交聯(lián)更加充分，不會(huì)引起過多的凝聚現(xiàn)象，降低了粒徑的范圍。當(dāng)攪拌速率為600 r/min時(shí)，粒徑達(dá)到最小值，當(dāng)轉(zhuǎn)速大于600 r/min時(shí)，粒徑增大，這可能是高轉(zhuǎn)速所形成的高剪切力使一部分CS、TPP分子的結(jié)構(gòu)破壞，使部分分子不能進(jìn)行正常的交聯(lián)，造成分子之間的凝聚而增大了顆粒粒徑。

2.1.4 CS與TPP交聯(lián)時(shí)間對(duì)顆粒粒徑的影響

由圖4可知，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間較短時(shí)，由于TPP分子沒有充分分散，部分凝聚，導(dǎo)致粒徑增大。當(dāng)交聯(lián)時(shí)間為30 min 時(shí)，其粒徑最小，交聯(lián)狀態(tài)達(dá)到一個(gè)最佳時(shí)間狀態(tài)。當(dāng)時(shí)間大于30 min時(shí)，其粒徑開始增大，可能是由于隨著時(shí)間的延長，CS溶液的黏度降低，攪拌狀態(tài)下，降解速率也會(huì)加快，不能與TPP正常交聯(lián)，導(dǎo)致TPP部分凝聚，粒徑增大。

圖4 CS/TPP交聯(lián)時(shí)間對(duì)顆粒粒徑的影響Fig.4 Effect of CS/TPP cross-linking time on particle size

2.1.5 山梨酸質(zhì)量濃度對(duì)顆粒粒徑及包封率的影響

圖5 山梨酸質(zhì)量濃度對(duì)顆粒粒徑及包封率的影響Fig.5 Effect of sorbic acid concentration on particle size and EE

如圖5所示，隨著山梨酸質(zhì)量濃度的增大，顆粒粒徑呈下降趨勢。山梨酸質(zhì)量濃度增大，則體系中的負(fù)電荷會(huì)增多，帶有負(fù)電荷的山梨酸分子與殼聚糖靜電吸附作用，促進(jìn)了山梨酸殼聚糖納米粒的形成。山梨酸殼聚糖納米粒的包封率隨山梨酸質(zhì)量濃度的升高而降低，可能的原因是，當(dāng)山梨酸質(zhì)量濃度升高時(shí)，大量的山梨酸分子僅僅是吸附在了殼聚糖表面，而沒有與其形成包附作用，可以通過離心使其與殼聚糖納米粒分離開，因此，包封率會(huì)有所下降。

2.2 正交試驗(yàn)

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Design and results of orthogonal array experiments

根據(jù)表2可得，各因素對(duì)顆粒粒徑作用的主次順序?yàn)镃S質(zhì)量濃度＞山梨酸質(zhì)量濃度＞交聯(lián)時(shí)間＞TPP質(zhì)量濃度，對(duì)包封率作用的主次順序?yàn)镃S質(zhì)量濃度＞交聯(lián)時(shí)間＞山梨酸質(zhì)量濃度＞TPP質(zhì)量濃度，按照顆粒粒徑越小越好的原則，最優(yōu)組合為A3B3C1D2，即CS質(zhì)量濃度1 mg/mL、TPP質(zhì)量濃度0.5 mg/mL、交聯(lián)時(shí)間20 min、山梨酸質(zhì)量濃度 0.3 mg/mL，制得的山梨酸顆粒粒徑342.8 nm。包封率的最優(yōu)組合為A3B3C2D3，包封率為74.3%；最終確定最優(yōu)工藝條件為CS質(zhì)量濃度1 mg/mL、TPP質(zhì)量濃度0.5 mg/mL、交聯(lián)時(shí)間30 min、山梨酸質(zhì)量濃度1 mg/mL，該條件下山梨酸顆粒平均粒徑為337.2 nm，包封率為74.3%。

2.3 山梨酸殼聚糖納米粒的表征

2.3.1 最優(yōu)條件下制得顆粒的粒徑分布

圖6 山梨酸殼聚糖納米粒粒徑分布Fig.6 Particle size distribution of sorbic acid-loaded CS/TPP nanoparticles

從圖6可看出，顆粒的平均粒徑為327.4 nm，多分散系數(shù)為0.255，小于0.3，表明顆粒的分散性良好，圖形的峰度較窄，沒有拖尾現(xiàn)象，說明在最優(yōu)條件下制得的山梨酸納米防腐顆粒粒徑分布較為均勻，效果較好，適于實(shí)驗(yàn)后期進(jìn)行顆粒的應(yīng)用研究。

2.3.2 納米顆粒的透射電鏡圖

圖7 山梨酸殼聚糖納米顆粒透射電鏡圖Fig.7 TEM of sorbic acid-loaded CS/TPP nanoparticles

由圖7可見，形成的納米顆粒接近球形，分布均勻，基本無團(tuán)聚現(xiàn)象，粒徑在150～250 nm，這與激光粒度分析儀測得的結(jié)果一致。

2.3.3 紅外光譜結(jié)果

由圖8可見，CS有6 個(gè)特征峰，3 435 cm-1出現(xiàn)—OH的振動(dòng)吸收峰；1 656 cm-1出現(xiàn)C=O的吸收峰；1 597 cm-1出現(xiàn)N—H的彎曲振動(dòng)吸收峰，1 432 cm-1為C—N伸縮振動(dòng)吸收峰，1 376 cm-1為—CH2的彎曲振動(dòng)吸收峰，1 078 cm-1出現(xiàn)—CH3的對(duì)稱變形振動(dòng)以及C—O的骨架振動(dòng)吸收峰。在CS/TPP納米顆粒中，—OH吸收峰變的更為平坦，由3 435 cm-1轉(zhuǎn)移到3 401 cm-1，表明CS與TPP之間的氫鍵作用加強(qiáng)?；赥PP中的磷酸基團(tuán)與CS中氨基的靜電作用，伯氨基、仲氨基的吸收峰分別轉(zhuǎn)移至1 581 cm-1及1 422 cm-1，文獻(xiàn)[11,14]也有相似報(bào)道。在山梨酸殼聚糖納米顆粒（圖8C）中，伯氨基，仲氨基的吸收峰分別轉(zhuǎn)移至1 578 cm-1及1 419 cm-1，這是山梨酸與CS中氨基靜電作用的結(jié)果，同時(shí)證明山梨酸顆粒已被包埋到CS與TPP形成的膠體體系中。

圖8 CS（A）、CS/TPP（B）以及山梨酸殼聚糖納米粒（C）紅外光譜Fig.8 FTIR spectra of CS (A), CS/TPP nanoparticles (B) and sorbi c acid-loaded CS/TPP nanoparticles (C)

2.3.4 山梨酸殼聚糖納米粒的體外緩釋性能

緩釋性是載活性納米顆粒的一個(gè)重要指標(biāo)[17]，緩釋性能可以保持活性物質(zhì)在局部具有較高的濃度，通過活性物質(zhì)的緩慢釋放，可以使其更準(zhǔn)確，更長期的發(fā)揮其作用。山梨酸殼聚糖納米粒在PBS（pH 7.4）溶液中的緩釋曲線見圖9，其緩釋階段可分為初期暴釋和暴釋之后的緩慢釋放期[18]。出現(xiàn)初期暴釋，是由于CS/TPP納米粒表面黏附有山梨酸，這部分山梨酸容易從體系中釋放出來。24 h內(nèi)山梨酸的體外釋放量為50%。緩釋階段持續(xù)時(shí)間較長，這可能是由于分散于CS與TPP之間的山梨酸，其相互間存在有氫鍵作用，靜電引力，因此解脫比較困難。

圖9 山梨酸的體外釋放性能Fig.9 Sorbic acid release profile from nanoparticles

3 結(jié) 論

本研究通過離子凝膠法成功制備了山梨酸納米防腐顆粒，優(yōu)化了山梨酸納米防腐顆粒的制備工藝，得出山梨酸納米防腐顆粒的最優(yōu)制備工藝為CS質(zhì)量濃度1 mg/mL、TPP質(zhì)量濃度0.5 mg/mL、交聯(lián)時(shí)間30 min、山梨酸質(zhì)量濃度1 mg/mL，該條件下山梨酸顆粒平均粒徑為337.2 nm，包封率為74.3%，此外，山梨酸殼聚糖納米顆粒具有一定的緩釋特性，24 h內(nèi)山梨酸的體外釋放量為50%。

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Preparation, Characterization and Release Profiles of Sorbic Acid Nanoparticles

WU Tao, DING Wu*
(College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

Sorbic acid-loaded chitosan (CS) nanoparticles which may have a wider range of application in meat preservation due to the superior water solubility to sorbic acid were prepared using ionic gelation process. The particle size and encapsulation efficiency (EE) were investigated as a function of chitosan concentration, sodium tripolyphosphate (TPP) concentration, cross-linking time, sorbic acid concentration and stirring time by single-factor and orthogonal array designs. The CS nanoparticles were characterized by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and transmission electron microscopy (TEM) and evaluated for release profiles in vitro. The results demonstrated that the best conditions for preparing sorbic acid-loaded CS/TPP nanoparticles were 1 mg/mL CS concentration, 0.5 mg/mL TPP concentration, 1 mg/mL sorbic acid concentration, and cross-linking reaction for 30 min. The average particle size and EE of sorbic acidloaded nanoparticles were 337.2 nm and 74.3%, respectively. The FTIR spectrum confirmed the encapsulation of sorbic acid by electrostatic adsorption, and the TEM observation showed uniform particle size distribution and regular spherical morphology. The release experiments indicated an average release of sorbic acid of 50% in 24 h, confirming its sustained release profiles.

sorbic acid; nanoparticles; optimization; characterization

TS201

A

1002-6630（2014）10-0057-05

10.7506/spkx1002-6630-201410011

2013-07-12

陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（K33202096）

武陶（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)食品深加工與安全控制。E-mail：wut126@163.com

*通信作者：丁武（1971—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)食品深加工與安全控制。E-mail： dingwu10142000@hotmail.com