食品中雞源性成分實時熒光PCR檢測方法的建立

范麗麗，李 培，傅春玲,*，丁洪流，陳 英

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇 蘇州 215128）

食品中雞源性成分實時熒光PCR檢測方法的建立

范麗麗1，李 培2，傅春玲1,*，丁洪流2，陳 英2

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇 蘇州 215128）

目的：建立基于實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的食品中雞源性成分快速檢測方法。方法：以雞線粒體細(xì)胞色素b為目的基因，設(shè)計特異性引物和探針，通過特異性、靈敏性實驗及模擬混合肉樣和市售肉制品檢測，對該體系進(jìn)行驗證。結(jié)果：該雞源熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測體系具有很好的特異性及靈敏性，可檢測3.5 pg/μL雞源DNA的存在；經(jīng)含雞源成分的模擬混合肉樣檢測，證實體系抗干擾能力強(qiáng)；并且通過市售食品檢測表明體系可用于定性加工食品中的雞源成分。結(jié)論：所建立的雞源引物探針體系具有特異性好、靈敏度高、快速高效等優(yōu)點(diǎn)，可用于對食品中雞源性成分的摻假鑒別。

實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；雞；線粒體細(xì)胞色素b基因；食品摻假

隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人民的消費(fèi)需求增長，我國肉類產(chǎn)量逐年增加，其中雞肉產(chǎn)量占據(jù)肉類總產(chǎn)量的13.97%[1]。與此同時，消費(fèi)者對食品質(zhì)量與安全性的要求也越來越高，其中摻雜使假不法行為是消費(fèi)者長期關(guān)注的焦點(diǎn)之一[2]。不法商販、企業(yè)為獲得非法利潤，常以較低價的雞肉冒充牛、羊、豬肉，嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者利益。這不僅涉及經(jīng)濟(jì)、營養(yǎng)價值和食品安全等問題，更直接影響消費(fèi)者的健康，尤其是對某些食物過敏的消費(fèi)者[3]。為維護(hù)廣大消費(fèi)者合法權(quán)益，穩(wěn)定市場秩序，對動物性食品進(jìn)行種源的鑒定顯得十分必要。由于食品種類繁多、成分復(fù)雜、加工程度高等因素，使得常規(guī)檢測方法如電泳、免疫學(xué)技術(shù)、光譜技術(shù)在種源的定性檢測方面多有不足，如靈敏度低、周期長、費(fèi)時費(fèi)力[4-6]。而實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)以DNA為模板，設(shè)計特異引物探針，在封閉的體系中進(jìn)行擴(kuò)增和實時檢測，無需電泳就可以對結(jié)果進(jìn)行分析，避免了PCR產(chǎn)物的污染和溴化乙錠（ethidium bromide，EB）帶來的危害，也縮短了檢測時間[5]；且擴(kuò)增目的片段較短，尤其適用于加工食品。該研究旨在利用實時熒光PCR技術(shù)建立肉食品中雞源成分檢測方法，為質(zhì)檢部門打擊不法商販的食品摻假、造假行為、維護(hù)消費(fèi)者合法利益提供有力的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三黃雞、兒童雞肉酥、火腿腸、撒尿肉丸、火雞等加工食品，以及鮮雞、豬、牛、羊、鴨肉、鴿子、鵪鶉等（通過形態(tài)鑒別） 市售。

組織基因組DNA提取試劑盒及DNA Marker 天根生化科技有限公司；無水乙醇（分析純）；TaqMan Universal PCR master mix 美國ABI公司；DreamTaq PCR Master Mix及引物、探針合成 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5810型臺式高速冷凍離心機(jī)、生物分光光度計 德國Eppendorf公司；7000型實時熒光PCR 美國ABI公司；VORTEX-5渦旋振蕩器 其林貝爾儀器制造有限公司；DKB-1915型恒溫水浴槽、PCR儀 美國Bio-Rad公司；ER-200A凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品均質(zhì)及基因組模板制備

鮮肉和加工食品樣品進(jìn)行均質(zhì)處理，其中純鮮肉豬、牛、羊、雞和鴨等烘干（105 ℃）后再進(jìn)行均質(zhì)處理，作為特異性、靈敏性中的標(biāo)準(zhǔn)純品，以及制作后期模擬混合樣使用，均質(zhì)過程不同肉類分開處理，防止不同動物源性污染。按照組織基因組DNA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行，最終提取光密度（optical density，OD）比值（OD260nm/OD280nm）均在1.7～2.0之間的動物組織DNA，置－20 ℃低溫保存?zhèn)錂z。

1.3.2 引物、探針的設(shè)計合成及有效性驗證

根據(jù)GenBank所公布的雞線粒體細(xì)胞色素b基因序列，利用Primer Express 2.0軟件，依據(jù)引物探針設(shè)計原則，設(shè)計雞特異性引物和探針，GeneBank Accession：GU261719.1，擴(kuò)增目的片段長度為110 bp。引物探針序列見表1。

表1 雞引物探針序列Table1 Sequences of primers and probe for chicken DNA

PCR反應(yīng)體系：DreamTaq PCR Master Mix 25 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，模板DNA（50 ng/μL）2 μL，滅菌去離子水19 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸15 min。PCR結(jié)束后進(jìn)行電泳驗證。

1.3.3 實時熒光PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)循環(huán)參數(shù)

反應(yīng)體系的體積為25 μL：TaqMan PCR master mix；上、下游引物，熒光標(biāo)記探針，各1μL，終濃度皆為0.4 μmol/L；模板DNA（0.0035～70ng/μL）1μL；其余不足用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：50 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 min；95 ℃退火15s，60 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。1.3.4 特異性實驗

以雞、牛、羊、豬、鴨、火雞、鴿子和鵪鶉等純?nèi)馓崛〉腄NA，質(zhì)量濃度70 ng/μL，各取1 μL，分別進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，以驗證所設(shè)計雞引物、探針的特異性。

1.3.5 靈敏度實驗

取純雞肉提取DNA樣品1個，重復(fù)2次，用滅菌雙蒸水10倍比例稀釋，得質(zhì)量濃度0.000 35～70 ng/μL，取1 μL為模板，進(jìn)行實時熒光PCR，重復(fù)3次，檢測所設(shè)計雞引物、探針的靈敏度。

1.3.6 模擬混合肉樣中雞源性成分檢測

為進(jìn)一步檢測雞特異性引物探針體系，制備不同模擬混合肉樣，其中 A、B、C、D分別為雞肉和豬、牛、羊、鴨肉的混合樣品，E為雞、豬、牛、羊和鴨肉的混合樣品，模擬混合肉樣中各肉種所占質(zhì)量百分比見表2。每個混合樣提取DNA樣品1個，重復(fù)2次，進(jìn)行實時熒光PCR，重復(fù)3次，以檢驗該引物探針體系對模擬混合肉樣中雞源性成分的抗干擾檢測能力。

表2 模擬混合肉類樣品Table2 Samples of meat mixtures %

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的有效性驗證

利用所設(shè)計的雞線粒體細(xì)胞色素b基因引物，對雞DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得到得PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，得圖譜如圖1所示，均能得到約110 bp的目的DNA片段，無非特異性雜帶，與預(yù)期所設(shè)計目的片段長度相符。

圖1 雞源引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PCR amplification products of the chicken conservative region of Cyt b gene

2.2 雞源引物探針體系的特異性實驗

為檢測所設(shè)計雞的引物探針體系的特異性，將雞、豬、牛、羊、鴨、火雞、鵪鶉和鴿子等DNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，特異性實驗結(jié)果如圖2所示，引物探針體系只對雞源DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，且重復(fù)性良好，對其他動物源性成分，豬、牛、羊、鴨等肉類 DNA模板均不能擴(kuò)增出正常曲線，正常擴(kuò)增Ct值限定為35，證實該檢測體系具有較好的特異性。

圖2 雞源性引物探針體系的特異性檢測Fig.2 RT-PCR amplification plot showing the specificity of chicken primer-probe system

2.3 雞源引物探針體系的靈敏度實驗

將雞肉DNA模板以10倍比例稀釋，用PCR檢測所設(shè)計引物探針體系的靈敏度，質(zhì)量濃度依次為70、7、0.7、0.07、0.007 ng/μL及0.003 5 ng/μL，擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，各質(zhì)量濃度均獲得正常擴(kuò)增，Ct值范圍為19.85～35.11，且各質(zhì)量濃度重復(fù)性好。其中質(zhì)量濃度0.003 5 ng/μL的模板亦獲得正常擴(kuò)增，證實該體系最低可檢測到3.5 pg/μL的純雞肉DNA，靈敏度較高。

圖3 雞源引物探針體系的靈敏度檢測F ig.3 RT-PCR amplification plots showing the sensitivity of the chicken-specific primer-probe system

2.4 模擬混合樣品雞源性成分檢測

用所建立的雞源性特異引物探針體系，對5類模擬混合肉樣（表2）進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3，5類模擬混合肉樣的擴(kuò)增結(jié)果，均顯示隨雞肉成分含量降低，Ct值呈增高趨勢，與樣品中目的DNA含量由高到低的變化相符，且含0.5%～5%雞肉的所有模擬混合肉樣均獲得成功擴(kuò)增，Ct值范圍為20.43～27.77，證實檢測體系的抗干擾能力較強(qiáng)。

表3 模擬混合肉樣中雞源性成分Ct值的檢測Table3 Detection of chicken-derived ingredients in meat mixtures

2.5 市售食品樣品中雞源性成分檢測

圖4 食品樣品雞源成分檢測Fig.4 Detection of chicken-derived ingredients in food samples using the chicken-specific primer-probe system

為了進(jìn)一步驗證雞引物探針體系的準(zhǔn)確性和實際應(yīng)用能力，對購自市場的標(biāo)簽含有雞肉的食品進(jìn)行檢測。各食品樣品分別為三黃雞（主要成分三黃雞、食鹽、酒、食品添加劑）、兒童雞肉酥（主要成分雞肉松、鹽、糖）、火腿腸（主要成分豬肉和雞肉、食品添加劑等）、速凍撒尿牛丸（主要成分豬肉、牛肉及雞肉等）。4類食品各做3個重復(fù)，擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，均獲得正常擴(kuò)增，Ct值范圍為17.1～21.0之間，驗證雞肉成分的存在，表明所建立的引物探針體系可檢測加工食品中存在的雞源性成分。

3 討 論

目前利用實時熒光PCR對雞源性成分進(jìn)行鑒定的研究較少，其中Dooley等[8]同樣以細(xì)胞色素b基因為目的基因建立實時PCR檢測雞源性成分的方法，檢測限為雞肉含量的0.5%，其方法主要局限性在于適合于生鮮肉樣。本研究所建立方法模擬樣品為烘干高溫肉類樣品，更適合于加工肉類食品的檢測，同時獲得了較高的靈敏度。本方法在用于檢測含0.5%雞肉不同模擬混合肉樣時，各模擬混合肉樣都獲得正常擴(kuò)增，Ct值范圍為20.43～27.77，表明該體系抗干擾能力較強(qiáng)；以純雞肉DNA模板進(jìn)行的靈敏度實驗也顯示該檢測體系具有較好的靈敏度，可檢測低至3.5 pg/μL的雞肉DNA，較之Jonker等[9]建立的檢測體系50 pg/μL更為靈敏；比之于Camma等[10]的體系較差，主要是因為本研究是用經(jīng)過高溫處理的標(biāo)準(zhǔn)樣品做靈敏性檢測，而Camma等的較好靈敏度是經(jīng)生鮮肉測量所得。檢測靶基因是影響熒光PCR檢測靈敏度和特異性的關(guān)鍵因素，本研究中選擇的細(xì)胞色素b基因位于線粒體，而大量線粒體存在于多數(shù)細(xì)胞中，且該基因為多拷貝基因，故可達(dá)到較高靈敏度而適宜于生物種源的定性研究[11]。

國內(nèi)相關(guān)研究中，汪永信等[12]建立的雙重實時熒光PCR法檢測食品和飼料雞源性成分，檢測限為0.1 ng/μL，其在擴(kuò)增目的基因同時，于同一體系內(nèi)進(jìn)行內(nèi)參照擴(kuò)增，以避免假陰性結(jié)果[13]，但采用內(nèi)標(biāo)同時進(jìn)行反應(yīng)，會干擾目的片段的正常擴(kuò)增反應(yīng)，因此不能獲得更高的靈敏度；羅家琴等[14]利用普通PCR檢測飼料中雞源性成分，雖然檢測限可達(dá)0.1%，后期電泳等步驟卻耗時費(fèi)力；王金玲等[13]建立的飼料中雞源性成分PCR和變性高效液相色譜分析相結(jié)合的檢測方法，以12S rRNA基因為靶基因，設(shè)計引物具有較好的特異性，但靈敏度僅為2.04 ng/μL，且該方法相對而言更費(fèi)事耗力。由于上述研究所采用方法的局限性，均不能獲得很好的靈敏度、特異性和便捷性。本研究建立的方法可以避免以往研究的缺陷，具有一定的優(yōu)勢。

在已經(jīng)建立的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法中，GB/T 21103—2007《動物源性飼料中哺乳動物源性成分定性檢測方法》，其規(guī)定了飼料中哺乳動物源性成分通用的熒光PCR檢測法，正常擴(kuò)增的Ct值同樣設(shè)定為35循環(huán)以內(nèi)，檢測限更低為0.1%[16]。但尚無以國家標(biāo)準(zhǔn)形式明確規(guī)定的肉類種源性熒光PCR檢測方法，僅行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2557—2010《畜肉食品中牛成分定性檢測方法實時熒光PCR法》[17]明確了用實時熒光PCR技術(shù)定性牛源成分方法。因此，亟待建立準(zhǔn)確、高效、靈敏的方法檢測食品中雞源性成分。本研究建立的食品中雞源性成分檢測體系具有較好的特異性和高靈敏度，具有準(zhǔn)確、省時等特點(diǎn)，而且通過含雞源成分市售樣品的檢測，證實了其實際應(yīng)用能力，表明該檢測體系可作為市售食品中雞源成分檢測的有效工具。

[1] 劉登勇, 周光宏, 徐幸蓮. 我國肉雞加工業(yè)的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(11): 266-269.

[2] 李家鵬, 喬曉玲, 田寒友, 等. 食品和飼料中動物源性成分檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(9): 340-347.

[3] 王玲, 姜輝, 田亞平. 普通人群14種食物不耐受情況初步分析[J]. 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報, 2007, 28(2): 129-131.

[4] 陳穎, 吳亞君, 徐寶梁, 等. 食品及飼料中馬屬動物源性成分的PCR檢測研究[J]. 中國生物工程雜志, 2004, 24(5): 78-83.

[5] Von HOLST C, HONIKEL K O, UNGLAUD W, et al. Determination of an appropriate heat treatment of animal waste using the ELISA technique: result of a validation survey[J]. Meat Science, 2000, 54(1): 1-7.

[6] 王小燕, 王錫昌, 劉源, 等. 近紅外光譜技術(shù)在食品摻偽檢測應(yīng)用中的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(1): 265-269.

[7] HEID C A, STEVENS J, LIVAK K J, et al. Real time quantitative PCR[J]. Genome Research, 1996, 6(10): 986-994.

[8] DOOLEY J J, PAINE K E, GARRETT S D, et al. Detection of meat species using TaqMan real-time PCR assays[J]. Meat Science, 2004, 68(3): 431-438.

[9] JONKER K, TILBURG J, HAGELE G, et al. Species identification in meat products using real-time PCR[J]. Food Additives and Contaminants, 2008, 25(5): 527-533.

[10] CAMMA C, DOMENICO M D, MONACO F. Development and validation of fast Real-Time PCR assays for species identi cation in raw and cooked meat mixtures[J]. Food Control, 2012, 23(2): 400-404.

[11] BALLIN N Z, VOGENSEN F K, KARLSSON A H. Species determination-can we detect and quantify meat adulteration[J]. Meat Science, 2009, 83(2): 165-174.

[12] 汪永信, 安虹, 程堅, 等. 雙重實時熒光PCR法檢測食品和飼料中的雞源性成分[J]. 生物技術(shù)通報, 2012(1): 134-138.

[13] RODRíGUEZ D, D’AGOSTINO, PLA M, et al. Construction strategy for an internal ampli cation control for real-time diagnostic assays using nucleic acid sequence-based ampli cation: development and clinical application[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2004, 42(12): 5832-5836.

[14] 羅家琴, 王加啟, 卜登攀, 等. 飼料中牛、羊、豬、雞源性成分的PCR檢測方法及其應(yīng)用. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 41(7): 2112-2119.

[15] 王金玲, 賈金生, 李俊環(huán), 等. 飼料中雞源性成分PCR-DHPLC檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報, 2012, 32(3): 493-496.

[16] GB/T 21103—2007 動物源性飼料中哺乳動物源性成分定性檢測方法實時熒光PCR方法[S].

[17] SN/T 2557—2010 畜肉食品中牛成分定性檢測方法實時熒光PCR法[S].

Detection of Chicken-Derived Ingredients in Foods by Fluorescence-Based Quantitative Real-Time PCR

FAN Li-li1, LI Pei2, FU Chun-ling1,*, DING Hong-liu2, CHEN Ying2
(1. School of Public Health, Medical College, Soochow University, Suzhou 215123, China; 2. Suzhou Products Quality Supervision and Inspection Institute, Suzhou 215128, China)

Objective: This study is aimed to establish a fluorescence-based real time polymerase chain reaction (PCR) assay for specific detection of chicken-derived ingredients in foods. Methods: A pair of primers and a Taqman probe targeting the conservative regions of the chicken mitochondrial cytochrome b (Cyt b) gene were designed. The assay system was validated with respect to sensitivity and specificity by detecting mixed meat samples and commercial meat products. Results: The assay was found to be highly specific and sensitive as evidenced by showing no amplification of DNA extracted from other meats and by its capability of detecting 3.5 pg/μL of chicken DNA. Its application for detecting mixed samples of chickenderived ingredients and other meats showed high strong anti-interference performance. Conclusion: The PCR system offers the advantages of high specificity and sensitivity as well as rapidity and is applicable to identify meat products adulterated with chicken-derived ingredients.

real-time PCR; chicken; mitochondrial cytochrome b gene; food adulteration

TS207.3

A

1002-6630（2014）02-0248-04

10.7506/spkx1002-6630-201402048

2013-04-22

蘇州市科技支撐計劃項目（SS201126）

范麗麗（1987—），女，碩士研究生，研究方向為食品衛(wèi)生。E-mail：letitbe2010214@163.com

*通信作者：傅春玲（1962—），女，副教授，博士，研究方向為營養(yǎng)與食品衛(wèi)生。E-mail：fuchunling@suda.edu.cn