熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)白粿干模擬轉(zhuǎn)基因樣品前處理優(yōu)化

張 冰，王志純，邵碧英，繆婷玉，彭 娟，陳文炳,*

（1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建 福州 350003；2.廈門塔斯曼生物工程公司，福建 廈門 361023；3.福建省種子總站，福建 福州 350003）

熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)白粿干模擬轉(zhuǎn)基因樣品前處理優(yōu)化

張 冰1,2，王志純3，邵碧英1，繆婷玉1，彭 娟1，陳文炳1,*

（1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建 福州 350003；2.廈門塔斯曼生物工程公司，福建 廈門 361023；3.福建省種子總站，福建 福州 350003）

為提高米制品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)的靈敏度與檢出率，應(yīng)用模擬轉(zhuǎn)基因白粿干樣品，對(duì)影響檢測(cè)結(jié)果的主要因素，包括樣品顆粒細(xì)度、DNA提取過程中樣品在十六烷基三甲基溴化銨裂解緩沖液中溫育時(shí)間等因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：提取的DNA量在樣品顆粒細(xì)度與十六烷基三甲基溴化銨緩沖液溫育時(shí)間的9種處理組合間都有極顯著差異，其中最優(yōu)條件為樣品顆粒細(xì)度＞100目、十六烷基三甲基溴化銨緩沖液溫育時(shí)間＞8 h（過夜）。采用最優(yōu)前處理組合，樣品的主要轉(zhuǎn)基因成分檢出限從公認(rèn)的轉(zhuǎn)基因含量0.01%（m/m）降到0.001%（m/m），檢測(cè)靈敏度提高10倍，有效提高了米制品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

米制品（白粿干）；轉(zhuǎn)基因成分；實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)；檢出限

DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是目前常用的基因標(biāo)記方法之一，該方法能穩(wěn)定、精確地?cái)U(kuò)增（復(fù)制）具有物種特異性的DNA片段，作為物種的DNA分子標(biāo)記，已被廣泛應(yīng)用于物種鑒定、檢驗(yàn)檢疫與轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)[1-6]等領(lǐng)域。實(shí)時(shí)熒光PCR方法在普通PCR的基礎(chǔ)上，增加了靶基因的探針，使用熒光信號(hào)判別檢測(cè)結(jié)果，使得該方法的特異性與靈敏度大幅度提高，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于稻米及其制品的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)[7-11]。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，被推廣應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因生物種類越來越多，2012年全球有28個(gè)國(guó)家種植了1.7億hm2的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，比2011年增長(zhǎng)6%，是1996年的100倍。據(jù)估計(jì)，2012年全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種子創(chuàng)造的價(jià)值達(dá)到150億美元，主要有轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花、菜籽及甜菜等[12]。由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對(duì)人類、動(dòng)物的健康，生態(tài)環(huán)境等存在不確定性與潛在風(fēng)險(xiǎn)，許多國(guó)家都制定了標(biāo)識(shí)管理等法規(guī)[13-14]對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品嚴(yán)加監(jiān)控。歐盟、日本等對(duì)我國(guó)出口食品的轉(zhuǎn)基因成分檢出是零容忍，2006年9月以來，已有法國(guó)、德國(guó)、意大利、奧地利和日本等國(guó)家因?yàn)闄z出轉(zhuǎn)基因大米成分，對(duì)我國(guó)出口米制品采取了拒絕入境、撤架、召回等措施，并遭到歐盟食品飼料快速預(yù)警系統(tǒng)通報(bào)，并就我國(guó)輸歐盟米制品中的轉(zhuǎn)基因大米成分出臺(tái)緊急措施[15-17]，對(duì)我國(guó)米制品實(shí)施更加嚴(yán)苛的入境檢查。若原料大米因鄰近田塊轉(zhuǎn)基因水稻的串粉而遭受污染，其米制品中的轉(zhuǎn)基因含量甚微[18-19]，實(shí)驗(yàn)室樣品制備與DNA提取等前處理稍有不當(dāng)，就會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、油菜等產(chǎn)品的PCR檢測(cè)，有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[20-22]都規(guī)定需將樣品粉碎至0.5 mm左右；在SN/T 1194—2003《植物及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)抽樣與制樣方法》、SN/T 2584—2010《水稻及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》中[23-24]，對(duì)實(shí)驗(yàn)室樣品處理只有籠統(tǒng)的表述，特別是大米及米制品樣品處理的具體粉碎細(xì)度，迄今為止未見確切的報(bào)道。

樣品的制作以及DNA提取等前處理措施，是PCR檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確與否的重要前提。因此，為降低檢測(cè)方法的檢出限、提高檢出率、保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、建立規(guī)范的技術(shù)操作程序，本研究對(duì)影響米制品中轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的主要前處理因素進(jìn)行分析，采用經(jīng)過研磨、高溫、高壓加工處理、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)難度較大的米制品白粿干（也稱年糕片）為樣品，通過添加轉(zhuǎn)基因大米科豐6號(hào)粉末，配制成模擬轉(zhuǎn)基因樣品，對(duì)樣品研磨細(xì)度、DNA提取過程中的十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）裂解緩沖液溫育時(shí)間等前處理方法進(jìn)行分析與優(yōu)化，以期有效提高米制品轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為建立精準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

非轉(zhuǎn)基因米制品白粿干（片狀）為福建省閩侯佳惠食品有限公司送檢實(shí)驗(yàn)室留樣；轉(zhuǎn)基因大米科豐6號(hào)樣品（轉(zhuǎn)基因大米含量為100%）由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA，TE）緩沖液（pH 8.0）、超純水、蛋白酶K、RNA分解酶 上海生工生物工程有限公司；Premix Ex Taq（2×）（Probe qPCR）試劑盒、大米內(nèi)源基因（GOS）與外源基因（CaMV35S、NOS、Cry1Ab/c）擴(kuò)增用的引物與探針[23]大連寶生物科技公司（序列見表1）；CTAB（分析純） 廣東光華化學(xué)廠有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，分析純） 上海天蓮精細(xì)化工有限公司；Tris-Cl、氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 熒光定量PCR引物/探針序列Table1 Primer/probe sequences used in fluorescence PCR

1.2 儀器與設(shè)備

高速萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器公司；圓振篩（分析篩，內(nèi)徑200 mm，高度50 mm） 德國(guó)Retsch公司；CR22GII高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；移液器、Minispin臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；WB14溫控?fù)u床 德國(guó)Memmert公司；Ultrospec 1100 pro核酸蛋白分析儀 德國(guó)Amersham公司；PCR工作臺(tái) 美國(guó)Labconco公司；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 模擬轉(zhuǎn)基因白粿干樣品制備

每個(gè)樣品均勻分為4份，稱取200 g烘干研磨。非轉(zhuǎn)基因白粿干樣品研磨成粉末，分別過50目（濾過顆粒小于270 μm）與100目（濾過顆粒小于150 μm）圓振篩，制成顆粒細(xì)度＜50目、50～100目、＞100目3個(gè)范圍的樣品。科豐6號(hào)轉(zhuǎn)基因大米樣品粉末過篩方法同上。

非轉(zhuǎn)基因白粿干樣品粉末分別與顆粒細(xì)度相同的轉(zhuǎn)基因大米樣品按照不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行配制。稱取相同顆粒細(xì)度的非轉(zhuǎn)基因白粿干樣品粉末99.99 g與轉(zhuǎn)基因大米樣品0.01 g充分混勻，制成0.01%（m/m）的模擬轉(zhuǎn)基因白粿干樣品。以同樣的方法制作0.001%（m/m）的模擬轉(zhuǎn)基因白粿干樣品。

1.3.2 模擬轉(zhuǎn)基因白粿干樣品DNA提取

采用CTAB法[8]提取DNA，稱取1 g樣品粉末于50 mL離心管中，加入5 mL 20 g/L的CTAB裂解緩沖液，于65 ℃恒溫?fù)u床中振蕩溫育（1、4、＞8 h（過夜）），其他步驟按文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，最后將獲得的DNA溶于300 ?L的0.1×TE緩沖液（pH 8.0）中，充分渦旋后，測(cè)定DNA溶液的OD260nm/OD280nm值與質(zhì)量濃度/（ng/μL）。每份樣品重復(fù)提取2份DNA。

1.3.3 熒光PCR溫度循環(huán)與閾值設(shè)定

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)溫度循環(huán)程序?yàn)椋?5℃，10 min；95 ℃，35 s；60 ℃，60 s；45個(gè)循環(huán)。閾值設(shè)定原則[25]根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。

1.3.4 熒光PCR反應(yīng)體系

熒光PCR單管反應(yīng)體積為20 ?L，引物與探針等試劑加樣量如表2所示。

表2 熒光PCR反應(yīng)體系Table2 Fluorescence PCR reaction systems

1.3.5 樣品前處理對(duì)熒光PCR檢測(cè)的影響

供試白粿干模擬樣品的轉(zhuǎn)基因大米質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%，按照1.3.1節(jié)與1.3.2節(jié)設(shè)置的3種顆粒細(xì)度與3種CTAB溫育時(shí)間，共9種處理方法，各提取2份DNA，每份DNA做2個(gè)熒光PCR反應(yīng)，即每個(gè)樣本做4個(gè)PCR反應(yīng)；共檢測(cè)4個(gè)基因，包括大米內(nèi)源基因（GOS）與3個(gè)外源基因（CaMV35S、NOS、Cry1Ab/c）；總共進(jìn)行144管PCR反應(yīng)，每次（96孔板）實(shí)驗(yàn)都設(shè)置陽性對(duì)照、非轉(zhuǎn)基因大米陰性對(duì)照與雙蒸水（ddH2O）空白對(duì)照各1個(gè)，對(duì)照不正常時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)認(rèn)為無效。

1.3.6 轉(zhuǎn)基因模擬樣品檢出率

CTAB溫育時(shí)間同為＞8 h（過夜）的情況下，對(duì)3種不同顆粒細(xì)度轉(zhuǎn)基因大米質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001%的白粿干模擬轉(zhuǎn)基因樣品，各提取24份DNA，每份DNA做2個(gè)PCR反應(yīng)，共48個(gè)PCR重復(fù)，進(jìn)行3個(gè)外源基因CaMV35S、NOS、Cry1Ab/c的檢出率測(cè)試。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Office Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)不同處理?xiàng)l件下樣品DNA質(zhì)量濃度與內(nèi)源和外源基因的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果（Ct值）的差異顯著性進(jìn)行方差分析，并估算邊際均值圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品顆粒細(xì)度及CTAB溫育時(shí)間對(duì)DNA提取效果的影響

轉(zhuǎn)基因大米質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的白粿干樣品DNA溶液的質(zhì)量濃度平均值如表3所示。各個(gè)組合樣品的DNA溶液OD260nm/OD280nm值都在1.7～1.9范圍內(nèi)，符合PCR檢測(cè)要求。

由表3可知，在相同的顆粒細(xì)度下，提取的DNA質(zhì)量濃度均隨著DNA提取過程中CTAB溫育時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，溫育時(shí)間＞8 h（過夜）條件下提取的DNA質(zhì)量濃度較其他2個(gè)溫育時(shí)間處理高；在溫育時(shí)間相同情況下，DNA質(zhì)量濃度隨樣品顆粒細(xì)度目數(shù)的增加而增高，顆粒大?。?00目的樣品中提取的DNA質(zhì)量濃度比其余2種顆粒細(xì)度要高；CTAB溫育時(shí)間＞8 h（過夜）、顆粒大?。?00目的樣品提取的DNA質(zhì)量濃度在9種處理組合中為最高。

表 33 白粿干模擬轉(zhuǎn)基因樣品提取的DNA平均質(zhì)量濃度Table3 DNA average concentrations in simulated transgenic rice cake samples ng/μL

無重復(fù)雙因素方差分析結(jié)果表明：樣品顆粒細(xì)度與CTAB溫育時(shí)間對(duì)樣品DNA提取質(zhì)量濃度的影響均達(dá)到極顯著水平（F行=30.27，F(xiàn)列=38.50，F(xiàn)0.01=18.00，P＜0.01）。

2.2 前處理對(duì)熒光PCR檢測(cè)的影響

表4 前處理對(duì)白粿干模擬轉(zhuǎn)基因樣品4個(gè)基因Ct值的影響顯著性F檢驗(yàn)Tabllee 44 F test of significant effect of pretreatment on Ct values of 4 genes in simulated transgenic rice cake samples

內(nèi)源基因GOS和外源基因CaMV35S、NOS、Cry1Ab/c熒光PCR測(cè)得的Ct值的F檢驗(yàn)結(jié)果如表4所示，樣品在CTAB裂解緩沖液中的溫育時(shí)間對(duì)內(nèi)源基因GOS和3個(gè)外源基因熒光PCR檢測(cè)結(jié)果都有極顯著影響；樣品顆粒細(xì)度（目數(shù)）因素對(duì)3個(gè)外源基因熒光PCR檢測(cè)結(jié)果都有極顯著的影響；兩因素間的交互作用對(duì)內(nèi)源基因GOS的檢測(cè)結(jié)果有極顯著影響，對(duì)CaMV35S有顯著影響，對(duì)NOS、Cry1Ab/c基因影響均不顯著。3個(gè)外源基因檢測(cè)結(jié)果的估算邊際均值如圖1所示。

圖1 3個(gè)基因的估算邊際均值圖Fig.1 Estimated marginal average Ct values of three genes

結(jié)果表明：樣品顆粒細(xì)度＞100目、CTAB溫育時(shí)間＞8 h的前處理?xiàng)l件下，Ct值均為最小。因此選擇可見樣品顆粒細(xì)度＞100目和溫育時(shí)間＞8 h（過夜）為前處理最佳組合。

2.3 樣品顆粒細(xì)度對(duì)白粿干低含量轉(zhuǎn)基因成分檢出率的影響

CTAB緩沖液溫育同為＞8 h（過夜）的條件下，3個(gè)外源基因CaMV35S、NOS、Cry1Ab/c的檢出率見表5、熒光PCR曲線見圖2。樣品顆粒細(xì)度＜50目時(shí)，CaMV35S、NOS、Cry1Ab/c的檢出率分別為66.67%、70.83%、64.42%；樣品顆粒細(xì)度在50～100目時(shí)，3個(gè)基因檢出率均為87.50%；樣品顆粒細(xì)度＞100目時(shí)，CaMV35S基因檢出率為97.92%，其他2個(gè)基因檢出率均為100%。顆粒細(xì)度＞100目的樣品轉(zhuǎn)基因成分PCR檢測(cè)的Ct值平均數(shù)（n=48）都在陽性結(jié)果判斷值（36）以下（表6），說明前處理中的研磨細(xì)度對(duì)檢出率有顯著影響，恰當(dāng)?shù)那疤幚泶胧┛梢允沟脵z出限，即檢出率穩(wěn)定在95%以上的最低檢出含量[26]，降低到0.001%，比常規(guī)熒光PCR檢出限（0.01%[10,27]）降低10倍。

表5 樣品顆粒細(xì)度對(duì)白粿干模擬樣品轉(zhuǎn)基因成分檢出率的影響Table5 Effect of sample particle size on detection efficiency of transgenic components in simulated rice cake sample%

表6 經(jīng)最優(yōu)前處理后的白粿干模擬樣品轉(zhuǎn)基因成分CCtt平均值Table6 Average Ct values of transgenic components in simulated rice cake samples after the optimum pre-treatment

圖2 經(jīng)最優(yōu)前處理后的白粿干模擬樣品3個(gè)轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR曲線圖Fig.2 Fluorescence PCR curves of three genes in simulated transgenic rice cake samples after the optimum pre-treatment

3 結(jié) 論

結(jié)果表明：樣品顆粒細(xì)度與CTAB溫育時(shí)間對(duì)DNA濃度產(chǎn)生的影響均達(dá)到極顯著水準(zhǔn)。顆粒細(xì)度＞100目、CTAB溫育時(shí)間＞8 h（過夜）的條件下，DNA提取效果最佳、濃度最高。CTAB緩沖液溫育時(shí)間對(duì)內(nèi)源基因GOS和3個(gè)外源基因熒光PCR檢測(cè)結(jié)果都有極顯著影響；樣品顆粒細(xì)度對(duì)3個(gè)外源基因熒光PCR檢測(cè)結(jié)果都有極顯著影響；兩因素間的交互作用僅對(duì)GOS有極顯著影響，對(duì)CaMV35S有顯著影響，而對(duì)NOS、Cry1Ab/c基因影響均不顯著。3個(gè)外源基因檢測(cè)結(jié)果的估算邊際均值表明：樣品顆粒細(xì)度＞100目和溫育時(shí)間＞8 h（過夜）為前處理最佳組合。在CTAB溫育時(shí)間＞8 h（過夜）、樣品顆粒細(xì)度目數(shù)＞100目時(shí)，轉(zhuǎn)基因大米質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001%的模擬白粿干轉(zhuǎn)基因樣品的3個(gè)外源基因（CaMV35S、NOS、Cry1Ab/c）檢出率均在97%以上，而且熒光PCR檢測(cè)結(jié)果Ct平均值都在陽性結(jié)果判斷值以下。

當(dāng)置信水平為95%時(shí)，樣品測(cè)定值與零濃度樣品（不含待測(cè)成分）的測(cè)定值有顯著性差異即為檢出限，實(shí)驗(yàn)要求重復(fù)20次以上[26]。本研究對(duì)添加科豐6號(hào)轉(zhuǎn)基因大米質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001%的白粿干模擬轉(zhuǎn)基因樣品進(jìn)行3種不同顆粒細(xì)度的處理，各重復(fù)提取24份DNA，每份DNA做2個(gè)PCR反應(yīng)，共48個(gè)PCR重復(fù)，結(jié)果表明：優(yōu)化的前處理?xiàng)l件與PCR反應(yīng)體系能夠使熒光PCR方法的檢出限從0.01%（m/m）降低到0.001%（m/m），即檢測(cè)方法靈敏度提高10倍。本研究?jī)H以經(jīng)過研磨、高溫、高壓加工處理、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)難度較大的白粿干模擬轉(zhuǎn)基因樣品進(jìn)行方法優(yōu)化探討，考察前處理?xiàng)l件對(duì)轉(zhuǎn)基因成分定性熒光PCR檢測(cè)結(jié)果的影響，為進(jìn)一步研究使用轉(zhuǎn)基因大米制作的真正的“轉(zhuǎn)基因大米制品”提供依據(jù)與參考；采用更多的轉(zhuǎn)基因食品種類與基因種類作為研究對(duì)象，進(jìn)行熒光PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法的研究。

[1] 陳文炳, 王志明, 李壽崧, 等. 分子標(biāo)記在動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫與GMO產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 33(4): 494-500.

[2] 陳穎, 徐寶梁, 蘇寧, 等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)中的應(yīng)用研究[J]. 作物學(xué)報(bào), 2004, 30(6): 602-607.

[3] 邵碧英, 陳文炳, 楊婕. 馬鈴薯及其制品中轉(zhuǎn)基因成分的多重PCR檢測(cè)[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(1): 178-181.

[4] 孫敏, 粟志平, 梁成珠, 等. 粉絲類產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(6): 230-233.

[5] 陳文炳, 林少華, 邵碧英, 等. 河豚魚Cyt b基因部分DNA序列分析與應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(20): 227-232.

[6] 陳雙雅, 陳文炳, 張津, 等. 應(yīng)用PCR-RFLP和芯片生物分析系統(tǒng)鑒別河豚魚品種[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(22): 200-202.

[7] MADE D, DEGNER C, GROHMANN L. Detection of genetically modified rice: a construct-specific real-time PCR method based on DNA sequence from transgenic Bt rice[J]. European Food Research Technology, 2006, 224(2): 217-278.

[8] REITING R, GROHMANN L, MADE D. A testing cascade for the detection of genetically modified rice by real-time PCR in food and its application for detection of an unauthorized rice line similar to KeFeng6[J]. Journal of Consumer Protection and Food Safety, 2012, 5(2): 185-188.

[9] 吳孝橫, 路勇. 利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因大米[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2009, 25(2): 211-216; 220.

[10] 吳志毅, 張明哲, 陳曦. 大米和米制品Bt 63轉(zhuǎn)基因檢測(cè)PCR方法的靈敏度研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 21(6): 549-554.

[11] 魏霜, 陳貞, 蘆春斌, 等. 多重PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻的轉(zhuǎn)基因成分[J].食品科學(xué), 2012, 33(12): 159-162.

[12] CLIVE J. 2012年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2013, 33(2): 1-8.

[13] KAEPPLER H F. Food safety assessment of genetically modified crops[J]. Agronomy Journal, 2000, 92(4): 793-797.

[14] NICKSON T E. Planning environmental risk assessment for genetically modified crops: problem formulation for stress-tolerant crops[J]. Plant Physiology, 2008, 147(2): 494-502.

[15] European Community. 2008/289/EC: Commission decision of 3 April 2008 on emergency measures regarding the unauthorized genetically modifi ed organism ‘Bt 63’ in rice products[J]. Offi cial Journal of the European Union, 2008, L096: 29-34.

[16] European Community. Commission Implementing Decision of 22 December 2011 on emergency measures regarding unauthorised genetically modified rice in rice products originating from China and repealing Decision 2008/289/EC[J]. Official Journal of the European Union, 2011, L343: 140-148.

[17] European Commission, Health and Consumers Directorate-General, Veterinary and International Affairs. Minutes of the expert group on veterinary cheeks-3 July 2013 (9. Miscellaneous/e) Decision 2013/287/ EU on GM rice from China)(C/OL). Brussels: European Commission, (2013-09-09)[2013-12-16]. http://europa.e U/geninfo/query/resultaction.jsp?SMODE=2&ResultC ount=10&Collection=EuropaFull&Collection=EuropaSL&Collection= EuropaPR&ResultMaxDocs=200&qtype=simple&DefaultLG=en&Re sultTemplate=%2Fresult_en.jsp&page=1&QueryText=2013%2F287% 2FEU&y=17&x=20#queryText=2013%2F287%2FEU&tab=europa&p age=2&filterOn=0.

[18] 戎俊, 宋志平, 蘇軍, 等. Bt/CpTI轉(zhuǎn)基因稻及其非轉(zhuǎn)基因親本對(duì)照在間隔種植條件下的轉(zhuǎn)基因漂移[J]. 生物多樣性, 2006, 14(4): 309-314.

[19] 陸永良, 彭于發(fā), 王渭霞, 等. 抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻基因漂移至常規(guī)栽培稻的頻率研究初報(bào)[J]. 中國(guó)水稻科學(xué), 2010, 24(6): 663-666.

[20] 蔣原, 祝長(zhǎng)清, 林宏. SN/T 1195—2003 大豆中轉(zhuǎn)基因成分的定性PCR檢測(cè)方法[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.

[21] 曹際娟, 陳明生, 盧行安, 等. SN/T 1196—2003 玉米中轉(zhuǎn)基因成分的定性PCR檢測(cè)方法[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.

[22] 潘良文, 沈禹飛, 陳家華, 等. SN/T 1197—2003 油菜籽中轉(zhuǎn)基因成分的定性PCR檢測(cè)方法[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.

[23] 陳紅運(yùn), 黃文勝, 朱水芳, 等. SN/T 1194—2003 植物及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)抽樣與制樣方法[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.

[24] 陳紅運(yùn), 梁新苗, 陳雙雅, 等. SN/T 2584—2010 水稻及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

[25] 蔣春燕, 王泰健, 王琴, 等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2005, 26(12): 97-101.

[26] 孫明. 檢出限的分類與計(jì)算方法[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè), 2012(3): 33-34.

[27] 黃新, 張琰, 侯立華, 等. 轉(zhuǎn)基因水稻‘科豐6號(hào)’實(shí)時(shí)熒光PCR定性定量檢測(cè)方法研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2010(2): 90-93.

Pretreatment Optimization of Simulated Rice Cake Samples for Fluorescence Polymerase Chain Reaction to Detect Transgenic Components

ZHANG Bing1,2, WANG Zhi-chun3, SHAO Bi-ying1, MIAO Ting-yu1, PENG Juan1, CHEN Wen-bing1,*
(1. Inspection and Quarantine Techonology Center, Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350003, China; 2. Xiamen Tasman Bio-Tech Co. Ltd., Xiamen 361023, China; 3. Fujian Provincial Seed Station, Fuzhou 350003, China)

In order to improve the sensitivity and detection limits of transgenic components in rice products, pretreatment conditions for DNA extraction including sample particle size and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) lysis buffer were optimized using simulated transgenic rice cake samples. The results showed that the content of DNA had significant differences among 9 treatment combinations of sample particle size and CTAB lysis buffer incubation time. The content of DNA extracted by the combination of sample particle size larger than 100 mesh and CTAB lysis buffer incubation time longer than 8 h (overnight) was the highest. The detection limit of major transgenic components in rice cake samples was reduced from transgenic content of 0.01% (m/m) to 0.001% (m/m), suggesting that the sensitivity of fluorescence polymerase chain reaction (PCR) was improved by 10 times using the optimal pretreatment. The detection accuracy of genetically modified components in rice products was effectively improved as well.

rice products (rice cake); genetically modified ingredients; fluorescence real time-polymerase chain reaction (RT-PCR); limit of detection

TS213.3

A

1002-6630（2014）02-0243-05

10.7506/spkx1002-6630-201402047

2013-07-23

福建出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（FK2010-28；FK2013-02）

張冰（1988—），女，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：1273495290@qq.com

*通信作者：陳文炳（1962—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品、食品分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。E-mail：621213wbc@163.com