高速逆流色譜分離制備北五味子中科羅索酸

朱力杰，孟憲軍*，李 斌，劉秀英，陶冬冰

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

高速逆流色譜分離制備北五味子中科羅索酸

朱力杰，孟憲軍*，李 斌，劉秀英，陶冬冰

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

建立通過(guò)高速逆流色譜從北五味子中快速分離科羅索酸的方法。將北五味子的乙醇提取物經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂初步純化后直接采用高速逆流色譜進(jìn)行分離，并通過(guò)高效液相色譜法考察了粗提物在不同溶劑體系中的分配情況。結(jié)果表明，最佳溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6∶5∶5∶4，V/V），從150 mg粗提物中一次性分離制備得到6.3 mg純度為97.6%的科羅索酸。該方法分離效率較高，對(duì)科羅索酸在食品醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

高速逆流色譜；科羅索酸；北五味子

北五味子（Schisandra chinensis （Turcz.） Baill）為木蘭科五味子屬植物，主要分布于東北亞地區(qū)[1]，在我國(guó)以遼寧省出產(chǎn)的質(zhì)量為最佳，亦有“遼五味”之稱[2]。其果實(shí)和藤莖作為傳統(tǒng)的藥材和功能性食品，具有保肝、鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞、抗衰老、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤等多種功效[3]。目前對(duì)北五味子化學(xué)成分的研究主要集中在木質(zhì)素[4]、多糖[5]和有機(jī)酸[6]類化合物上，對(duì)于其三萜類化合物的報(bào)道較少且以低純度提取工藝研究為主。研究發(fā)現(xiàn)，北五味子中的三萜類成分——科羅索酸具有很強(qiáng)的生物活性，包括降血糖[7]、抑制癌細(xì)胞增殖[8]、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[9]、保護(hù)細(xì)胞損傷[10]等，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。科羅索酸已進(jìn)入美國(guó)食品和藥物管理局的Ⅲ期臨床藥效學(xué)評(píng)價(jià)[11]，作為食品補(bǔ)充劑已在國(guó)外得到認(rèn)可[12]，在食品、保健品等工業(yè)中具有較好的發(fā)展前景[13]。目前，科羅索酸的分離制備往往采用反復(fù)柱層析[14]等手段，缺乏快速、簡(jiǎn)便的方法，限制了其應(yīng)用。

圖1 科羅索酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of corosolic acid

高速逆流色譜（high speed counter current chromatography，HSCCC）是Ito等[15]發(fā)明的一種新型的液-液分配色譜，與常規(guī)固-液色譜分離方法相比較，由于采用液體作為固定相載體，目標(biāo)化合物在互不相容的兩相由于分配系數(shù)的不同而得以分離，解決了傳統(tǒng)固體載體樣品死吸附、變性、峰形拖尾等問(wèn)題[16]，在食品、醫(yī)藥、天然產(chǎn)物等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[17-23]。本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究[24]的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，準(zhǔn)確、快速地測(cè)定了北五味子藤莖中的科羅索酸在兩相溶劑體系中的分配系數(shù)，從而選定了HSCCC的溶劑體系，制備了高純度的科羅索酸。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北五味子藤莖（2012年產(chǎn)） 撫順青松藥業(yè)有限公司；AB-8大孔樹(shù)脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司；無(wú)水乙醇、正己烷、乙酸乙酯、甲醇等均為分析純；HPLC分析用的乙腈等均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

TBE300B型高速逆流色譜 上海同田生物技術(shù)有限公司；HPLC系統(tǒng)（配有1525型溶劑泵系統(tǒng)、2487型紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器） 美國(guó)Waters公司；AM-500MHz型核磁共振譜儀 瑞士Bruker公司；IKA-MS1型旋渦混合儀 德國(guó)IKA公司；搖擺式高速中藥粉碎機(jī) 浙江溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠；DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 北五味子粗提物的制備

1.3.2 HPLC分析條件

分析色譜柱：Hypersil ODS-2 C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；溫度：25 ℃；樣品質(zhì)量濃度：3 mg樣品溶于1 mL甲醇；進(jìn)樣體積：15 μL；流動(dòng)相流速：1 mL/min；流動(dòng)相：A：水，B：乙腈；檢測(cè)器：紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器（200～800 nm，210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)）；HPLC梯度洗脫程序?yàn)?～20 min，35%～90% B； 20～25 min；90%～95% B；25～30 min，95% B。

1.3.3 分配系數(shù)（K）的測(cè)定

稱取5 mg粗提物粉末，分別溶于不同體積比的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系中，采用1.3.2節(jié)中的HPLC分析方法，取各體系上、下兩相各15 μL，分別進(jìn)樣檢測(cè)，記錄各樣品的峰面積。樣品在不同溶劑體系中的分配系數(shù)按式（1）計(jì)算。

式中：K為分配系數(shù)；cU為上相中的濃度/（mol/L）；cL為下相中的濃度/（mol/L）；AU為上相峰面積/（mAU·s）；AL為下相峰面積/（mAU·s）。

1.3.4 樣品的HSCCC分離

將正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6∶5∶5∶4，V/V）溶劑體系置于分液漏斗中，搖勻，靜置過(guò)夜，取上相為固定相，下相為流動(dòng)相，經(jīng)超聲波脫氣后，用5 mL流動(dòng)相完全溶解樣品。開(kāi)機(jī)打開(kāi)工作站，預(yù)熱后，以20 mL/min的速度將固定相泵入HSCCC的螺旋柱中。待有固定相流出后，將主機(jī)設(shè)置為正轉(zhuǎn)（順時(shí)針），轉(zhuǎn)速緩慢調(diào)至800 r/min，同時(shí)將流動(dòng)相以5 mL/min的速率泵入。至固定相不再流出時(shí)，說(shuō)明溶劑系統(tǒng)已經(jīng)達(dá)到平衡，將流速降至2 mL/min，平衡基線。用流動(dòng)相清洗樣品環(huán)后，將溶解好的樣品經(jīng)由進(jìn)樣閥注入樣品環(huán)中，同時(shí)開(kāi)始采集數(shù)據(jù)，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，按照色譜峰對(duì)目標(biāo)成分進(jìn)行收集。

隨著我國(guó)土地流轉(zhuǎn)的加劇和農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化、規(guī)?；陌l(fā)展，傳統(tǒng)農(nóng)資行業(yè)銷售渠道正面臨著翻天覆地的改變，廠家渠道貼地下沉，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)不斷加劇，新型農(nóng)業(yè)經(jīng)營(yíng)主體和新型服務(wù)平臺(tái)的層出不窮，農(nóng)資企業(yè)在業(yè)務(wù)拓展上受到越來(lái)越多的阻力和挑戰(zhàn)。如何在新的農(nóng)業(yè)發(fā)展形勢(shì)下?lián)肀ё兓?、盤(pán)活市場(chǎng)成為肥料生產(chǎn)企業(yè)亟待破解的難題。

1.3.5 純度分析及結(jié)構(gòu)鑒定

采用1.3.2節(jié)的HPLC分析方法，根據(jù)峰面積歸一化法對(duì)制備得到的樣品進(jìn)行純度分析。HSCCC分離得到的樣品經(jīng)核磁共振氫譜（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）和核磁共振碳譜（13C-NMR）鑒定，核磁共振過(guò)程中溶劑為氘代吡啶（C5D5N），以四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 HSCCC溶劑體系的選擇

表1 不同體積比的溶劑體系下北五味子粗提物的分配系數(shù)Table1 Partitioning coefficients ((K) of the crude extract of Schisannddrraa chineennssiiss (Turcz.) Baill in solvent systems with different volume ratios

選擇合適的溶劑體系是能否成功應(yīng)用HSCCC對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離的關(guān)鍵。根據(jù)相關(guān)原理，通常目標(biāo)物在溶劑體系中的分配系數(shù)在0.5～2之間能達(dá)到滿意的分離效果。本實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)產(chǎn)物存在于70%的乙醇洗脫部位，故選用中等偏弱極性的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系。樣品在該溶劑體系中的分配系數(shù)見(jiàn)表1。體積比為5∶5∶5∶5時(shí)，樣品的分配系數(shù)較小，主要溶解于下相中；其余3個(gè)體積比的溶劑體系的分配系數(shù)均在可分離范圍內(nèi)。故按照1.3.4節(jié)的方法，分別進(jìn)樣考察分離效果，HSCCC色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 北五味子粗提物在不同溶劑體系下的HSCCC色譜圖Fig.2 HSCCC chromatograms of the crude extract of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill in different solvent systems: (a) n-hexane-ethyl acetate-methanol-water (5∶5∶5∶6, V/V), (b) n-hexane-ethyl acetatemethanol-water (6∶5∶5∶5, V/V), and (c) n-hexane-ethyl acetate-methanolwater (6∶5∶5∶4, V/V)

由圖2可知，根據(jù)HSCCC圖譜比較，在體積比為5∶5∶5∶6時(shí)，組分1與其他雜質(zhì)沒(méi)有分開(kāi)，且出峰時(shí)間較為延后；在體積比為6∶5∶5∶5時(shí)，組分1與雜質(zhì)基本分開(kāi)，出峰時(shí)間有一定提前；在體積比為6∶5∶5∶4時(shí)，組分1的分離度和出峰時(shí)間均較為適宜。故最終確定溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6∶5∶5∶4，V/V）。

2.2 目標(biāo)物的HSCCC分離

在溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6∶5∶5∶4，V/V）條件下，按照1.3.4節(jié)的方法進(jìn)行分離。將150 mg樣品用5 mL流動(dòng)相完全溶解樣品后進(jìn)樣。根據(jù)HSCCC色譜圖收集并鑒定各組分，將組分1按純度合并，重結(jié)晶后得到6.3 mg。

2.3 樣品的純度分析

按照1.3.5節(jié)的方法，采用HPLC法對(duì)2.2節(jié)中分離得到的組分1進(jìn)行純度分析，色譜圖見(jiàn)圖3，利用峰面積歸一化法得到組分1的純度為97.6%。

圖3 北五味子粗提物（a）、HSCCC分離得到的組分1（b）的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of the crude extract of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill (a) and component 1 from the crude extract (b) by HSCCC

2.4 樣品的結(jié)構(gòu)鑒定

HSCCC分離得到的組分1在吡啶中為白色針狀結(jié)晶。通過(guò)核磁共振鑒定，其波譜數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（300 MHz，C5D5N，圖4）：d 5.48 （1H, t, J=3.0 Hz），3.41（1H, d, J＝9.0 Hz），2.63（1H, d, J＝11.4 Hz）；1.29, 1.22, 1.09, 1.06, 1.05, 1.03, 1.01 （each 3H, s）。13C-NMR（75 MHz，C5D5N，圖5）：48.0（C-1）, 68.6（C-2），83.8（C-3），40.0（C-4），55.9（C-5），18.9（C-6），33.5（C-7），39.9（C-8），48.1（C-9），38.5（C-10），23.8（C-11），125.6（C-12），139.3（C-13），42.6（C-14），28.7（C-15），24.9（C-16），48.0（C-17），53.5（C-18），39.4（C-19），39.4（C-20），31.1（C-21），37.5（C-22），29.4（C-23），17.7（C-24），17.0（C-25），17.5（C-26），23.9（C-27），179.9（C-28），21.4（C-29），17.5（C-30）。與文獻(xiàn)[25]對(duì)照，將該化合物鑒定為科羅索酸。

圖4 組分1的11H-NMR圖-NMRFig.4 1H-NMR spectrum of component 1

圖5 樣品11號(hào)的1133C--NNMMRR圖Fig.5 13C-NMR spectrum of component 1

3 結(jié) 論

本研究采用HSCCC，通過(guò)正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6∶5∶5∶4，V/V）溶劑體系從北五味子粗提物中分離得到了科羅索酸。一次進(jìn)樣150 mg粗提物后可以分離出6.3 mg科羅索酸，純度達(dá)97.6%。采用HSCCC對(duì)北五味子中科羅索酸的分離目前還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究對(duì)于拓展北五味子中科羅索酸的在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用前景具有重要意義。

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Preparative Isolation and Purification of Corosolic Acid from Schisandra chinensis (Turcz.) Baill by High Speed Counter Current Chromatography

ZHU Li-jie, MENG Xian-jun*, LI Bin, LIU Xiu-ying, TAO Dong-bing
(College of Food, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

An effective and rapid method for the separation of corosolic acid from Schisandra chinensis (S. chinensis) (Turcz.) Baill by high-speed counter-current chromatography (HSCCC) was established. The alcohol extract of S. chinensis (Turcz.) Baill was initially separated using AB-8 macroporous resins and further purified by HSCCC. A high performance liquid chromatography (HPLC) method was used to determine the partitioning coefficient of crude extract in different solvent systems. The results showed a solvent system consisting of n-hexane, ethyl acetate, methanol and water (6:5:5:4, V/V) was the best one for the HSCCC separation. A total of 6.3 mg of corosolic acid with a purity as high as 97.6% was obtained in one step separation from 150 mg of crude extract. The method is of high separation efficiency, and has a great importance for applications of corosolic acid in the food and medical fields.

high-speed counter-current chromatography; corosolic acid; Schisandra chinensis (Turcz.) Baill

TS201.3

A

1002-6630（2014）02-0001-04

10.7506/spkx1002-6630-201402001

2013-05-22

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201325）；遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2011109）

朱力杰（1986—），男，博士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄允称贰-mail：charleswestwood@163.com

*通信作者：孟憲軍（1960—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楣呒庸づc功能性食品。E-mail：mengxjsy@126.com