農(nóng)桿菌介導(dǎo)稻瘟病菌綠色熒光蛋白(GFP)遺傳轉(zhuǎn)化研究

張俊華,劉燁，韓雨桐，潘春清，王中業(yè)，張淋淋，崔凱旋

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

農(nóng)桿菌介導(dǎo)稻瘟病菌綠色熒光蛋白(GFP)遺傳轉(zhuǎn)化研究

張俊華,劉燁，韓雨桐，潘春清，王中業(yè)，張淋淋，崔凱旋

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

稻瘟病是水稻生產(chǎn)中的主要病害，抗病品種選育和利用是控制稻瘟病最有效措施。研究稻瘟病菌與水稻品種互作機制是培育抗病品種的基礎(chǔ)。GFP（Green fluorescent protein）基因因其具有片段小、易與多種不同蛋白質(zhì)N端或C端融合等特點，廣泛應(yīng)用于病菌與寄主植物互作研究中。研究以pBGgHg作為轉(zhuǎn)化載體，根癌農(nóng)桿菌C58C1作為轉(zhuǎn)化介體，轉(zhuǎn)化稻瘟病菌的強致病菌株py1022。研究發(fā)現(xiàn)，250 μg·mL-1潮霉素B能完全抑制稻瘟病菌生長，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化的最佳條件為：稻瘟病菌分生孢子濃度為1×105個·mL-1，共培養(yǎng)時間為4 d，共培養(yǎng)AS濃度為200 μmol·mL-1，共培養(yǎng)溫度為28℃。隨機挑取8個轉(zhuǎn)化子分別進行PCR擴增后測序、熒光顯微鏡下觀察、致病力及穩(wěn)定性測定，結(jié)果表明GFP成功轉(zhuǎn)化到稻瘟病菌中，可為稻瘟病菌與水稻品種的互作機制研究提供技術(shù)支撐。

稻瘟病菌；農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化；綠色熒光蛋白（GFP）

稻瘟病是當(dāng)前水稻生產(chǎn)中主要病害，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量，稻瘟病在整個水稻生育期均有發(fā)生，流行年份一般發(fā)病田塊損失10%～40%，如不及時防治，局部田塊會顆粒無收[1]。稻瘟病菌生理分化明顯，變異速度快，抗病品種推廣后3～5年就喪失抗病性，特別是目前單一抗病品種大面積種植，造成稻瘟病菌定向選擇，導(dǎo)致產(chǎn)生新的致病力強的稻瘟病菌生理小種，造成稻瘟病大面積流行，給水稻生產(chǎn)帶來經(jīng)濟損失。因而明確稻瘟病抗病機制及稻瘟病菌致病機制迫在眉睫，建立一套簡單、快速、高效的稻瘟病菌轉(zhuǎn)化體系是研究稻瘟病菌分子致病機制及致病相關(guān)基因克隆的基礎(chǔ)。微生物遺傳轉(zhuǎn)化方法有多種，通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體法、REMI（Restrictioenzyme mediated in?tegration）和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)（Agrobacterium tumefa?ciens-mediated transformation，AtMT）等方法已成功實現(xiàn)多種絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化，為植物病原真菌分子致病機制研究提供有效工具。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，直接以真菌孢子或菌絲為受體，免除PEG介導(dǎo)和REMI等轉(zhuǎn)化方法中原生質(zhì)體制備的復(fù)雜過程，減少轉(zhuǎn)化過程中其他因素的影響，增加轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性和效率。同時根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化由于具有外源基因整合機制比較清楚、拷貝數(shù)較低、遺傳穩(wěn)定等諸多優(yōu)點而得到廣泛應(yīng)用。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化最初主要用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究，并在擬南芥[2]、煙草[3]、水稻[4]等作物中都成功得到農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化株系。這種方法已應(yīng)用到真菌遺傳轉(zhuǎn)化中，目前已在Fusarium oxysporum[5]、Aspergillus awamori[6]、Colletotrichum lagenarium[7]、Magnaporthe grisea[8-12]等真菌中轉(zhuǎn)化成功。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的真菌轉(zhuǎn)化子很容易發(fā)生表型以及致病性突變，表型與T-DNA共分離幾率較高，為研究真菌的功能基因提供可能，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物病原真菌轉(zhuǎn)化方法現(xiàn)已成為植物病理學(xué)研究重要技術(shù)手段。

研究病原菌與植物互作的傳統(tǒng)方法有組織印跡法、放射性標(biāo)記核酸探針法和GUS染色法等，這些均為非活體檢測，因此有一定局限性。而綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）能有效克服上述傳統(tǒng)方法不足，可直觀、實時監(jiān)測病原菌發(fā)生、定殖和侵染過程，目前已成為研究病原菌與植物互作的有效方法。國內(nèi)外對于利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化報道較多[8-12]，但將GFP轉(zhuǎn)化到稻瘟病菌報道不多。本研究以一種農(nóng)桿菌C58C1及攜帶潮霉素抗性的質(zhì)粒pBGgHg為介導(dǎo)，以強致病力菌株py1022為出發(fā)菌株，產(chǎn)生稻瘟病菌的T-DNA插入轉(zhuǎn)化子，旨在建立一種簡單、快速、高效的稻瘟病菌轉(zhuǎn)化體系，并將GFP成功轉(zhuǎn)化到稻瘟病菌中，為稻瘟病菌功能基因組研究奠定基礎(chǔ)，為稻瘟病菌致病機制和水稻品種抗病機制研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和質(zhì)粒

Magnaporthe grisea菌株：py1022，2010年8月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實驗實習(xí)基地采集病株，并進行分離，經(jīng)過鑒定為強致病性菌株。

質(zhì)粒：pBGgHg由美國賓夕法尼亞州立大學(xué)植病系提供。

農(nóng)桿菌菌株：C58C1由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，瓊脂20 g，加水定容至1 000 mL；

燕麥片培養(yǎng)基：燕麥片50 g，瓊脂20 g，加水定容至1 000 mL；

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl10 g，加水定容至1 000 mL；

YEB培養(yǎng)基：細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨（Bacto?tryptone）10 g，細菌培養(yǎng)基酵母提取液（Bactoyeast-extract）10 g，NaCl 5 g，加水定容至1 000 mL，pH 7.0；

MM培養(yǎng)基：磷酸氫鉀緩沖液10 mL（K-buf?fer：200 g·L-1K2HPO4，145 g·L-1KH2PO4，pH 7.0），硫酸鎂-氯化鈉溶液20 mL（M-N buffer：30 g·L-1MgSO4·7H2O，15 g·L-1NaCl），20%葡萄糖（W/V）10 mL，1%CaCl2·2H2O（W/V）1 mL，0.01% FeSO4（W/V）10 mL，20%（NH4）2SO4（W/V）2.5 mL，pH 7.0，加水定容至1 000 mL[8]。

IM液體培養(yǎng)基：K-buffer（pH 4.9）0.8 mL，M-N buffer 20 mL，1%CaCl2·2H2O（W/V）1 mL，20%葡萄糖（W/V）10 mL，20%（NH4）2SO4（W/V）2.5 mL，50%甘油（W/V），10 mL，0.01%FeSO4（W/ V）10 mL，1 mg·mL-12-（N-嗎啉基）乙磺酸鈉（MES）10 mL，加水定容至1 000 mL。用于稀釋農(nóng)桿菌和稻瘟病菌分生孢子。

IM固體培養(yǎng)基：在1 000 mL IM液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加卡拉膠23 g，用于誘導(dǎo)農(nóng)桿菌侵染稻瘟病菌。

1.1.3 抗生素及生化試劑

各種抗生素（潮霉素B、卡那霉素、頭孢噻肟鈉、利福平、鏈霉素）均購自Sigma公司；限制性內(nèi)切酶、TagDNA聚合酶購自NEB公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純，購自哈爾濱萊博賽斯科技發(fā)展有限公司。

1.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)

質(zhì)粒pBGgHg采用凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌C58C1中，從LB平板（含50 μg·mL-1卡那霉素）挑選農(nóng)桿菌單斑接種于7 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 μg·mL-1卡那霉素）中，240 r·min-1，28℃過夜培養(yǎng)，第2天用MM液體培養(yǎng)基（含200 mmol·L-1乙酰丁香酮，AS）稀釋到OD660大約0.15，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)6 h，至OD660為0.6～0.8。

1.3 稻瘟病菌分生孢子培養(yǎng)

將經(jīng)純化鑒定的野生型稻瘟病菌強致病菌株py1022接種到燕麥片培養(yǎng)基中，采用藍黑色照射，26℃培養(yǎng)7～10 d，待其產(chǎn)生大量分生孢子時，用滅菌棉簽輕刷菌體表面，洗下孢子，用雙層滅菌紗布過濾分生孢子，用血球計數(shù)板計數(shù)孢子濃度，用滅菌ddH2O調(diào)整孢子濃度為1×107個·mL-1備用。

1.4 稻瘟病菌對潮霉素B敏感性測定

配置含有潮霉素不同濃度梯度（0、50、100、150、200、250、300 μg·mL-1）的PDA平板，將活化后的稻瘟病菌打成菌餅（直徑為5 mm）接種在平板中央，26℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落生長情況，并測量菌落直徑，每個處理設(shè)置4次重復(fù)。

1.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化

取100 μL培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌（含GFP）菌液和100 μL稀釋好的稻瘟病菌孢子懸浮液混合，將混合液（200 μL）均勻涂于IM平板上的硝酸纖維素膜表面，22℃共培養(yǎng)48 h，然后將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移到含潮霉素和抗生素的選擇平板上，將平板置于22℃下培養(yǎng)到轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

1.6 不同條件對轉(zhuǎn)化效率的影響

影響稻瘟病菌轉(zhuǎn)化效率主要因子包括：稻瘟病菌分生孢子濃度（103、104、105、106、107個·mL-1）、共培養(yǎng)時間（1、2、3、4、5、6 d）、AS濃度（0、50、100、150、200、250、300 μmol·mL-1）、共培養(yǎng)溫度（22、24、26、28、30℃），逐一進行單因子條件試驗。后續(xù)因子優(yōu)化是在前面因子已確定的最優(yōu)條件下進行，每個處理設(shè)3個重復(fù)。

1.7 轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性測定

為測定轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性，隨機挑選8個轉(zhuǎn)化子，接種到不含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基中，26℃下培養(yǎng)1周后，選取平皿邊緣的菌絲轉(zhuǎn)接新的PDA培養(yǎng)基中，按以上方法重復(fù)4次，將第5代轉(zhuǎn)化子接種到含潮霉素B（250 μg·mL-1）的PDA培養(yǎng)基中，挑取轉(zhuǎn)化子的菌絲和分生孢子制成玻片，在Nikon90i熒光顯微鏡下進行熒光觀察和照相，同時以野生原始菌株為對照。

1.8 轉(zhuǎn)化子的致病性測定

參照劉明娟等方法[9]，采用離體葉片接種進行致病性測定。在培養(yǎng)皿（直徑為9 cm）中鋪3層吸水紙，用水浸透后保濕。再將出苗后10 d的水稻（品種為麗江新團黑谷水稻品種）葉片剪成長約4 cm小段，放在吸水紙上，每個平皿放3片葉片，然后用蘸過水的手指輕輕擦一下水稻葉片表面，以將孢子液滴留在葉片表面。將待測的8個轉(zhuǎn)化菌株和野生菌株的分生孢子分別配成2×104個·mL-1的懸浮液，取10 μL分生孢子液滴在葉片上，每個處理3個平皿，26℃下光照培養(yǎng)5 d，對比該稻瘟病菌轉(zhuǎn)化前后致病性的變化。

1.9 轉(zhuǎn)化子驗證

1.9.1 轉(zhuǎn)化子PCR驗證

參考張俊華等方法提取DNA[13]。步驟如下：將真菌菌絲用液氮快速研磨，取25 mg菌絲粉末置于1.5 mL離心管，加入500 μL真菌DNA提取液（50 mmol·L-1Tris-HCl；150 mmol·L-1NaCl；100 mmol·L-1EDTA）震蕩混勻；加入50 μL 10%SDS，小心震蕩后37℃水浴1 h；然后加入75 μL 5 mol·L-1NaCl，輕柔混勻；再加入65 μL CTAB/NaCl混合液（濃度為0.7 mol·L-1NaCl溶液中加入10%CTAB），混勻后65℃水浴15 min；加入等量氯仿/異戊醇（24∶1），劇烈震蕩混勻后12 000 r·min-1離心10 min；將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈離心管，加入0.6倍體積的異丙醇，-20℃放置2 h；離心收集沉淀并用70%乙醇洗滌兩次，待沉淀干燥后用100 μL無菌ddH2O溶解；加RNA酶H至終濃度50 μg·mL-1，37℃保溫2 h消化RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)載體中含有潮霉素序列設(shè)計引物，PCR進行擴增，以驗證轉(zhuǎn)化子中是否含hygromycin基因。引物序列為：Forward：5′GTGCTTTCAGCTTCGATG 3′，Reverse：5′AACCAAGCTCTGATAGAG 3′。反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）2 μL，dNTP（10 mmol·L-1）0.5 μL，上游引物（20 mmol·L-1）0.5 μL，下游引物（20 mmol·L-1）0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.2 μL，加ddH2O 25 μL，混合后稍離心。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3 min，94℃，45 s；52℃，30 s；72℃，1 min，共30個循環(huán)，72℃，延伸7 min。取8 μL擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖電泳進行檢測。

1.9.2 轉(zhuǎn)化子熒光顯微鏡觀察鑒定

將轉(zhuǎn)化子分別用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲和燕麥培養(yǎng)基進行菌絲和分生孢子培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子分生孢子和菌絲樣品制片，Nikon 90i熒光顯微鏡下進行熒光觀察，照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化

2.1.1 稻瘟病菌對潮霉素B的敏感性

將稻瘟病菌菌絲接種到含不同濃度潮霉素B的PDA培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)7 d后測量菌落直徑，結(jié)果如下：50～200 μg·mL-1潮霉素B對稻瘟病菌生長有不同程度抑制作用。但在此范圍內(nèi)不能完全抑制菌絲生長；250 μg·mL-1潮霉素B能完全抑制稻瘟病菌生長。因此本研究選擇250 μg·mL-1潮霉素B進行陽性轉(zhuǎn)化子篩選，如圖1所示。

圖1 稻瘟病菌(py1022)對潮霉素B的敏感性測定Fig.1 Determination of sensitivity of Magnaporthe grisea(py1022)to hygromycin B

2.1.2 稻瘟病菌分生孢子濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響

不同濃度稻瘟病菌分生孢子影響稻瘟病菌的轉(zhuǎn)化效率（見圖2）。稻瘟病菌轉(zhuǎn)化成功要求孢子濃度達到一定數(shù)值，隨著孢子濃度的升高轉(zhuǎn)化效率升高，但當(dāng)孢子濃度升高到105個·mL-1時，轉(zhuǎn)化效率最大，隨后轉(zhuǎn)化效率下降。

圖2 孢子濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2 Effects of spores concentration on transformation efficiency

2.1.3 共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響

將共培養(yǎng)時間設(shè)置為1、2、3、4、5、6 d五個梯度，不同培養(yǎng)時間產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)不同（見圖3）。共培養(yǎng)1 d，無轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生；共培養(yǎng)2 d，可得到少量轉(zhuǎn)化子，隨著共培養(yǎng)時間延長，轉(zhuǎn)化效率明顯升高；共培養(yǎng)4 d后，平均轉(zhuǎn)化效率為289個轉(zhuǎn)化子/105個孢子，轉(zhuǎn)化率達到最高；繼續(xù)延長培養(yǎng)時間，轉(zhuǎn)化效率逐漸下降。

圖3 共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 Effects of co-culture time on transformation efficiency

2.1.4 共培養(yǎng)時AS濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響

AS濃度對稻瘟病菌轉(zhuǎn)化效率的影響見圖4。不添加AS時，僅得到極少量轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率隨AS濃度增加而有所提高，當(dāng)AS濃度為200 μmol·mL-1時，轉(zhuǎn)化效率最大，每105個孢子可得到285個轉(zhuǎn)化子。當(dāng)AS濃度上升為250和300 μmol·mL-1時，轉(zhuǎn)化效率分別為262個轉(zhuǎn)化子·10-5個孢子和181個轉(zhuǎn)化子·10-5個孢子。

圖4 AS濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.4 EffectsofASconcentrationontransformationefficiency

2.1.5 共培養(yǎng)溫度對轉(zhuǎn)化效率的影響

將共培養(yǎng)溫度設(shè)置為22、24、26、28和30℃共五個梯度，并按前文確定的最優(yōu)條件進行轉(zhuǎn)化。由圖5可知，28℃時轉(zhuǎn)化子數(shù)量為最多，隨后轉(zhuǎn)化子數(shù)量開始明顯下降。因此，轉(zhuǎn)化子最佳共培養(yǎng)溫度為28℃。

2.1.6 轉(zhuǎn)化子致病力測定

將8個轉(zhuǎn)化的稻瘟病菌及未轉(zhuǎn)化的野生稻瘟病菌同時接種感病水稻品種麗江新團黑谷（見圖6），發(fā)現(xiàn)GFP轉(zhuǎn)化后稻瘟病菌致病力與未轉(zhuǎn)化前野生稻瘟病菌致病力基本一致。說明轉(zhuǎn)入的GFP基因?qū)Φ疚敛【虏×缀鯚o影響。

圖5 共培養(yǎng)溫度對轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.5 Effects of co-culture temperature on transformation efficiency

圖6 轉(zhuǎn)化后稻瘟病菌的致病力測定Fig.6 Pathogenicity determination of Magnaporthe grisea transformed with GFP

2.1.7 轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性

隨機選取8個轉(zhuǎn)化子連續(xù)轉(zhuǎn)接5代，然后轉(zhuǎn)接到含有潮霉素B250 μg·mL-1的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后，發(fā)現(xiàn)菌落直徑為4～5 cm，表明這些轉(zhuǎn)化子對潮霉素B具有抗性，GFP基因已轉(zhuǎn)入稻瘟病菌的基因組中，并可以穩(wěn)定遺傳。

2.2 轉(zhuǎn)化子驗證

2.2.1 轉(zhuǎn)化子的PCR驗證

根據(jù)GFP載體中含有的潮霉素B基因序列設(shè)計引物，分別以載體DNA和未轉(zhuǎn)化的稻瘟病菌DNA作為陽性和陰性對照，對轉(zhuǎn)化子的DNA進行PCR擴增，然后進行測序，以確定轉(zhuǎn)化是否成功。從圖7中可以看出，8個需驗證的轉(zhuǎn)化子中，都可擴增出與載體一致的大小約為750 bp的片段，可見這些轉(zhuǎn)化子極有可能都是陽性克隆。將1～8轉(zhuǎn)化子擴增的條帶進行回收測序，在NCBI將轉(zhuǎn)化子序列與潮霉素B的基因序列進行比對，其同源性為99.6%，由此可證明已把含有GFP的載體成功轉(zhuǎn)入稻瘟菌中。

圖7 轉(zhuǎn)化子PCR驗證Fig.7 PCR verification for transformant

2.2.2 轉(zhuǎn)化子在光學(xué)顯微鏡下的驗證

挑取轉(zhuǎn)化子和野生菌株菌絲和分生孢子在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果野生菌株的菌絲和分生孢子沒有觀察到任何熒光，而轉(zhuǎn)化子的菌絲和分生孢子均能發(fā)出綠色熒光，證明已把含有GFP的載體成功轉(zhuǎn)入水稻稻瘟病菌中。

圖8 轉(zhuǎn)化子在光學(xué)顯微鏡下驗證Fig.8 Transformants verification with optical microscope

3 討論

稻瘟病一直以來是困擾水稻生產(chǎn)的主要病害，抗病品種選育和利用是解決稻瘟病危害的首要措施，但由于稻瘟病菌變異速度快，生理小種種類多，各地稻瘟病菌生理小種組成和優(yōu)勢小種差異大，而生產(chǎn)上推廣的抗病品種少，多數(shù)是針對一些稻瘟病菌生理小種具有特異抗性的品種，品種布局困難。雖然各地不斷監(jiān)測稻瘟病菌生理小種的變化，但一段時期獲得的稻瘟病菌生理小種分化的資料對后續(xù)的品種布局指導(dǎo)意義不大，主要是由于各地水稻品種不斷更新，稻瘟病菌生理小種組成和優(yōu)勢小種會發(fā)生相應(yīng)變化，影響利用品種控制稻瘟病措施的應(yīng)用效果。目前我國對稻瘟病的防治主要依靠化學(xué)藥劑，生物防治雖有報道，但防效不明顯且不穩(wěn)定，原因之一是對稻瘟病菌侵染過程和致病機制等研究不夠深入，導(dǎo)致生物制劑施用時機掌握不準(zhǔn)確，影響生物制劑的防病效果。因而深入研究水稻品種對稻瘟病菌抗病機制和稻瘟病菌致病機制對防治稻瘟病意義重大。

ATMT方法相對于其他轉(zhuǎn)化方法，雖然具有轉(zhuǎn)化效率高特點，但其轉(zhuǎn)化效率也同樣受諸多因素影響。ATMT轉(zhuǎn)化真菌，可轉(zhuǎn)化多種類型的原材料，包括原生質(zhì)體、孢子、菌絲體和子實體組織等。對于個別真菌只能轉(zhuǎn)化特定的類型。Michielse等在轉(zhuǎn)化接合菌Rhizopus oryzae時，發(fā)現(xiàn)在只有原生質(zhì)體的情況下，才能得到轉(zhuǎn)化子，孢子不能完成轉(zhuǎn)化[14]。Cardoza等在轉(zhuǎn)化Trichodermaspp.時，采用分生孢子和菌絲作為轉(zhuǎn)化對象均可成功轉(zhuǎn)化[15]。

本研究以分生孢子完成稻瘟病菌轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌菌株不同，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率存在一定差異，一些研究者采用農(nóng)桿菌菌株AGL21轉(zhuǎn)化效率較低，如Rho等每轉(zhuǎn)化1×106個稻瘟病菌孢子可得到500～1 000個轉(zhuǎn)化子[11]；李宏宇等每轉(zhuǎn)化1×106個稻瘟病菌孢子可得到約500個轉(zhuǎn)化子[12]；賀春萍等和劉朋娟等每轉(zhuǎn)化1×106個孢子獲得約300個轉(zhuǎn)化子[8-9]。而本研究中所用菌株C58C1遺傳轉(zhuǎn)化效率相對提高，平均轉(zhuǎn)化效率為289個轉(zhuǎn)化子/105個孢子，效率提高。稻瘟病菌菌株不同也是影響稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化效率的一個主要因素。賀春萍等采用的稻瘟病菌菌株是Y34[8]；Rho等采用的稻瘟病菌菌株是70-15[11]；李宏宇等采用的稻瘟病菌菌株為6ZB15、95054B、81274和測8605[12]；劉朋娟等采用的稻瘟病菌菌株是Guy11[9]；而本研究采用黑龍江省田間分離的野生型強致病菌株py1022。轉(zhuǎn)化受體濃度也影響轉(zhuǎn)化效率。本研究表明，較高濃度的稻瘟病菌可以提高轉(zhuǎn)化效率，但受體真菌孢子濃度過高時則導(dǎo)致真菌的過量生長而不能挑出轉(zhuǎn)化子，使轉(zhuǎn)化效率降低。同樣，農(nóng)桿菌濃度過高時，由于農(nóng)桿菌過度生長引起嚴(yán)重污染，也會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率下降。這與De Groot等利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化木霉時的研究結(jié)果一致[16]。本研究表明，乙酰丁香酮（AS）是誘導(dǎo)毒性基因表達的基本因素，也是轉(zhuǎn)化成功與否的關(guān)鍵因素。共培養(yǎng)中AS是否加入直接影響轉(zhuǎn)化結(jié)果。加入的濃度決定轉(zhuǎn)化效率高低，在共培養(yǎng)過程中缺少AS會導(dǎo)致無轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生，與Leclerque等研究成果一致[17]。共轉(zhuǎn)化溫度也是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素。本研究對轉(zhuǎn)化溫度在22～30℃范圍內(nèi)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率進行研究，結(jié)果表明農(nóng)桿菌介導(dǎo)稻瘟病菌轉(zhuǎn)化最適溫度為28℃，與吳毅歆等研究結(jié)果一致[10]。轉(zhuǎn)化時間是影響真菌轉(zhuǎn)化效率的另一個因素，與溫度不同，不同絲狀真菌的共培養(yǎng)的最佳時間差異很大，方麗等對炭疽菌轉(zhuǎn)化研究認(rèn)為24 h是共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化最佳時間[18]，本研究對稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化最佳時間為4 d。

4 結(jié)論

a.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是一種高效稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化效率高低與轉(zhuǎn)化受體類型、農(nóng)桿菌菌株類型、載體啟動子特異性、菌株類型、受體濃度、乙酰丁香酮濃度、共培養(yǎng)時間和共培養(yǎng)溫度等因素有關(guān)。

b.稻瘟病菌遺傳轉(zhuǎn)化最佳條件為：稻瘟病菌分生孢子濃度為1×105個·mL-1，共培養(yǎng)時間為4 d，共培養(yǎng)AS濃度為200 μmol·mL-1，共培養(yǎng)溫度為28℃。

c.本研究已將GFP成功轉(zhuǎn)化至稻瘟病菌中，可為稻瘟病菌與水稻品種互作機制研究提供技術(shù)支撐。

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GFP genetic transformation ofMagnaporthe griseamediated by Agrobacterium tumefaciens

ZHANG Junhua,LIU Ye,HAN Yutong,PAN Chunqing,WANG Zhongye,ZHANG Linlin,CUI Kaixuan
(School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Rice blast is one of the main devastating diseases in rice production,breeding and utilization of resistant varieties are the most economical and effective measures to control of rice blast disease.Studying the interaction mechanism betweenMagnaporthe griseaand rice varieties is the base of breeding resistant varieties.GFP(Green fluorescent protein)gene fragment is so small that it can fuse with different protein N terminal or C terminal easily,and it can be used in the interaction study between pathogen and host.In this study,we developed anAgrobacterium tumefaciens-mediated transformation system forMagnaporthe griseaby using a high pathogenic isolate py1022 and theAgrobacterium tumefaciensstrain C58C1 carrying plasmid pBGgHg.The results showed that 250 μg·mL-1hygromycin B could completely inhibit the growth ofMagnaporthe grisea.The optimal genetic transformation system were as followed：the conidia concentration ofMagnaporthe griseawas 1×105conidia·mL-1,the total culture time forAgrobacterium tumefaciens-mediated rice blast fungus transformation was 4 d,co-culture with AS concentration was 200μmol·mL-1,co-culture temperature was 28℃.We randomly chosed eight clones and verified the GFP transformation by PCR amplifying with the hph primers and sequencing,observed mycelia and conidia under fluorescence microscopy,determinated pathogenicity and genetic stability,the results showed that the GFP had been successfully transformed into the rice blast fungus,and it can provide powerful tool for the study of interaction mechanism betweenMagnaporthe griseaand rice varieties.

Magnaporthe grisea;Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation;green fluorescent protein(GFP)

S432.1

A

1005-9369（2014）11-0001-07

2014-07-06

哈爾濱市科技攻關(guān)項目（2014AB6BN036）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（11551041）；博士后研究人員科研啟動資助項目（LBH-Q09172）；農(nóng)業(yè)部寒地作物生理生態(tài)與黑龍江省高校寒地作物品種改良與生理生態(tài)重點開放實驗室項目

張俊華（1973-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為寄主與病原物分子互作。E-mail:podozjh@163.com

時間2014-11-21 16:41:33[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20141121.1641.012.html

張俊華,劉燁,韓雨桐,等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)稻瘟病菌綠色熒光蛋白（GFP）遺傳轉(zhuǎn)化研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(11):1-7.

Zhang Junhua,Liu Ye,Han Yutong,et al.GFP genetic transformation ofMagnaporthe grisea mediatedbyAgrobacterium tumefaciens[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(11):1-7.(in Chinese with English abstract)