旋毛蟲重組HSP70對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞TLR2/4表達(dá)的影響

李成，禹洋，徐佳，劉暢，周興東，李曉云

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

旋毛蟲重組HSP70對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞TLR2/4表達(dá)的影響

李成1，禹洋2，徐佳2，劉暢2，周興東2，李曉云2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

觀察旋毛蟲重組熱休克蛋白HSP70（rTs-HSP70）對(duì)體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞Toll樣受體TLR2/4表達(dá)的影響。體外常規(guī)培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7，分別加入不同濃度rTs-HSP70刺激培養(yǎng)24 h，半定量PCR方法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞TLR2/4 mRNA表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志分子CD80和CD86表達(dá)。平行設(shè)立不加刺激物陰性對(duì)照組，細(xì)菌脂多糖LPS陽(yáng)性對(duì)照組；同時(shí)試驗(yàn)比較5 μg·mL-1濃度的HSP70組和HSP70+LPS組（HSP70預(yù)刺激后再加入LPS刺激培養(yǎng)12 h）RAW264.7細(xì)胞TLR2/4 mRNA表達(dá)差異。結(jié)果表明，低濃度rTs-HSP70與巨噬細(xì)胞活化呈正相關(guān)，濃度為5 μg·mL-1時(shí)，TLR2/4表達(dá)水平達(dá)到峰值（P＜0.05），并可刺激巨噬細(xì)胞共刺激分子CD80和CD86高表達(dá)，隨著HSP70濃度升高（＞5 μg·mL-1）則對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7表現(xiàn)為抑制作用；當(dāng)對(duì)RAW264.7進(jìn)行旋毛蟲HSP70預(yù)刺激，可引起免疫抑制效應(yīng)，抑制LPS對(duì)巨噬細(xì)胞TLR2/4的活化反應(yīng)。試驗(yàn)可為旋毛蟲相關(guān)分子免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究及旋毛蟲病防治提供參考。

旋毛蟲重組HSP70；巨噬細(xì)胞RAW264.7；TLR2；TLR4

旋毛蟲?。═richinellosis）是一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，被衛(wèi)生部列為“十一五”期間重點(diǎn)攻克主要食源性寄生蟲病之一，宿主因生食或半生食含有旋毛蟲肌幼蟲（Muscle larva）肉類而感染[1]。該病臨床癥狀復(fù)雜多樣，診斷較困難，研制疫苗是免疫防治該病的有效措施。熱休克蛋白（HSPs）是細(xì)胞在應(yīng)激條件下產(chǎn)生的一類具有高度保守性蛋白質(zhì)，廣泛存在于各種原核和真核細(xì)胞中，其中HSP70（相對(duì)分子質(zhì)量70 ku）是所有生物中最保守的熱休克蛋白，也是大多數(shù)抗原感染中的免疫顯性抗原[2]。在前期研究中，根據(jù)GenBank中已發(fā)表旋毛蟲HSP70基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，應(yīng)用Trizol法從旋毛蟲肌幼蟲提取總RNA，利用RT-PCR方法擴(kuò)增旋毛蟲HSP70基因，對(duì)全長(zhǎng)CDS區(qū)進(jìn)行克隆及原核表達(dá)，經(jīng)免疫印跡分析與免疫組織化學(xué)染色并免疫Balb/c小鼠，證明表達(dá)純化的HSP70具有良好的免疫原性[3]。

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）作為免疫細(xì)胞表面主要受體，能夠識(shí)別不同類型病原體相關(guān)分子模式（PAMPs，也稱為Toll樣受體的配體或激動(dòng)劑），并快速激活相關(guān)信號(hào)通路，引起免疫應(yīng)答及炎性因子釋放，對(duì)宿主的天然免疫防御具有重要作用[4]。目前在人類和小鼠體內(nèi)分別發(fā)現(xiàn)11和13種TLRs，其中TLR2/4作為單核-巨噬細(xì)胞表面兩種重要的TLRs，能分別結(jié)合G+和G-菌相應(yīng)成分，TLRs亦能識(shí)別細(xì)胞死亡后釋放的HSP60，其與巨噬細(xì)胞表面TLR4結(jié)合，從而介導(dǎo)相應(yīng)促炎性介質(zhì)TNF-α和NO的分泌[5]。此外，TLRs在寄生蟲感染宿主后天然免疫中起關(guān)鍵作用，如曼氏血吸蟲蟲卵可通過(guò)激活小鼠髓樣樹突狀細(xì)胞上的TLR2促使轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-12 p40和IFN-β）轉(zhuǎn)錄表達(dá)[6]；曼氏血吸蟲的可溶性制備物可通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞表面受體TLR4，產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子[7]；TLR2在旋毛蟲重組HSP70刺激未分化DCs分化過(guò)程中起到重要作用[8]。旋毛蟲重組HSP70（rTs-HSP70）是否通過(guò)TLRs途徑介導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞活化尚不清楚，為此本文針對(duì)目前研究較多的TLR2/4，應(yīng)用半定量PCR方法和流式細(xì)胞術(shù)，觀察rTs-HSP70對(duì)體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 TLR2/4受體及共刺激分子CD80和CD86表達(dá)的影響，為旋毛蟲病診斷防治及其致病機(jī)理、免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與重組蛋白

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院；旋毛蟲重組HSP70，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室克隆表達(dá)。

1.2 主要試劑與儀器

優(yōu)級(jí)胎牛血清、100 000 IU·mL-1青霉素/鏈霉素（購(gòu)自天津?yàn)笊锕荆籇MEM培養(yǎng)基（購(gòu)自美國(guó)HyClone公司）；LPS、胰酶1∶250（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）；DNA Marker、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Random primer、限制性內(nèi)切酶、RNA酶抑制劑，均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；Anti-Mouse CD80 FITC、Anti-Mouse CD86 PE（購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司）；倒置顯微鏡：Nikon公司產(chǎn)品；CO2恒溫培養(yǎng)箱：Q/TEUC8-2002型，HelForce發(fā)展科技有限公司；PCR儀（美國(guó)Thermo公司）；流式細(xì)胞儀：BD FACScalibur型（美國(guó)Becton Dickinson公司）。

1.3 不同濃度rTs-HSP70對(duì)RAW264.7細(xì)胞活化作用

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞接種于100 mL·L-1胎牛血清、100 U·mL-1青霉素/鏈霉素DMEM培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)，置37℃、50 mL·L-1CO2培養(yǎng)箱中，倒置顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞形態(tài)，采用胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行細(xì)胞傳代，每2 d傳代1次。

將RAW264.7細(xì)胞以每孔5×105接種于12孔板培養(yǎng)2 h后，細(xì)胞分為陰性對(duì)照組（加入等量培養(yǎng)液）、rTs-HSP70刺激組（濃度分別為2、5、10、15 μg·mL-1）、陽(yáng)性對(duì)照組（加入LPS 100 ng·mL-1作用12 h），24 h后終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，以PBS洗滌收集細(xì)胞，進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

1.3.2 RAW264.7細(xì)胞TLR2/4 mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

應(yīng)用半定量PCR法檢測(cè)TLR表達(dá)量。首先Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以其為模板分別擴(kuò)增TLR2、TLR4和內(nèi)參β-actin特異序列片段。PCR產(chǎn)物以10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳鑒定，Quantity one軟件分析PCR產(chǎn)物電泳條帶密度，目的產(chǎn)物相對(duì)量=目的產(chǎn)物電泳條帶密度/ β-actin產(chǎn)物電泳條帶密度×100%。

1.3.3 AW264.7細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD80和CD86檢測(cè)

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面共刺激分子CD80和CD86表達(dá)水平。用PBS漂洗細(xì)胞后輕彈懸起細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)mL-1，每份樣品分裝2管，對(duì)照管和待檢管，向待檢管加入2 μL Anti-Mouse CD80 FITC和1.5 μL Anti-Mouse CD86 PE，充分混勻，4℃避光孵育1 h，PBS離心洗滌2次，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 rTs-HSP70對(duì)RAW264.7細(xì)胞TLR2/4 mRNA抑制作用

RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)同1.3。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和試驗(yàn)組，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。試驗(yàn)組分為兩組，rTs-HSP70組和rTs-HSP70+ LPS組?？瞻讓?duì)照組（加等量培養(yǎng)基）、陽(yáng)性對(duì)照組（加入LPS，100 ng·mL-1，作用12 h）、rTs-HSP70組（加入rTs-HSP70，終濃度5 μg·mL-1）和rTs-HSP70+LPS組（先加入rTs-HSP70（5 μg·mL-1），作用24 h后，再加LPS（100 ng·mL-1）作用12 h）。培養(yǎng)24 h后結(jié)束反應(yīng)，收集細(xì)胞，提取總RNA進(jìn)行半定量PCR檢測(cè)，方法同1.4，測(cè)定TLR2/4 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 rTs-HSP70誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TLR2/4 mRNA表達(dá)檢測(cè)

應(yīng)用特異性引物對(duì)不同濃度的rTs-HSP70刺激培養(yǎng)后小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 TLR2、TLR4和β-actin基因進(jìn)行PCR克隆與鑒定，均擴(kuò)增出相應(yīng)目的片段，大小與預(yù)期一致。結(jié)果如圖1。

圖1 不同濃度rTs-HSP70誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TLR2/4 mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.1 TLR2/4 mRNA relative expression of RAW264.7 cell stimulated by different rTs-HSP70 concentration

由圖1可知，不同濃度rTs-HSP70誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h后，TLR2和TLR 4 mRNA相對(duì)表達(dá)量變化相似，與rTs-HSP70呈現(xiàn)出一定量效關(guān)系。空白對(duì)照組有少量TLR2/4 mRNA表達(dá)；以2 μg·mL-1HSP70刺激時(shí)TLR2/4 mRNA與空白對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；隨著rTs-HSP70濃度的增加，TLR2/4表達(dá)水平與空白對(duì)照組相比顯著上升；當(dāng)rTs-HSP70濃度為5 μg·mL-1時(shí)，TLR2/4表達(dá)水平達(dá)到峰值，與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)rTs-HSP70濃度增加到10～15 μg·mL-1時(shí)，TLR2/4 mRNA表達(dá)出現(xiàn)下降趨勢(shì)；5和15 μg·mL-1濃度時(shí)組間比較，TLR2 mRNA表達(dá)存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 RAW264.7細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD80和CD86檢測(cè)

CD80和CD86分子以單體形式表達(dá)于抗原呈遞細(xì)胞表面，是免疫細(xì)胞活化重要的第二信號(hào)。在正常生理情況下，巨噬細(xì)胞表面幾乎沒(méi)有CD80和CD86分子表達(dá)，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到革蘭氏陰性菌胞壁中脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）等抗原刺激時(shí)，抗原呈遞細(xì)胞表面共刺激分子CD80和CD86表達(dá)明顯增加，從而發(fā)揮其共刺激作用。

圖2 FACS檢測(cè)不同濃度rTs-HSP70刺激RAW264.7細(xì)胞CD80/CD86分子的表達(dá)Fig.2 CD80/CD86 expression in RAW264.7 cell stimulated by different rTs-HSP70 dosages using FACS

應(yīng)用免疫熒光抗體雙標(biāo)記方法，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度rTs-HSP70共孵育后的RAW264.7細(xì)胞表面CD80和CD86分子表達(dá)情況，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2、3。各待檢組細(xì)胞總數(shù)約為5×105個(gè)，其中75%以上是活細(xì)胞，低劑量rTs-HSP70（濃度＜5 μg·mL-1）刺激組較空白對(duì)照組RAW264.7細(xì)胞CD80和CD86分子表達(dá)陽(yáng)性率增加，且CD80和CD86分子表達(dá)情況與rTs-HSP70作用濃度呈正相關(guān)；當(dāng)rTs-HSP70作用濃度為5 μg·mL-1時(shí)，RAW264.7細(xì)胞CD80+、CD86+細(xì)胞分別是14.0%和5.4%；在rTs-HSP70濃度＞5 μg·mL-1時(shí)，隨刺激物rTs-HSP70濃度的增加，RAW264.7細(xì)胞中CD80+細(xì)胞比例降低，CD86+細(xì)胞在總RAW264.7細(xì)胞中比例趨于平緩。由此表明，低濃度rTs-HSP70對(duì)巨噬細(xì)胞CD80和CD86分子表達(dá)有促進(jìn)作用，隨著rTs-HSP70作用濃度的增加，刺激物對(duì)巨噬細(xì)胞共刺激分子CD80和CD86表達(dá)表現(xiàn)為抑制作用。

圖3 不同濃度rTs-HSP70刺激RAW264.7細(xì)胞CD80/CD86分子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 CD80/CD86 changes in RAW264.7 cell stimulated by different rTs-HSP70 dosages

2.3 HSP70對(duì)RAW264.7細(xì)胞TLR2/4 mRNA表達(dá)抑制作用

圖4 rTs-HSP70對(duì)RAW264.7細(xì)胞TLR2/4 mRNA表達(dá)影響Fig.2 CD80/CD86 expression in RAW264.7 cell stimulated by different rTs-HSP70 dosages using FACS

將HSP70預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞再進(jìn)行LPS刺激，與單獨(dú)LPS刺激的巨噬細(xì)胞組相比，觀察HSP70對(duì)LPS刺激的巨噬細(xì)胞TLR2/4表達(dá)作用。將rTs-HSP70單獨(dú)刺激組、rTs-HSP70預(yù)刺激后LPS再誘導(dǎo)組以及空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中TLR2/4基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均擴(kuò)增出目的基因，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基因片段大小一致。試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖4）顯示：空白對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組中均有TLR2/4的表達(dá)，5 μg· mL-1的rTs-HSP70作用巨噬細(xì)胞24 h后，TLR2/4 mRNA表達(dá)均有升高；5 μg·mL-1的rTs-HSP70預(yù)處理24 h的RAW264.7細(xì)胞，LPS再次誘導(dǎo)TLR2/4 mRNA表達(dá)與LPS單獨(dú)刺激比較明顯受到抑制，卻存在顯著性差異（P＜0.05）；rTs-HSP70預(yù)處理組與rTs-HSP70單獨(dú)刺激組間TLR2/4 mRNA表達(dá)的差異不顯著無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HSP70通過(guò)降低巨噬細(xì)胞表面受體TLR2/4表達(dá)抑制LPS介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。

3 討論與結(jié)論

旋毛蟲ES抗原在旋毛蟲病免疫診斷、免疫病理及免疫防御方面早已有研究[9]，但是關(guān)于旋毛蟲HSP70對(duì)免疫細(xì)胞作用研究鮮有報(bào)道。HSP70家族具有高度保守性，分布廣泛，在真核和原核細(xì)胞中均有表達(dá)[10]。除存在于細(xì)胞或組織內(nèi)，旋毛蟲排泄分泌抗原（ES抗原）中也可檢測(cè)到HSP70[3,11]。正常情況下少量表達(dá)，而在應(yīng)激情況下表達(dá)量增加。寄生蟲HSP70屬于高度保守分子，在機(jī)體免疫應(yīng)答及免疫調(diào)節(jié)中起重要作用[12-13]。王少華等研究證明旋毛蟲重組HSP70可誘導(dǎo)未成熟的DC成熟而最終達(dá)到活化，從而加強(qiáng)宿主抵抗旋毛蟲感染能力[8]。 Aosai等研究發(fā)現(xiàn)剛地弓形蟲HSP70對(duì)TLR2和MyD88基因敲除的小鼠體外分離培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞，通過(guò)激活DC表面TLR4使DC成熟活化[14]。

本試驗(yàn)應(yīng)用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7作為模型，以旋毛蟲重組HSP70為刺激物對(duì)體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞RAW264.7活化作用進(jìn)行初步研究。TLRs在細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，當(dāng)蠕蟲入侵機(jī)體時(shí)可通過(guò)TLR感應(yīng)，調(diào)節(jié)TLR的表達(dá)與功能，從而達(dá)到適度的免疫狀態(tài)。TLR2和TLR4是巨噬細(xì)胞表面存在的能夠與寄生蟲HSP70結(jié)合的主要表面受體[15]，本試驗(yàn)結(jié)果表明HSP70刺激RAW264.7細(xì)胞后，在一定作用劑量范圍內(nèi)可使細(xì)胞表面受體TLR2/4 mRNA表達(dá)升高，存在一定劑量依賴性，即低濃度rTs-HSP70與巨噬細(xì)胞活化呈正相關(guān)，在rTs-HSP70為5 μg·mL-1時(shí)，TLR2/4 mRNA表達(dá)水平最高。因此初步試驗(yàn)得出低濃度（＜5 μg·mL-1）rTs-HSP70可以誘導(dǎo)靜息狀態(tài)巨噬細(xì)胞活化，從而加強(qiáng)宿主抵御旋毛蟲感染能力，rTs-HSP70濃度為5 μg·mL-1時(shí)，能刺激靜息狀態(tài)下巨噬細(xì)胞共刺激分子CD80和CD86高表達(dá)，HSP70濃度升高（＞5 μg·mL-1）則對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7表現(xiàn)為抑制作用。

LPS是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的主要刺激信號(hào)，LPS能與靶細(xì)胞上TLR結(jié)合，促使細(xì)胞釋放各種炎性因子如TNF-α、IL-2和IL-12等，因此LPS常用于復(fù)制細(xì)胞炎癥模型。本試驗(yàn)應(yīng)用半定量PCR檢測(cè)，將HSP70預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞再進(jìn)行LPS刺激，與單獨(dú)LPS刺激的巨噬細(xì)胞組相比，觀察HSP70對(duì)LPS刺激的巨噬細(xì)胞TLR2/4表達(dá)作用。rTs-HSP70預(yù)刺激RAW264.7細(xì)胞后，可抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TLR2/4 mRNA表達(dá)水平，HSP70通過(guò)降低巨噬細(xì)胞表面受體TLR2/4的表達(dá)來(lái)抑制LPS介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通過(guò)的傳導(dǎo)。表明rTs-HSP70可影響LPS與TLRs的相互作用，LPS活化巨噬細(xì)胞的主要通路是TLR4/MyD88/NF-κB，推測(cè)HSP70可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)TLR結(jié)合位點(diǎn)抑制LPS對(duì)巨噬細(xì)胞激活效應(yīng)。

Nomura等研究顯示TLR2/4激動(dòng)劑耐受可能與細(xì)胞表面受體表達(dá)下調(diào)或者與其介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)分子表達(dá)變化有關(guān)[16-17]。已有研究表明腸道線蟲感染可改變宿主T細(xì)胞活化狀態(tài)，Bian等研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲感染抑制宿主誘生一氧化氮合酶表達(dá)[18]。旋毛蟲HSP70抑制LPS對(duì)巨噬細(xì)胞活化反應(yīng)，是否與旋毛蟲ES抗原誘導(dǎo)的免疫抑制機(jī)理相同，有待于進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)利用半定量PCR方法和流式細(xì)胞術(shù)，觀察rTs-HSP70對(duì)體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 TLR2/4受體及共刺激分子CD80和CD86表達(dá)的影響，結(jié)果表明旋毛蟲重組HSP70對(duì)體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞具有調(diào)節(jié)功能，至少可通過(guò)TLR2和TLR4信號(hào)通路發(fā)揮作用；旋毛蟲重組HSP70可以刺激巨噬細(xì)胞共刺激分子CD80和CD86分子的高表達(dá)及TLR2/4 mRNA表達(dá)升高，從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化；半定量PCR方法驗(yàn)證了rTs-HSP70預(yù)刺激能引起免疫抑制效應(yīng)，抑制LPS對(duì)巨噬細(xì)胞TLR2/4活化反應(yīng)。

[1]張子群,謝曉峰,袁金錢,等.旋毛蟲實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用研究[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊,2009,19(3):9-13.

[2]Song K J,Song K H,Na B K,et al.Molecular cloning and characterization of a cytosolic heat shock protein 70 from Naegleria fowleri [J].Parasitol Res,2007,100(5):1083-1089.

[3]徐佳,禹洋,唐穎,等.旋毛蟲HSP70基因的原核表達(dá)及其免疫原性[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2012,42(3):275-279.

[4]禹洋,徐佳,呂興鋒,等.旋毛蟲ES抗原對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞TLR2/ 4 mRNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2012,42(6):562-565.

[5]Ohashi K,Burkart V,Flohe S,et al.Cutting edge:heat shock protein 60 is a putative endogenous ligand of the toll-like receptor 4 complex[J].J Immunol,2000,164:558-561.

[6]Trottein F,Pavelka N,Vizzardelli C,et al.A type I IFN-dependent pathway induced by Schistosoma mansoni eggs in mouse myeloid dendritic cells generates an inflammatory signature[J].J Immunol,2004,172(5):3011-3017.

[7]Jenkins S J,Hewitson J P,Ferret Bernard S,et al.Schistosome larvae stimulate macrophage cytokine production through TLR4-dependent and-independent pathways[J].Int Immunol,2005,17 (11):1409-1418.

[8]王少華,顧園,楊靜,等.旋毛蟲重組熱休克蛋白對(duì)小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞的活化研究[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2010,5(9): 676-679.

[9]Sugane K,Matsuura T.Molecular analysis of the gene encoding an antigenic polypeptide of Trichinella spiralis infective larvae[J].J Helminthol,1990,64(1):1-8.

[10]Gaston J S H.Heat shock proteins and innate immunity[J].Clin Exp Immunol,2002,127(1):1-3.

[11]Ko R C,Fan L.Heat shock response of Trichinella spiralis and T. pseudospiralis[J].Parasitology,1996,112(1):89-95.

[12]Newport G R.Heat shock proteins as vaccine candidates[J].Semin Immunol,1991,3(1):17-24.

[13]Kang H K,Lee H Y,Lee Y N,et al.Toxoplasma gondii-derived heat shock protein 70 stimulates the maturation of human monocyte-derived dentric cells[J].Biochem Biophys Res Commun, 2004,322(3):899-904.

[14]Aosai F,Rodriguez Pena M S,Mun H S,et al.Toxoplasma gondii-derived heat shock protein 70 stimulates maturation of murine bone marrow-derived dendritic cells via Toll-like receptor 4[J].Cell Stress Chaperones,2006,11(1):13-22.

[15]Mun H S,Aosai F,Norose K,et al.Toll-like receptor 4 mediates tolerance in macrophages stimulated with Toxoplasma gondiiderived heat shock protein HSP70[J].Infect Immunity,2005,73 (8):4634-4642.

[16]Nomura F,Akashi S,Sakao Y,et al.Cutting edge:endotoxin tolerance in mouse peritoneal macrophages correlates with downregulation of surface toll-like receptor 4 expression[J].J Immunol, 2000,164(7):3476-3479.

[17]Medvedev A V,Henneke P,Schromm A,et al.Induction of tolerance to lipopolysaccharide and mycobacterial components in Chinese hamster ovary/CD14 cells is not affected by overexpression of Toll-like receptors 2 or 4[J].J Immunol,2001,167(4): 2257-2267.

[18]Bian K,Zhong M,Harari Y,et al.Helminth regulation of host IL-4Rα/Stat6 signaling mechanism underlying NOS-2 inhibition by Trichinella spiralis[J].Applied Biological Sciences,2005,102 (11):3936-3914.

Effect of 70 ku recombinant HSP70 fromTrichinella spiralison expres-sion of TLR2/4 in murine macrophage

LI Cheng1,YU Yang2,XU Jia2,LIU Cahng2, ZHOUXingdong2,LIXiaoyun2(1.SchoolofLifeSciences,Northeast AgriculturalUniversity,Harbin 150030,China;2.School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China)

To observe the effect of 70 kDa recombinant heat shock protein from Trichinella spiralis (rTs-HSP70)on expression of TLR2/4(toll-like receptors)in murine macrophage in vitro.Murine macrophage RAW264.7 cell lines were incubated in twelve-well plates and different concentrations of rTs-HSP70 were added,co-culturing for 24 hours.Then the cells’TLR2/4 expression were tested by semi-quantitative PCR,those of surface markers CD80 and CD86 by flow cytometry.Cells receiving no stimulation were taken as negative control,bacterial lipopolysaccharide(LPS)as positive control.At the same time,comparative studies on incubation with rTs-HSP70 alone,rTs-HSP70 in combination with LPS,were conducted at concentration 5μg·mL-1of HSP70.The results indicated that lower concentrations of rTs-HSP70 had a positive correlation with macrophages activation,TLR2/4 expression peaked at concentration of 5μg·mL-1(P＜0.05),and up-regulation of co-stimulatory molecules.when rTs-HSP70concentration rose above a certain threshold(＞5μg·mL-1),a inhibitory effect on macrophage could be observed.Pre-stimulation of the macrophage with rTs-HSP70 could result in immunosuppression, generating a suppresive effect on LPS in TLR2/4 activation.The study lay the foundation for the mechanisms of helminth molecules immunomodulation and the therapeutic treatment of different trichinellosis.

Trichinella spiralis;macrophages RAW264.7;TLR2;TLR4

S532.14

A

1005-9369（2014）08-0072-07

2012-03-28

國(guó)家自然科學(xué)基金（31172312）；“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目（2010BAD04B01）

李成（1974-），男，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)樯锕こ碳夹g(shù)。E-mail：13304633640@189.cn

時(shí)間2014-7-26 13:44:02[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140726.1344.001.html

李成,禹洋,徐佳,等.旋毛蟲重組HSP70對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞TLR2/4表達(dá)的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(8):72-78.

Li Cheng,Yu Yang,Xu Jia,et al.Effect of 70 ku recombinant HSP70 fromTrichinella spiralison expression of TLR2/4 in murine macrophage[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(8):72-78.(in Chinese with English abstract)