動(dòng)物源性食品中志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測方法的建立

李丹丹，徐義剛，王綏家，高慎陽，李一經(jīng)

（1.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海口 570311；2.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，哈爾濱 150001；3.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

動(dòng)物源性食品中志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測方法的建立

李丹丹1，徐義剛2*，王綏家1，高慎陽3，李一經(jīng)4

（1.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海口 570311；2.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，哈爾濱 150001；3.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

根據(jù)志賀氏菌屬高度保守的ipaH基因序列，設(shè)計(jì)探針和引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立檢測動(dòng)物源性食品中志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，應(yīng)用于動(dòng)物源性食品中志賀氏菌的快速檢驗(yàn)。結(jié)果表明，該法靈敏度約為2.8 cfu·mL-1，經(jīng)對(duì)205份肉類、蛋、奶及其制品和動(dòng)物腹瀉物、人工污染樣品等進(jìn)行檢測，共檢出13份陽性樣本，與國標(biāo)（GB 4789.5-2012）方法的檢測結(jié)果一致。表明建立的熒光PCR方法操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高，具有良好實(shí)用性。

志賀氏菌；ipaH基因；熒光定量PCR；快速檢測

志賀氏菌（Shigella）是引起人類急性感染性痢疾最為常見的病原菌，俗稱痢疾桿菌，夏、秋季多發(fā)。人類主要通過食用被志賀氏菌污染的食品而感染發(fā)病，蒼蠅可作為機(jī)械性媒介，水源性傳播不常見，衛(wèi)生條件差的擁擠人群中最易發(fā)生流行，全身中毒癥狀和大腸化膿性炎癥為主要臨床特征，此菌對(duì)嬰幼兒具有致命性，是重要的食源性致病菌[1-4]。建立志賀氏菌快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的檢測方法，為及時(shí)有效控制食源性傳染病提供依據(jù)。

目前我國針對(duì)進(jìn)出口動(dòng)物性食品中志賀氏菌檢驗(yàn)檢疫主要采用常規(guī)增菌培養(yǎng)、生化鑒定及自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫檢測方法相結(jié)合。存在操作程序多、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、檢出效率低、檢測靈敏度不高、假陰性普遍等不足[5-8]。熒光PCR技術(shù)具有快速、簡便、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，與常規(guī)PCR方法相比，由于引物和探針的“雙保險(xiǎn)”，因此特異性更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線檢測，PCR擴(kuò)增過程無需對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行后處理，可有效解決PCR產(chǎn)物污染導(dǎo)致的假陽性及不能準(zhǔn)確定量問題，成為檢測領(lǐng)域重要的檢測手段[9-11]。食源性致病菌快速檢測技術(shù)建立將提高食源性致病菌檢測效率和檢測通量，為不同條件的檢測機(jī)構(gòu)提供技術(shù)支持，滿足食品中致病菌快速檢測要求，更好地保障食品安全，有利于國內(nèi)外貿(mào)易發(fā)展，在食品衛(wèi)生與食品安全檢測方面具有重要意義。本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確檢測動(dòng)物源性食品中志賀氏菌方法，提高食源性志賀氏菌的檢測效率，為動(dòng)物源性食品致病微生物監(jiān)測提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 菌株

試驗(yàn)用菌株多購自美國典型菌種保藏中心（ATCC）和中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC），部分菌株由海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室和黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室分離保存（見表1）。細(xì)菌培養(yǎng)基購于北京陸橋技術(shù)有限公司。

表1 試驗(yàn)用菌株Table 1 Bacteria stains

1.2 主要試劑

DNA聚合酶、dNTP購自TaKaRa（大連）公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN生物技術(shù)公司；肉類、蛋奶及其制品購自海南興成農(nóng)貿(mào)市場；動(dòng)物腹瀉物采自海南陽光畜禽飼養(yǎng)場。

1.3 主要儀器

ABI7500Real-timePCR儀，購自美國ABI公司。

1.4 方法

1.4.1 待檢菌株的培養(yǎng)

樣品的制備及增菌培養(yǎng)參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.5-2012進(jìn)行。

1.4.2 細(xì)菌基因組DNA的提取

按DNA提取試劑盒的操作說明進(jìn)行。

1.4.3 引物與探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)志賀氏菌ipaH基因序列（登錄號(hào)：M76445），用引物設(shè)計(jì)軟件Prmier 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和Taqman探針。

引物序列如下：F:CGCAATACCTCCGGATTCC R:TCCGCAGAGGCACTGAGTT

Taqman探針為：Fam-AACAGGTCGCTGCATG GCTGGAA-MGB

引物和探針由Invitrogen公司合成。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

25μL反應(yīng)體系：rTaq酶（5 U·μL-1）用量范圍0.25～2 μL，以0.25 μL遞增；Mg2+（25 mmol·μL-1）用量范圍0～4 μL，以每0.4 μL遞增；dNTP（2.5 mmol·μL-1）用量范圍0.5～2.5 μL，以0.25 μL遞增。引物（20 pmol·μL-1）的用量范圍0.1～0.8 μL，以0.1 μL遞增；探針（10 μmol·μL-1）用量范圍0.1～0.5 μL，以每0.05 μL遞增。反應(yīng)程序：95℃5 min；95℃5 s，60℃40 s（此步驟收集熒光信號(hào)），進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每次試驗(yàn)均包括陰性對(duì)照。

1.4.5 方法的靈敏度試驗(yàn)

將過夜培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)用菌株采用平板菌落記數(shù)法測定菌體濃度，然后將培養(yǎng)菌液按10倍梯度稀釋法進(jìn)行系列稀釋，每個(gè)濃度梯度設(shè)3個(gè)平行，提取細(xì)菌基因組DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，以確定檢測方法的靈敏度。

1.4.6 方法的特異性試驗(yàn)

采用試劑盒法提取表1中菌株的基因組DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)，以驗(yàn)證本方法的特異性。

1.4.7 方法的實(shí)用性試驗(yàn)

采集涉及肉類、豆制品、水產(chǎn)品、奶類、人工污染樣品、動(dòng)物腹瀉物等樣本，利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行檢測，國標(biāo)法作為參考，以評(píng)價(jià)建立方法的實(shí)用性。

圖1 志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的建立Fig.1 Development of a dual real-time PCR reaction system

表2 采集樣品數(shù)量及類型Table 2 Number and type of samples collected

2 結(jié)果與分析

2.1 志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的建立

以志賀氏菌屬高度保守的ipaH基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)引物和探針，經(jīng)反應(yīng)體系優(yōu)化，建立志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法。反應(yīng)體系為：rTaq酶（5 U·μL-1）0.25 μL，dNTP（25 mmol·μL-1）1.5 μL，探針（10 μmol·μL-1）0.15 μL，下游引物濃度（20 pmol·μL-1）0.5 μL，Mg2+（25 mmol·μL-1）2.4 μL，DNA模板0.5 μL DEPC水18.7 μL。以建立的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系檢測志賀氏菌，結(jié)果見圖1，出現(xiàn)典型的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線，表明建立的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系適用于志賀氏菌檢測。

2.2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

將濃度約2.8 cfu·mL-1的志賀氏菌進(jìn)行10倍梯度稀釋，采用試劑盒提取每個(gè)稀釋度志賀氏菌的基因組DNA，以此作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，確定檢測方法的靈敏度，檢測結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，原始菌液稀釋至10-7時(shí)仍能檢出，表明本檢測方法對(duì)志賀氏菌的檢測靈敏度約為2.8 cfu·mL-1。

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

提取表1中菌株的基因組DNA，利用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的特異性。結(jié)果見圖3，僅志賀氏菌為陽性，其他菌株均為陰性，說明該方法具有良好的特異性。

2.4 方法的實(shí)用性

圖2 志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測靈敏度Fig.2 Sensitivity of a dual real-time PCR reaction system

利用建立的志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法共計(jì)檢測樣品205份，涉及肉類、豆制品、水產(chǎn)品、奶類、人工污染樣品、動(dòng)物腹瀉物等，檢測結(jié)果采用國標(biāo)法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，試驗(yàn)中沒有出現(xiàn)假陽性和假陰性，而且實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測結(jié)果與國標(biāo)法檢測結(jié)果相符，說明該熒光PCR方法具有良好的實(shí)用性（見表3）。

圖3 志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性結(jié)果Fig.3 Specificity of a dual real-time PCR reaction system

表3 實(shí)際應(yīng)用結(jié)果Table 3 Results of practical application

3 討論與結(jié)論

志賀氏菌引起細(xì)菌性痢疾，常為食物爆發(fā)型或經(jīng)水傳播。人和靈長類是其適宜宿主，根據(jù)宿主的健康狀況和年齡，只需10個(gè)細(xì)菌細(xì)胞就可致病，致病性極強(qiáng)，是重要的食源性致病菌。建立快速、準(zhǔn)確易于推廣使用的檢測方法對(duì)預(yù)防和控制志賀氏菌感染、保障食品安全具有重要意義。

熒光定量PCR技術(shù)是新的PCR檢測技術(shù)，因其具有檢測范圍廣、敏感度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于微生物檢測[12-16]。本研究選擇志賀氏菌屬高度保守的ipaH基因?yàn)榘谢?，進(jìn)行志賀氏菌熒光定量PCR快速檢測方法研究。利用建立熒光定量PCR方法對(duì)包括志賀氏菌在內(nèi)的15種共21株細(xì)菌進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，其中7株志賀氏菌檢測為陽性，而其他細(xì)菌檢測為陰性，說明引物和探針具有高度特異性。為確定該方法檢測靈敏度，對(duì)已知濃度的致病菌進(jìn)行10倍倍比稀釋，提取每個(gè)稀釋度細(xì)菌基因組DNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，結(jié)果顯示，原始菌液稀釋至10-7時(shí)仍能檢出，表明本檢測方法對(duì)志賀氏菌的檢測靈敏度約為2.8 cfu·mL-1。

對(duì)定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，確立定量PCR檢測最佳反應(yīng)條件。經(jīng)對(duì)205份肉類、蛋、奶及其制品和動(dòng)物腹瀉物、人工污染樣品等進(jìn)行檢測，共檢出13份陽性樣本。所建立志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)保留常規(guī)PCR檢測的特異性和敏感性，整個(gè)過程由電腦控制，從加樣到結(jié)果需2 h。通過對(duì)肉類、蛋、奶及其制品和動(dòng)物腹瀉物、人工污染樣品等樣品的檢測證實(shí)，本研究建立的動(dòng)物源性食品中志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測方法操作簡便、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高。

[1]Wang L,Reeves P R.Organization of Shigella antigen gene cluster and identification of its specific genes[J].Infect Immunity,2012, 66(11):3545-3511.

[2]Zheng H,Jing H,Wang H,et al.Stx2vha is the dominant genotype of Shiga toxin-producing Shigella isolated from patiens and domestic animals in three regions of China[J].Microbio Immunol, 2011,49(12):1019-1025.

[3]Paton A W,Paton J C.Mechanisms of Salmonella entryinto host cells[J].Cell Microbiol,2012,9(9):1211-1214.

[4]Jun Y,Shioko S.In vitro effect of subinhibitory concentrations of antibiotics on biofilm formationby clinical strains of Salmonella enterica serovar Typhimurium isolated in Slovakia[J].J Appl Microbiol,2010,104(5):1294-1299.

[5]Mossong J,Marques P,Ragimbeau C,et al.Outbreaks of monophasic Salmonella enterica serovar in Luxembourg[J].Euro Surveill,2011,12(6):209-214.

[6]Stephens N,Sault C,Firestone S M,et al.Largeoutbreaks of Salmonella Typhimurium phage type 135 infectionsassociated with the consumption of products containing raw egg in Tasmania [J].Commun Dis Intell,2010,31(1):115-120.

[7]Wise M G,Healy M,Reece K.Outbreaks of Salmonella in infants associated with powdered infant formula[J].Kokuritsu Iyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho Hokoku,2009,124:69-74.

[8]Dominguez A,Torner N.Foodborne Salmonella-caused outbreaks in Catalonia(Spain),1990 to 2003[J].J Food Prot,2009,70(1): 209-212.

[9]Doublet B,Weill F X,Fabre L,et al.Variant Salmonella genomic island 1 antibiotic resistance gene cluster containing anovel 3-N-aminoglycoside acetyl transferase gene cassette,Aac(3)Id, in Salmonella enterica serovar newport[J].Antimicrob Agents Chemother,2008,48(10):3806-3812.

[10]Eaves D J,Randall L,Gray D T,et al.Prevalence of mutations within the quinolone resistance-determining region ofgyrA,gyrB, parC,and parE and association with antibioticresistance in quinolone resistant Salmonella enterica[J].Antimicrob Agents Chemother, 2004,48(10):4005-4012.

[11]嚴(yán)睿,朱鳳才.志賀菌分子生物學(xué)檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國病原生物學(xué)雜志,2008,3(6):464-467.

[12]鐘青萍,葛萃萃,張世偉,等.檢測食品中志賀氏菌的雙抗夾心ELISA方法的研究[J].食品科技,2007(10):199-202.

[13]李文濤,王俊東,楊利峰,等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J].生物技術(shù)通訊,2006,17(1):112-114.

[14]Brown T M,Osorio F A,Rock D L.Seki1Duplex real-time SYBR Green PCR assays for detection of 17species o f food or waterborne pathogens in stools[J].Clin Microbio,2003,41(11):5134-5146.

[15]Anna Casabianca.Development of a real-time PCR assay using SYBR Green PCR assays for provirus load quantification in a murine model of AIDS[J].Clin Microbio,2004,42(9):4361-4364.

[16]Amazaki W,Taguchi M,Ishibashi M,et al.Development and evaluationof a loop-mediated isothermal amplification assay forrapid and simple detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli[J].Clin Microbiol,2008,57:444-451.

Development of a dual real-time PCR for the rapid detection ofShigellain animal-origined food

LI Dandan1,XU Yigang2,WANG Suijia1,GAO Shenyang3,LI Yijing4(1.Inspection and Quarantine Technology Center of Hainan Entry-Exit Inspection andQuarantine Bureau,Haikou 570311,China;2.Inspection and Quarantine Technology Center of Heilongjiang Entry-Exitn Inspection and Quarantine Bureau,Harbin 150001,China;3.Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Liaoning Medical University,Jinzhou Liaoning 121001,China; 4.School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

AccordingShigellaipaH highly conserved gene sequences,probes and primers designed by optimizing the reaction conditions,the establishment of foods of animal originShigella real-time PCR method,used in foods of animal origin Shiga rapid test forShigella.The results showed that the sensitivity of a dual real-time PCR was 2.8 cfu·mL-1.13 from 205 samples of meat,egg,milk and itsproducts,animal diarrhea materials and artificial contamination samples were positive in a dual real-time PCR assay,which was in accordance with the testing result according to GB 4789.5-2012.The results showed that a dual real-time PCR assay developed in this work was simple,specificity, high sensitivity,good practicality for the detection ofShigella.

Shigella;ipaHgene;real-time PCR;rapid detection

S855.1+2

A

1005-9369（2014）08-0098-05

李丹丹,徐義剛,王綏家,等.動(dòng)物源性食品中志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測方法的建立[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45 (8):98-102.

Li Dandan,Xu Yigang,Wang Suijia,et al.Development of a dual real-time PCR for the rapid detection ofShigellain animal-origined food[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(8):98-102.(in Chinese with English abstract)

2014-01-06

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（310106）；國家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目（2013IK031）；國家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目（2012IK157）；海南省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目（ZDXM20130025）

李丹丹（1979-），女，高級(jí)獸醫(yī)師，博士，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)與免疫學(xué)。E-mail:108074182@qq.com

*通訊作者：徐義剛，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)與免疫學(xué)。E-mail:108074182@qq.com

時(shí)間2014-7-18 15:01:44[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140718.1501.008.html