TGF-β1 在COPD 氣道重塑中的作用及抗膽堿能藥物干預(yù)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究

虞文嫣 衛(wèi) 越 虞喜豪 崔永耀

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣流受限和外周氣道炎癥為特征的常見(jiàn)呼吸系統(tǒng)疾病。由于其發(fā)生率及病死率較高、危害性大，已成為醫(yī)藥學(xué)界關(guān)注熱點(diǎn)之一。近年來(lái)有研究表明，脂多糖(LPS 革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分)可直接引起呼吸道上皮的損傷及炎癥反應(yīng)，持續(xù)的炎癥導(dǎo)致氣道壁重構(gòu)，黏液增生，膠原含量增加，最后引起氣流受限，促進(jìn)COPD 的發(fā)生和發(fā)展。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF -β1)能夠誘導(dǎo)包括分化、炎癥、增生以及凋亡等多種細(xì)胞反應(yīng)，在COPD、哮喘、腫瘤等多種病理過(guò)程中均發(fā)揮重要作用［1，2］。因此，TGF-β 在氣道重塑中的作用值得關(guān)注。由于COPD 的病理生理過(guò)程至今尚未完全闡明，臨床上缺乏可以有效對(duì)抗其肺部炎癥的藥物。乙酰膽堿作為膽堿能神經(jīng)分泌的神經(jīng)遞質(zhì)，在氣道平滑肌收縮和腺體分泌等方面起著重要作用。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)抗膽堿藥物具有潛在的抗炎抗重塑作用而備受重視［3～5］。本研究旨在以LPS 刺激小鼠氣道造成COPD模型基礎(chǔ)上，從細(xì)胞學(xué)角度、病理學(xué)角度觀察TGF-β1在COPD 小鼠氣道重塑中的作用及抗膽堿能藥物對(duì)其的干預(yù)效應(yīng)，進(jìn)一步探討COPD 形成及治療機(jī)制作用。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象及實(shí)驗(yàn)過(guò)程:KM 小鼠30 只，雄性健壯，體重25 ±5g(上海市交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，實(shí)驗(yàn)小鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分4 組:對(duì)照組(7 只):氣道內(nèi)滴注50μl 生理鹽水，2次/周，共6 周;COPD 模型組(8 只)(參考Juanita H. J. Vernooy 法):氣道內(nèi)滴注5μg/50μl LPS(Sigma 公司)，2 次/周，共6 周;噻托溴銨組(7 只):氣道內(nèi)滴注5μg/50μl LPS，2 次/周，3 周后，在氣道內(nèi)滴注LPS 前30min 用霧化儀在一密閉容器內(nèi)霧化吸入50μg 噻托溴銨(Boehringer Ingelheim 公司)20min，共6 周;山莨菪堿組(8 只):氣道內(nèi)滴注5μg/50μl LPS，2 次/周，3 周后，在氣道內(nèi)滴注LPS 前30min 用霧化儀在密閉容器內(nèi)霧化吸入28μg 山莨菪堿(上海第一生化藥業(yè)有限公司)20min，共6 周。另正常飼養(yǎng)5 只KM 小鼠作為空白組。

2.標(biāo)本處理:實(shí)驗(yàn)小鼠于最后一次給藥后1 周處死，分別編號(hào)后取出雙肺，取右下肺以10%甲醛固定后外送切片，取左肺下葉與右肺中葉分別稱重，按0.0166ml/mg 肺組織重量加入PBS。用勻漿機(jī)以8000r/min 的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)1min。取出1.3ml至EP 管中。用離心機(jī)在4℃、10000r/min 的轉(zhuǎn)速下離心15min。取上清加入500μl 細(xì)胞裂解液，8000r/min 的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)15s 后取上清備用。左肺下葉勻漿液用于ELISA，右肺中葉勻漿液用于Western blot 法檢測(cè)。

3.測(cè)定肺組織中α-SMA 含量:采用Western blot 法測(cè)定肺組織中α-SMA 含量，取各組肺勻漿上清液20μl，加入細(xì)胞裂解液20μl 以及上樣緩沖液10μl，混合后100℃水浴5min，10000r/min 離心5min 后制成樣品;后采用SDS -Page 分離各樣品中蛋白。在4℃環(huán)境中，200mA 恒流模式下將SDS-Page分離的蛋白轉(zhuǎn)至NC 膜。轉(zhuǎn)膜后用TBST 洗膜5min，5%milk-TBST 封閉1h。以1%milk -TBST 洗膜5min 后，加入α -SMA 抗體(Abcam)封閉慢搖12h。以TBST 洗膜5min，2 次，1%milk-TBS-T 洗膜5min，3 次后加入山羊抗鼠抗體(北京中杉公司)慢搖1h，1%milk-TBS-T 洗膜5min，2 次，TBS -T 洗膜5min，3 次后，至曝光室曝光。曝光結(jié)果采用軟件ImageJ 分析。

4.測(cè)定肺組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF -β1:采用ELISA 方法測(cè)定肺勻漿液中TGF -β1 含量。取小鼠TGF -β1 試劑盒(麥約爾生物)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)配制各濃度標(biāo)準(zhǔn)液并取各組小鼠肺勻漿液50μl，加入樣本稀釋液410μl、20μl 1mmol/L HCl、20μl 1mmol/L NaOH 進(jìn)行TGF -β1 激發(fā)實(shí)驗(yàn)。向96 孔酶標(biāo)板內(nèi)加入各濃度標(biāo)準(zhǔn)液以及各組樣本100μl，貼膜后恒溫37℃溫育120min。洗板6 次。向每孔加入一抗工作液100μl，貼膜后恒溫37℃溫育60min。洗板6 次。向每孔加入酶標(biāo)抗體工作液100μl，貼膜后恒溫37℃溫育30min。洗板6 次。向每孔加入底物工作液100μl，避光置37℃環(huán)境約15min 后，加入反應(yīng)終止液100μl 終止反應(yīng)。將96 孔酶標(biāo)板置酶標(biāo)儀測(cè)定A450值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中細(xì)胞因子的含量。

5.測(cè)定肺組織中TGF -β1 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路Smad -2 與pSmad-2 含量:采用Western blot 法測(cè)定肺勻漿上清液中Smad-2 與pSmad-2 含量:取各組肺勻漿上清液20μl，加入細(xì)胞裂解液20μl 以及上樣緩沖液10μl，混合后100℃水浴5min，10000r/min 離心5min 后制成樣品;后采用SDS - Page分離各樣品中蛋白。在4℃環(huán)境中，200mA 恒流模式下將SDS-Page 分離的蛋白轉(zhuǎn)至NC 膜。轉(zhuǎn)膜后用TBST 洗膜5min，加入Smad-2 抗體與pSmad-2 抗體(Cell Signaling Technology)封閉慢搖12h。以TBST 洗膜5min，2 次，1%milk-TBS-T 洗膜5min，3 次后加入山羊抗鼠抗體慢搖1h，1%milk-TBS -T洗膜5min，2 次，TBS -T 洗膜5min，3 次后，至曝光室曝光。曝光結(jié)果采用軟件Image J 分析。

6.病理切片:病理切片行常規(guī)Masson 染色及HE 染色。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用GraphPad Prism 5.0 進(jìn)行描述性分析，組間差異比較使用單因素方差分析Dunnett 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.肺組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF -β1 表達(dá)情況:ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示COPD 模型組中TGF -β1 明顯高于對(duì)照組，而抗膽堿能藥物(山莨菪堿、噻托溴銨)干預(yù)組中TGF -β1 較COPD 組有明顯的降低，詳見(jiàn)圖1。

圖1 ELISA 檢測(cè)肺組織勻漿中TGF-β1 表達(dá)情況

2.肺組織中TGF-β1 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路Smad -2與pSmad -2 含量:Western blot 法檢測(cè)Smad -2 與pSmad-2 含量，為排除不同組別肺組織勻漿中初始Smad-2 的差異性，將Western blot 法檢測(cè)所得Smad-2 與pSmad -2 做比值處理，更直觀體現(xiàn)Smad -2活化程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示COPD 模型組中pSmad -2/Smad-2 明顯高于對(duì)照組?？鼓憠A能藥物(山莨菪堿、噻托溴銨)干預(yù)組中pSmad -2/Smad -2 較于COPD 組有明顯的降低，詳見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 Western blot 法檢測(cè)pSmad-2/Smad-2

圖3 Western blot 法pSmad-2 與Smad-2 曝光結(jié)果

3.肺組織中α-SMA(α-肌動(dòng)蛋白)含量:Western blot 法檢測(cè)結(jié)果顯示COPD 模型組中α -SMA 顯著高于對(duì)照組;抗膽堿能藥物(山莨菪堿、噻托溴銨)組中α-SMA 相較于COPD 模型組出現(xiàn)顯著下降，詳見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 Western blot 法檢測(cè)肺組織中α-SMA 表達(dá)

圖5 Western blot 法α-SMA 曝光結(jié)果

4.病理切片Masson 染色結(jié)果:染色結(jié)果顯示COPD 模型組相比于對(duì)照組出現(xiàn)明顯的肺組織膠原的沉積及平滑肌組織增生情況(圖6A、B)。山莨菪堿組相較于COPD 模型組，肺組織膠原沉積明顯減少，平滑肌組織增生情況也得到了改善(圖6B、C)。

圖6 Masson 染色結(jié)果(×100)

5.病理切片HE 染色結(jié)果:染色結(jié)果顯示，COPD模型組相比于對(duì)照組出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)(圖7A、B)，山莨菪堿組相較于COPD 模型組炎癥反應(yīng)減輕，氣道周?chē)胺谓M織間隙紅細(xì)胞滲出明顯減少，肺泡內(nèi)水腫明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況得到了明顯改善，氣管黏膜上皮完整(圖7B、C)。

討 論

圖7 HE 染色結(jié)果(×40)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ELISA 方法檢測(cè)出在COPD 模型組中TGF - β1 明顯增高，通過(guò)Western blot 法檢測(cè)出pSmad-2/Smad -2 明顯高于對(duì)照組。TGF - β1 在體內(nèi)來(lái)源廣泛，在細(xì)胞分化的所有階段很多細(xì)胞及組織都會(huì)產(chǎn)生TGF-β1。但在COPD 的發(fā)病過(guò)程之中，它主要來(lái)源于肺局部浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞、單核-吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和氣道壁的成纖維細(xì)胞。TGF - β1是一種多功能細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，以自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌的方式通過(guò)細(xì)胞表面的受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控細(xì)胞的增殖、分泌和凋亡［6］。介導(dǎo)TGF -β1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的是活化因子Smad 家族。Smad 蛋白是TGF -β1家族的特異性細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，可分為3 個(gè)亞家族R-Smad、co -Smad 和I -Smad。受體激活型(R-Smad)主要通過(guò)膜結(jié)合蛋白的相互作用以及SARA(Smad 受體激活錨定蛋白)錨定細(xì)胞膜，主要有Smad-2、Smad3。共同通路型(co-Smad)是所有TGF-β家族信號(hào)轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核所必須，主要是Smad4。TGF-β1 作為配體形成受體復(fù)合物，激活Smad 家族，使R-Smad 磷酸化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)pSmad -2/Smad-2 排除了不同組別肺組織中初始Smad -2 的差異性，直接反應(yīng)Smad -2 被活化的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了TGF -β1 參與了COPD 病情的進(jìn)展，并通過(guò)TGF-β1/Smad 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞增殖、分泌及凋亡，發(fā)揮TGF-β1 的生物學(xué)效應(yīng)。

氣道重塑是指氣道在慢性炎癥刺激下，所發(fā)生的氣道壁的結(jié)構(gòu)改變，涉及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積、氣道平滑肌(airway smooth muscle，ASM)增厚、上皮下纖維化、肌成纖維細(xì)胞增生的改變。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot 法檢測(cè)出在COPD 模型組中α-SMA 顯著高于對(duì)照組，病理學(xué)檢測(cè):通過(guò)Masson 染色可以明顯看出COPD 模型組相比于對(duì)照組出現(xiàn)明顯的肺組織膠原的沉積及平滑肌組織增生情況。有研究結(jié)果顯示，TGF -β1 可誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞中ECM 的表達(dá)，并刺激蛋白酶抑制劑的產(chǎn)生。從中可反映出TGF-β1 不但可促進(jìn)各種細(xì)胞外基質(zhì)成分如纖黏蛋白、膠原和蛋白多糖的合成，對(duì)新合成細(xì)胞基質(zhì)的降解亦有明顯的抑制作用，從而引起ECM 分解減少和沉積增加［7，8］。細(xì)胞外基質(zhì)的合成是保護(hù)組織損傷的一個(gè)重要機(jī)制，但是過(guò)度的細(xì)胞外基質(zhì)合成則對(duì)氣道氣體交換有著嚴(yán)重的影響，進(jìn)而對(duì)氣道結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接影響，進(jìn)一步加重氣道的纖維化。故本實(shí)驗(yàn)中COPD 病理切片染色出現(xiàn)明顯細(xì)胞外基質(zhì)沉積證實(shí)了這點(diǎn)。

TGF-β1 是成纖維細(xì)胞的強(qiáng)效趨化因子，近年研究顯示，TGF-β1、TGF -β2 通過(guò)刺激成纖維細(xì)胞到肌成纖維細(xì)胞(MF)的表型改變。大多數(shù)情況下MF 以表達(dá)α -SMA 為主，MF 在氣道黏膜下增殖和積聚使氣道壁增厚。MF 具有收縮性，使管腔更加狹窄，并且MF 產(chǎn)生的膠原纖維、彈性纖維和網(wǎng)狀纖維等沉積于基膜，限制管腔擴(kuò)張。因此，推測(cè)MF 在氣道重塑中可能起重要作用。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)COPD 組α-SMA 高度表達(dá)從某種程度上也體現(xiàn)了TGF -β 促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖并向MF 轉(zhuǎn)變的事實(shí)。另有研究表明，TGF -β1 可能誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖。氣道平滑肌細(xì)胞在TGF-β1 的刺激下細(xì)胞表型可由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化，從而使平滑肌細(xì)胞不僅具有收縮功能使管腔變窄，同時(shí)由于細(xì)胞外基質(zhì)及纖維產(chǎn)生增加而限制了管腔的擴(kuò)張，共同參與了氣道重塑。本實(shí)驗(yàn)在COPD 模型組中Masson 染色平滑肌增殖結(jié)果及α-SMA 高度表達(dá)直接體現(xiàn)了平滑肌細(xì)胞的高度增殖，同時(shí)由于染色顯示膠原沉積從某種程度上也反映了合成型平滑肌細(xì)胞的合成功能。

本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)ELISA 及Western blot 法可檢測(cè)出干預(yù)組抗膽堿能藥物治療后，TGF-β1、pSmad -2/Smad-2 相較于COPD 模型組出現(xiàn)了顯著的下降;病理切片HE 染色結(jié)果可以看出，干預(yù)組病變均較COPD 模型組減輕，氣道周?chē)胺谓M織間隙紅細(xì)胞滲出明顯減少，肺泡內(nèi)水腫明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況得到了明顯改善，氣管黏膜上皮完整。由此結(jié)果，筆者認(rèn)為抗膽堿能藥物除具有傳統(tǒng)意義上的支氣管擴(kuò)張的作用，還存在抗炎的生物學(xué)效應(yīng)。有研究表明，神經(jīng)源性和非神經(jīng)源性的乙酰膽堿均可能在肺泡和支氣管腔內(nèi)發(fā)揮其促炎性作用。其通過(guò)作用于受體，釋放炎癥因子趨化炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)與活化，再通過(guò)活化的炎癥細(xì)胞所釋放的炎癥介質(zhì)引發(fā)瀑布式炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)COPD 中的氣道炎癥發(fā)生發(fā)展［9］?？鼓憠A能藥物正是通過(guò)阻斷乙酰膽堿的作用來(lái)發(fā)揮抗炎作用，隨著炎癥得到改善，可以看到炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，炎癥因子TGF -β1 下降及由TGF-β1 所激活的pSmad -2/Smad -2 值的下降。另外本研究中通過(guò)Western blot 法檢測(cè)出干預(yù)組抗膽堿能藥物治療后，α -SMA 出現(xiàn)顯著下降;病理切片Masson 染色可以觀察到相較于COPD 模型組，肺組織膠原沉積明顯減少，平滑肌組織增生情況也得到了改善，由此可推測(cè)抗膽堿能藥物對(duì)氣道重塑有一定的干預(yù)作用。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，筆者認(rèn)為其干預(yù)氣道重塑的可能機(jī)制如下:①通過(guò)降低具有促氣道重塑的炎癥因子如TGF -β1 的產(chǎn)生來(lái)實(shí)現(xiàn)的;②通過(guò)直接阻斷成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞上的膽堿能受體，從而拮抗乙酰膽堿的細(xì)胞增殖效應(yīng)，抑制肌成纖維細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步抑制氣道重塑的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)中干預(yù)組α-SMA(肌成纖維細(xì)胞的表型)的顯著降低從某種程度上也證實(shí)了這點(diǎn)。

綜上所述，TGF -β1 等參與了COPD 病情的進(jìn)展，并可能其通過(guò)TGF-β1/Smad 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞增殖、分泌及凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積增加、成纖維細(xì)胞增殖并發(fā)展為肌成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖并向合成型轉(zhuǎn)變，從而在氣道重塑中發(fā)揮重要作用?？鼓憠A能藥物通過(guò)阻斷膽堿能受體，發(fā)揮抗炎效應(yīng)［5］。同時(shí)其又可通過(guò)阻斷位于成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞表面的M 受體拮抗Ach 細(xì)胞增殖效應(yīng)，或者通過(guò)抑制具有促重塑的炎癥因子釋放從而直接或間接地干預(yù)氣道重塑的進(jìn)展［10，11］。此為今后COPD臨床治療藥物選擇及開(kāi)發(fā)新的靶點(diǎn)藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。有關(guān)各類(lèi)炎性因子及相關(guān)受體相互作用關(guān)系、臨床實(shí)際檢測(cè)等仍待進(jìn)一步研究。

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