肌肽對高糖引起的HUVECs 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

莊旭東 師 巖

糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，且發(fā)生早、預(yù)后差、病死率高，其引發(fā)的心腦血管疾病是糖尿病患者致死致殘的主要原因，約占糖尿病患者死亡原因的60% ～70%［1］。如何有效保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，成為防治糖尿病血管并發(fā)癥的關(guān)鍵［2］。2004年，美國糖尿病學(xué)會提出糖尿病及其血管并發(fā)癥都有統(tǒng)一的發(fā)病機(jī)制，即高血糖引起的氧化應(yīng)激損傷、氧化應(yīng)激致使大量氧自由基及活性氧直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起細(xì)胞凋亡，最終表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙［3］。因此抗氧化治療成為防治糖尿病血管病變的一個有效途徑。研究顯示，肌肽作為一種內(nèi)源性的抗氧化劑，它具有水溶性好、性質(zhì)穩(wěn)定、分子質(zhì)量低、易于被機(jī)體利用等優(yōu)點［4］。本實驗以體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為對象，建立高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型，觀察肌肽能否減弱高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，為肌肽在防治糖尿病血管并發(fā)癥方面提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.實驗材料:人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs 本實驗室保存(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心);肌肽(美國Sigma 公司);胎牛血清(Hyclone，美國);0.25%胰酶-0.02%EDTA(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司);DMEM 培養(yǎng)基(美國Gibco 公司);丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒檢測試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);caspase -3 活性檢測試劑盒(南京凱基生物公司)。

2.實驗方法:(1)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs 常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。(2)實驗分組及預(yù)處理方式。細(xì)胞分組:①正常對照組(NC 組)，葡萄糖濃度為5. 5mmol/L;②高糖損傷組(HG組)，葡萄糖濃度各為20、25、30mmol/L;③高糖+肌肽預(yù)保護(hù)組(Car+HG 組)，高糖刺激的細(xì)胞，提前6h 加入20mmol/L 肌肽預(yù)保護(hù)。(3)MTT 法檢測細(xì)胞的存活率:細(xì)胞以2 ×104個/孔的密度接種于96 孔培養(yǎng)板，含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液在37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)24h 后，棄培養(yǎng)液，更換不含血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)6h，使細(xì)胞同步化。分組同上，每組設(shè)6 個平行孔，再培養(yǎng)24、48、72h 后，加50μl 新鮮配制的1mg/ml MTT，于37℃、5%CO2培養(yǎng)4h 后，棄培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，輕搖10min 溶解紫色結(jié)晶。30min 內(nèi)利用酶標(biāo)儀在490nm 波長下檢測光密度(OD)值。(4)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA、LDH、SOD 的含量:分別檢測對照組、高糖組和肌肽預(yù)保護(hù)組的細(xì)胞上清液中MDA、LDH、SOD 含量，從而反映各組細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。檢測MDA、LDH、SOD的細(xì)胞上清液取樣量分別為200、100、150μl，采用化學(xué)比色法，按試劑盒說明書操作。(5)分光光度法檢測肌肽對細(xì)胞caspase-3 活性的影響:按照caspase -3 活性試劑盒說明書操作。分光光度計在400 nm 波長檢測各組細(xì)胞的吸光度值，確定各組細(xì)胞caspase-3 活性的值，比較各組細(xì)胞的凋亡損傷程度。

3.統(tǒng)計學(xué)方法:運用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間的差異采用t 檢驗法進(jìn)行處理，以P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:倒置相差顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，正常對照組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72h時，始終呈現(xiàn)單層鋪路石樣排列，細(xì)胞以多形性和短梭形為主，細(xì)胞邊緣清晰，具有較強(qiáng)的折光性，細(xì)胞核橢圓形，核膜胞膜完整，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)無明顯顆粒樣物質(zhì)及異常包涵體。高糖組細(xì)胞于48h 增殖旺盛，細(xì)胞數(shù)量明顯多于正常糖的細(xì)胞，但細(xì)胞形態(tài)較差。而72h 后，高糖組細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯細(xì)胞變圓、體積縮小、大量細(xì)胞脫壁浮起，細(xì)胞變形、皺縮，折光性弱，細(xì)胞間邊緣模糊，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，可見細(xì)胞碎片;而高糖中加入肌肽預(yù)保護(hù)組細(xì)胞形態(tài)接近于正常糖對照組(圖1)。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)72h 的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)(×400)

2.MTT 檢測不同濃度葡萄糖及肌肽對HUVECs細(xì)胞存活率的影響:與正常對照組相比，20、25、30mmol/L 葡萄糖刺激24h 后，細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05，圖2)。高濃度葡萄糖處理48、72h 后，與24h 相比細(xì)胞存活率降低，隨著高糖刺激時間和高糖濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，圖2)，提示細(xì)胞存活率具有時間、濃度依賴性。30mmol/L 葡萄糖刺激48h，細(xì)胞存活率＜40%，25mmol/L 葡萄糖刺激48h，細(xì)胞存活率約50%，提示25mmol/L 濃度能兼顧體現(xiàn)高糖誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷和適當(dāng)?shù)募?xì)胞死亡率，故實驗中選擇25mmol/L 為常規(guī)高糖刺激濃度。高糖刺激72h細(xì)胞死亡率過高，選擇高糖刺激48h，既可造成內(nèi)皮細(xì)胞可逆性氧化應(yīng)激損傷，又能較好反應(yīng)抗氧化劑肌肽對血管的保護(hù)作用。25mmol/L 高糖刺激48h 并加入肌肽預(yù)保護(hù)的細(xì)胞中，細(xì)胞的存活率較高糖組顯著提高，可由高糖損傷組的57. 07% ±1. 94%增加到79.29% ±1.61%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖2 MTT 檢測不同濃度高糖和肌肽對HUVECs 存活率的影響

3. MDA、LDH、SOD 含量的測定:細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA、LDH、SOD的含量，反映內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。高糖刺激48h 組與正常對照組相比，LDH、MDA 含量明顯增高，SOD 含量顯著下降(P ＜0.01)。但給予有效濃度肌肽20mmol/L 后，與高糖損傷組(25mmol/L)相比，其LDH、MDA 含量明顯下降，SOD含量顯著上升(P ＜0.01，表1)。說明肌肽可作為有效的抗氧化劑，明顯抑制高糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，對高糖引起的細(xì)胞損傷有一定保護(hù)作用。

表1 各組MDA、LDH、SOD 含量的比較(±s，n=5)

表1 各組MDA、LDH、SOD 含量的比較(±s，n=5)

與正常對照組比較，* P ＜0.05;與高糖損傷組(25mmol/L)比較，#P ＜0.05

組別 MDA (nmol/L) LDH(U/L) SOD(U/ml)0.569±0.067 1708.774±12.893 23.847±0.314高糖損傷組(25mmol/L) 1.232±0.144* 1928.029±32.596* 19.364±0.545*高糖(25mmol/L)+肌肽預(yù)保護(hù)(20mmol/L)組 0.613±0.077# 1784.238±30.144# 23.044±0.415正常對照組#

3. caspase -3 活性測定:分別測定了正常對照組、高糖損傷組(25mmol/L)及高糖(25mmol/L)+肌肽預(yù)保護(hù)(20mmol/L)組細(xì)胞內(nèi)caspase -3 活性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對照組細(xì)胞caspase -3 活性較低，活性值為3.81 ±0.63;高糖損傷組(25mmol/L)細(xì)胞的caspase-3 活性值為10.42 ±0.64，與正常對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);與高糖損傷組(25mmol/L)相比，高糖(25mmol/L)+肌肽預(yù)保護(hù)(20mmol/L)組caspase -3 活性值為4.45 ±0.75，明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

討 論

圖3 檢測caspase-3 活性

糖尿病血管病變的主要表現(xiàn)之一是血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，氧化應(yīng)激在其病變中的損傷作用已得到證實，如何保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受高糖損傷，抗氧化成為防治的關(guān)鍵［5］。肌肽作為一種內(nèi)源性抗氧化劑，具有多種抗氧化作用，能有效清除活性氧和自由基，對于改善及治療2 型糖尿病并發(fā)癥有很好應(yīng)用前景，例如防治糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病心血管病及糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)損傷等方面已有報道［6，7］。為了進(jìn)一步研究肌肽這種抗氧化劑在糖尿病心血管疾病中的作用，實驗中以HUVECs 為對象，建立高糖環(huán)境中的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，研究肌肽對高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。MTT法檢測了HUVECs 在不同高糖濃度中，不同時間點的細(xì)胞存活率，建立了高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型，觀察肌肽對高糖刺激下的細(xì)胞保護(hù)作用。再通過檢測正常對照組、高糖損傷組和高糖+肌肽預(yù)保護(hù)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA、LDH、SOD 的含量，研究肌肽在高糖環(huán)境誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷過程中的抗氧化作用。

近年研究已經(jīng)明確，氧化應(yīng)激主要是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致自由基/抗氧化物平衡失調(diào)，損傷機(jī)制與細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)和核酸變性密切相關(guān)，其中脂質(zhì)過氧化必將損傷細(xì)胞的功能［8，9］。MDA是脂質(zhì)過氧化的降解產(chǎn)物，測其含量的高低可反映脂質(zhì)過氧化的程度，從而反映細(xì)胞受過氧化損傷的程度［10］。細(xì)胞損傷時，胞內(nèi)LDH 漏出到胞外，測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH 含量可反映細(xì)胞損傷程度，含量的增加是細(xì)胞不可逆損傷或壞死的標(biāo)志。SOD 是細(xì)胞內(nèi)抗氧化損傷的重要防線，是一種抗氧化系統(tǒng)重要的抗氧化酶，其活性的高低又可反映出細(xì)胞清除氧自由基的能力。研究結(jié)果顯示高糖損傷組(25mmol/L)與正常對照組相比，MDA、LDH 含量明顯增高，SOD 含量顯著下降，而高糖(25mmol/L)+肌肽預(yù)保護(hù)(20mmol/L)組與高糖損傷組(25mmol/L)相比，MDA、LDH 含量明顯下降，SOD 含量顯著升高，這說明高糖能增強(qiáng)血管細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，而肌肽可有效抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而保護(hù)細(xì)胞減少損傷。

近年研究表明，氧化應(yīng)激損傷會加劇細(xì)胞凋亡，其發(fā)生主要由兩條信號通路:死亡受體介導(dǎo)的信號通路和線粒體介導(dǎo)的信號通路，其發(fā)生發(fā)展過程中caspase 蛋白酶家族引發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)，兩條通路最終在caspase-3 處會合，在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮核心作用，caspase-3 活化增高被稱為凋亡發(fā)生的標(biāo)志性事件，caspase-3 也被稱為細(xì)胞凋亡中最主要的終末剪切酶［11，12］。本研究發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境作用細(xì)胞48h 后，高糖組中caspase -3 活性增高，而肌肽預(yù)保護(hù)組中caspase-3 活性降低，因此推測肌肽作用于高糖環(huán)境下的血管內(nèi)皮細(xì)胞，可通過降低凋亡蛋白caspase-3 活性，抑制凋亡信號通路介導(dǎo)抗氧化作用，保護(hù)線粒體，減少細(xì)胞功能障礙，從而減弱高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡損傷。肌肽的這種抗氧化作用有望成為防治糖尿病血管并發(fā)癥的新途徑，其詳細(xì)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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