不同氧濃度對三維體外著床模型中內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的影響

葉天民 肖 佳 楊健之 范宇平 滕曉明

不孕癥是當(dāng)今人類生殖的一個大問題。雖然我們已經(jīng)擁有了輔助生殖的各種技術(shù)、適宜著床的內(nèi)膜、和優(yōu)質(zhì)的胚胎等，均可以在一定程度上進(jìn)行選擇和檢測，但在實(shí)際臨床工作中，許多移植的胚胎仍然難以得到成功妊娠。其中的主要問題之一在于胚胎的著床。所以，目前不孕癥的治療成功率仍然在30%左右徘徊［1］。胚胎著床這個在生殖過程中非常重要的事件，在哺乳動物的不同物種之間，其幾個基本的步驟都是非常相似的。主要分為定位、黏著和侵入3 個步驟。定位是指囊胚在內(nèi)膜表面不穩(wěn)定的黏著。此后，黏著步驟是指囊胚滋養(yǎng)細(xì)胞開始具有黏著能力并黏于子宮內(nèi)膜表面。緊接著，滋養(yǎng)細(xì)胞會穿破子宮內(nèi)膜的腔上皮層，進(jìn)入內(nèi)膜的間質(zhì)，即侵入過程［2］。這些步驟需要胚胎和子宮之間和諧而精密的對話［3］。該系列對話是由諸多分子通路所介導(dǎo)的，其中包括了性激素、細(xì)胞因子、生長因子、黏著分子和脂質(zhì)等［4］。

子宮中進(jìn)行胚胎著床的環(huán)境是一個相對缺氧的環(huán)境，這種環(huán)境可能更加利于胚胎的發(fā)育。一些研究發(fā)現(xiàn)，如果將胚胎置于大氣氧濃度的環(huán)境，將對胚胎產(chǎn)生不利的影響，甚至導(dǎo)致胚胎的死亡［5］。有文獻(xiàn)報道，兔子、鼠類及靈長類恒河猴輸卵管處的氧分壓大約是5% ～8%，而恒河猴的著床胚胎部位的氧分壓濃度大約是1.5% ～2.0%。在兔子和倉鼠的子宮內(nèi)氧分壓是隨著發(fā)情周期的變化而變化的，并且從非著床期到著床期，氧分壓濃度從5. 3% 下降到了3.5%［6］。在很多胚胎體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中都發(fā)現(xiàn)，若將胚胎培養(yǎng)環(huán)境中的氧濃度從大氣氧濃度降至文獻(xiàn)報道的生理濃度將會有利于胚胎的體外發(fā)育，具體表現(xiàn)在培養(yǎng)后囊胚發(fā)育率及胚胎細(xì)胞數(shù)目的差異［7～11］。在小鼠的胚胎體外培養(yǎng)中，氧濃度5%或者7%的培養(yǎng)環(huán)境中囊胚發(fā)育率及胚胎細(xì)胞數(shù)目將會＞20%的大氣氧濃度。純品系及遠(yuǎn)系雜交品種小鼠均得到相同的結(jié)果［7，11～13］。但迄今為止，低氧濃度對胚胎著床的影響機(jī)制還不甚清楚。本研究將基于已經(jīng)建立的三維小鼠體外胚胎著床模型，將整個培養(yǎng)環(huán)境的氧濃度調(diào)整為2%，從而探究缺氧環(huán)境對胚胎著床的作用和影響。

材料與方法

1.小鼠體外胚胎著床模型及缺氧處理后黏著率的對比:本研究所有健康雌性及雄性ICR 小鼠由同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)均得到同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。按照Ye 等［14］已經(jīng)建立的小鼠體外著床模型，將其中一組置于氧濃度2%的密封箱(美國Cell signaling 公司)內(nèi)，用2%氧氣、98%二氧化碳的氣體進(jìn)行換氣5min，然后密封好，置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。另外一組為對照組，直接置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。之后觀察對比這兩組之間胚胎與內(nèi)膜的黏著率。

2.HE 染色及細(xì)胞凋亡TUNEL 實(shí)驗(yàn):三維模型中的胚胎內(nèi)膜組織經(jīng)常規(guī)固定包埋后切片，進(jìn)行HE 染色，脫水后使用中性樹脂封片。切片中細(xì)胞凋亡的檢測通過TUNEL - POD試劑盒來完成(美國羅氏公司)，最后用辣根過氧化物酶氧化底物進(jìn)行顯色，用中性樹脂封片，具體實(shí)驗(yàn)過程參見該公司試劑盒說明書。

3.統(tǒng)計學(xué)方法:兩組胚胎黏著率的比較，用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較;兩組內(nèi)膜上皮層厚度的比較，用ANOVA 檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.2%氧濃度和大氣氧濃度下體外胚胎黏著的對比:小鼠囊胚在2%的氧濃度及大氣氧濃度下的胚胎黏著率分別為41.4%和53.2%，這兩組的胚胎黏著率比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 2%氧濃度和大氣氧濃度下三維體外著床模型中的黏著率

2.三維模型組織切片HE 染色:為了觀察不同氧濃度下胚胎黏附著床情況，將已經(jīng)在體外模型中黏附于子宮內(nèi)膜的胚胎連同內(nèi)膜組織進(jìn)行固定切片，進(jìn)行HE 染色，觀察胚胎的發(fā)育情況及內(nèi)膜組織的形態(tài)。缺氧條件及大氣氧濃度環(huán)境下胚胎體外黏附著床的形態(tài)情況見圖1。圖1 中可見，兩種情況下的小鼠胚胎均已經(jīng)黏著于體外共培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮層表面，未見明顯形態(tài)學(xué)異常。

圖1 2%氧濃度(A)及大氣氧濃度下(B)的

3.內(nèi)膜組織腔上皮細(xì)胞層厚度的測定:為了對比兩種氧濃度下子宮內(nèi)膜形態(tài)，對兩種情況下子宮內(nèi)膜的腔上皮層厚度進(jìn)行多點(diǎn)采樣，照相后用Image Pro軟件進(jìn)行測量，然后對比發(fā)現(xiàn)，兩組上皮層厚度比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.095，圖2)。

圖2 2%氧濃度及大氣氧濃度下的三維體外著床模型培養(yǎng)后，內(nèi)膜組織腔上皮細(xì)胞層的厚度

4.細(xì)胞凋亡的檢測:對兩種氧濃度下體外培養(yǎng)內(nèi)膜組織及黏附胚胎進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測，發(fā)現(xiàn)在2%氧濃度下，子宮內(nèi)膜組織中較多間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞凋亡(圖3)。

討 論

圖3 2%氧濃度(A)及大氣氧濃度下(B)的

目前許多生殖醫(yī)學(xué)中心在進(jìn)行臨床體外受精治療的時候，采用普通的二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行胚胎的體外培養(yǎng)，其培養(yǎng)環(huán)境的氧濃度大約是大氣的氧濃度(約20%)。因?yàn)樵隗w內(nèi)環(huán)境下，胚胎并沒有處在這樣高氧濃度的環(huán)境中(約2% ～8%)，所以該培養(yǎng)條件潛在地將胚胎置于了氧化壓力之中，并增加了氧自由基的濃度對胚胎的影響［6］。對于小鼠的胚胎而言，Whitten 等已經(jīng)證實(shí)，在5%的氧濃度下，大部分小鼠受精卵可以體外發(fā)育至囊胚，但如果氧濃度為20%就不會有受精卵發(fā)育成囊胚。Quinn 等［12］則發(fā)現(xiàn)在高濃度氧的環(huán)境中，只有5%的小鼠受精卵可以發(fā)育至囊胚。在其他的動物實(shí)驗(yàn)中，也得到了相似的結(jié)果。但也有文獻(xiàn)報道，如給予較長時間的培養(yǎng)(78 ～95h)，小鼠受精卵在體外20%的氧濃度環(huán)境下也能夠發(fā)育至囊胚［5］。這些結(jié)果的差異可能是因?yàn)榕咛碜杂诓煌膶?shí)驗(yàn)小鼠品系，也可能源于實(shí)驗(yàn)技術(shù)的提高［5］。

在本實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，曾經(jīng)先嘗試了小鼠胚胎同樣環(huán)境下的體外培養(yǎng)。在20%氧濃度的情況下，從受精卵到囊胚的體外培養(yǎng)所需的時間大概落后于體內(nèi)情況12 ～24h。為了保證實(shí)驗(yàn)中胚胎的質(zhì)量，筆者的三維體外著床模型中采用的是新鮮采取小鼠囊胚進(jìn)行共培養(yǎng)。所以在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者也將小鼠囊胚放在同樣的培養(yǎng)液中在20%的氧濃度下進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)小鼠囊胚在1 ～2 天后外面透明帶均會消失，然后大約1 ～2 天之后，會黏著在培養(yǎng)皿的底部，然后在底部發(fā)育攤開，變成餅狀。中間是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞，外周為滋養(yǎng)細(xì)胞。這就證明，在這樣的培養(yǎng)環(huán)境中，小鼠囊胚可以存活很多天，只是它無法遇到能夠著床的子宮內(nèi)膜組織或者細(xì)胞。

盡管如此，胚胎除了存活的能力外，最關(guān)鍵的是它著床和最終發(fā)育成個體的潛力和能力。在本研究中，運(yùn)用筆者已經(jīng)建立的三維體外著床模型來對胚胎著床的氧濃度環(huán)境進(jìn)行檢測，同時直接取小鼠的囊胚和內(nèi)膜進(jìn)行共培養(yǎng)。整個著床模型的共培養(yǎng)時間是28h，因?yàn)轭A(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在同樣的培養(yǎng)環(huán)境下，28h 不會影響胚胎的生存。在本模型中，筆者第1 次見到了體外內(nèi)膜胚胎共培養(yǎng)時見到了內(nèi)膜組織蛻膜化的改變，在形態(tài)學(xué)外的生化學(xué)和組織化學(xué)水平證明了此模型確實(shí)發(fā)生了體外著床［14］。但是，胚胎著床黏附以后的穿入或者侵入則相對少見。雖然筆者也試過將培養(yǎng)的時間從28h 延長到36h 或者更長，但是胚胎很容易消失或者變形塌陷。這種情況有可能和胚胎處于氧濃度過高的環(huán)境中所致。當(dāng)將低氧環(huán)境運(yùn)用到已經(jīng)建立的體外著床模型的時候，結(jié)果顯示在2%氧濃度的環(huán)境下，胚胎黏著率為41.4%，雖然從絕對數(shù)值上低于大氣氧濃度對照組的53.2%，但兩組的胚胎黏著率并沒有統(tǒng)計學(xué)差異，似乎和體內(nèi)缺氧環(huán)境適宜胚胎著床的情況不相吻合。

進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，從形態(tài)學(xué)上，內(nèi)膜組織及胚胎均并未發(fā)生異常改變。如圖2 所示，兩組的內(nèi)膜細(xì)胞未有明顯形態(tài)學(xué)差異，并且缺氧組的組織細(xì)胞也未出現(xiàn)細(xì)胞皺縮壞死等現(xiàn)象。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者還進(jìn)一步將兩組內(nèi)膜組織的切片圖片進(jìn)行了多點(diǎn)的采樣，對比它們兩組內(nèi)膜組織腔上皮層厚度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有統(tǒng)計學(xué)差異。更加說明了在形態(tài)學(xué)層面，內(nèi)膜組織沒有發(fā)生改變。但是，通過TUNEL 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)的檢測，筆者發(fā)現(xiàn)體外模型中的子宮內(nèi)膜組織的間質(zhì)細(xì)胞明顯出現(xiàn)了凋亡細(xì)胞。這說明缺氧的環(huán)境未必能夠維持體外培養(yǎng)內(nèi)膜組織在體內(nèi)的狀況，這可能就是導(dǎo)致胚胎黏著率降低的原因。胚胎著床的過程需要胚胎和子宮內(nèi)膜完美對話。以往的觀點(diǎn)認(rèn)為，只要胚胎好，著床的概率就會提高，但近幾年的研究認(rèn)為，子宮是一個比較靈活的器官，它對外界的環(huán)境也是非常靈敏的，如它可以識別胚胎的好壞以及環(huán)境的不同而做出不同的反應(yīng)［15～17］。

雖然在本研究中運(yùn)用的是小鼠子宮內(nèi)膜組織的體外培養(yǎng)，但它對體外的環(huán)境依然非常敏感，在缺氧的環(huán)境中，內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，從而引起了早期胚胎黏著率的下降。雖然兩組沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但如果延長培養(yǎng)的時間，或者增加實(shí)驗(yàn)的樣本量，可能會有統(tǒng)計學(xué)差異。早在1961 年，Glenister 等就第1次報道了兔的胚胎與內(nèi)膜組織共培養(yǎng)體外著床模型，他們經(jīng)過幾天的培養(yǎng)也看到了子宮內(nèi)膜組織明顯看的壞死。另外一個問題就是2%的濃度可能適宜胚胎的生長發(fā)育，但對于子宮內(nèi)膜的培養(yǎng)來說，不太適宜。未來應(yīng)繼續(xù)探索略微提高培養(yǎng)環(huán)境的氧濃度(如提高到5% ～8%)，這樣既可以一定范圍內(nèi)保持內(nèi)膜細(xì)胞的活性，又可以盡量給予胚胎適宜的著床環(huán)境。綜上所述，筆者發(fā)現(xiàn)，2%的氧濃度在三維體外胚胎著床模型的運(yùn)用中，雖然沒有導(dǎo)體外胚胎黏著率的顯著降低，但卻誘導(dǎo)了體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜組織中細(xì)胞的凋亡。

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