1 H-MRS 中Cho/Lip 評價肝細(xì)胞肝癌血管生成的價值

姚 瑤 鄭 凱 趙振華 王伯胤

肝細(xì)胞肝癌(HCC)的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)與預(yù)后均與其新生血管的形成密切相關(guān)。目前公認(rèn)與腫瘤血管生成緊密相關(guān)的是微血管密度(MVD)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。腫瘤新生血管的結(jié)構(gòu)和功能都不同于正常血管，導(dǎo)致腫瘤的血供異常從而影響腫瘤細(xì)胞的物質(zhì)代謝。本研究的目的在于探討HCC 血管生成與腫瘤細(xì)胞代謝物的關(guān)系，以及運用1H-MRS 來預(yù)測腫瘤血管生成情況，為指導(dǎo)臨床治療提供依據(jù)及評估預(yù)后情況。

材料與方法

1.一般資料:對2012 年6 月～2013 年9 月臨床擬診為HCC 的病例進(jìn)行前瞻性研究，每個受試者行肝臟常規(guī)MRI及1H-MRS，所有病例嚴(yán)格執(zhí)行MRI 檢查的適應(yīng)證及禁忌證，檢查前未行任何治療，病灶最大直徑均≥2cm。剔除譜線質(zhì)量較差的病例后得到經(jīng)病理學(xué)證實為HCC 的57 例1H -MRS 譜線，選取癌旁肝組織1H-MRS 譜線做對照。其中13 例行免疫組化檢測MVD 及VEGF 表達(dá)。本研究經(jīng)紹興市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(2011017)，且取得患者知情同意書。

2.常規(guī)MRI 檢查方法:使用西門子3.0T 超導(dǎo)型磁共振掃描儀(Verio，德國Siemens 公司)，12 通道相控陣表面線圈檢查。檢查前訓(xùn)練患者呼吸，必要時囑患者吸氣末屏氣。常規(guī)平掃序列包括:快速擾相梯度回波(FLASH)T1WI(同反相位)，快速自旋回波(TSE)脂肪抑制T2WI。采取雙盲法由兩名放射科診斷醫(yī)師對所得MRI 圖像進(jìn)行診斷分析，并給出個人診斷，當(dāng)兩人診斷意見不一致時經(jīng)商討后得出診斷結(jié)果。

3.1H-MRS 檢查方法和數(shù)據(jù)分析:1H-MRS 檢查選用單體素點解析波譜(point -resolved spectroscopy，PRESS)序列:TR2000ms、TE30ms、反轉(zhuǎn)角90°、激勵次數(shù)(NEX)為80 次，時間為3 ～5min。體素大小為2cm ×2cm ×2cm。采集前先進(jìn)行自動預(yù)掃描，之后以T2WI 圖像作為1H -MRS 定位。將體素置于所采集圖像腫瘤興趣區(qū)(region of interest，ROI)范圍內(nèi)，避開腫瘤囊變、出血及壞死區(qū)域，肝組織內(nèi)體素的放置遠(yuǎn)離肝臟邊緣10mm 以上，并避開大的血管及肝內(nèi)膽管。檢查前禁食4h 以上，采用呼吸導(dǎo)航技術(shù)來避免呼吸運動偽影及體素的移位，當(dāng)運動較規(guī)律且幅度小時，可加大信號采集次數(shù)，增加波譜SNR［1，2］。掃描完成后，將波譜數(shù)據(jù)傳輸至西門子工作站進(jìn)行后處理，記錄每個受試者Cho 峰及Lip 峰的峰下面積和Cho/Lip 峰下面積比。

4.免疫組化檢測MVD 及VEGF 表達(dá):13 例穿刺或手術(shù)切除取得的HCC 組織標(biāo)本，盡量與MRS 所取ROI 相同，全部石蠟標(biāo)本均行2.5μm 連續(xù)切片，采用標(biāo)準(zhǔn)的avidin - biotin -peroxidase 病理技術(shù)檢測其VEGF、CD34 表達(dá)情況。每組實驗均設(shè)立陰性對照。免疫組化結(jié)果判讀:(1)VEGF 特異性抗體的免疫染色結(jié)果采用IRS 的方法進(jìn)行半定量測定，IRS 的具體計算方法如下:染色強(qiáng)度(SI)分級:0 分:不顯色;1 分:淺黃色;2 分:棕黃色;3 分:深棕色;染色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(PP):0分:不顯色;1 分:染色細(xì)胞≤10%;2 分:染色細(xì)胞11% ～50%;3 分:染色細(xì)胞51% ～80%;4 分:染色細(xì)胞≥81%，IRS= SI×PP。(2)MVD 測定采用Weidner［3］技術(shù)，先在低倍鏡(×40)視野下找到“熱點(hot spot)”，然后在高倍鏡(×200)視野下任選不重復(fù)的5 個視野，計算全部橫切和縱切的陽性血管數(shù)，取平均值作為該病例的MVD 值。以上均請兩位病理科醫(yī)生分別進(jìn)行評估，采取雙盲法，然后相互交換切片，當(dāng)兩人意見不一致時經(jīng)商討后得出結(jié)果。

結(jié) 果

1.Cho/Lip 峰下面積比在HCC 病灶組與對照組的差異:列入統(tǒng)計的57 例HCC 病灶組及對照組譜線均基線平穩(wěn)、信噪比高及主要波峰可辨認(rèn)，在3.2μg/L 和1.3μg/L 處分別可見高聳的Cho 峰和Lip 峰(圖1)。病灶組Cho/Lip 峰下面積比為0.322±0.475，對照組的Cho/Lip 峰下面積比為0.238 ±0.529，病灶組明顯高于對照組，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖1 HCC 患者癌旁肝組織及HCC 病灶的1H-MRS 譜線

2.HCC 病灶免疫組化檢測結(jié)果:所有病例均經(jīng)病理學(xué)證實，其中32 例為穿刺活檢，其取材較少無法行免疫組化檢查，另有12 例為外院病理學(xué)證實，其標(biāo)本無法獲取;其余13 例為筆者醫(yī)院手術(shù)切除或穿刺取材較多的病例，對其進(jìn)行HE 染色和免疫組化檢查(圖2)。CD34 在HCC 病灶中呈陽性表達(dá)，陽性染色局限于血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)，形成條狀或環(huán)狀，呈彌漫分布。本組13 例HCC 病灶MVD 值為46 ～172，平均MVD 值為86。VEGF 的陽性表達(dá)見于HCC 細(xì)胞膜和胞質(zhì)，呈灶性分布。按照IRS 的值分為0 ～12 總共13 個等級，平均IRS 為5。對HCC 組織的MVD 與VEGF 的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，兩者間相關(guān)性不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.340，圖3)。

圖2 HCC 患者的免疫組化檢查結(jié)果

圖3 13 例HCC 組織的MVD 與VEGF 表達(dá)的關(guān)系

3.Cho/Lip 峰下面積比和MVD、VEGF 表達(dá)的關(guān)系:經(jīng)分析13 例HCC 組織的MVD 隨著Cho/Lip 峰下面積比值的增加而增加，二者之間呈正相關(guān)(r =0.719，P = 0. 006，圖4)。但分析其VEGF 表達(dá)與Cho/Lip 峰下面積比的關(guān)系，結(jié)果顯示相關(guān)性不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.523，P=0.065，圖5)。

圖4 經(jīng)Pearson 分析13 例HCC 組織MVD 與Cho/Lip 峰下面積比的關(guān)系

圖5 經(jīng)Spearman 分析13 例HCC 組織VEGF 表達(dá)與Cho/Lip 峰下面積比的關(guān)系

討 論

1.1H-MRS 各代謝物水平在HCC 中的意義:1H-MRS 能觀察腫瘤能量代謝、糖代謝、氨基酸和脂肪酸等有關(guān)的代謝物，使對肝臟腫瘤的影像學(xué)認(rèn)識深入到微觀功能和生化水平。本研究采用代謝物半定量分析方法，主要觀察Cho 峰及Lip 峰的變化，得到它們的峰下面積，然后計算Cho/Lip 峰下面積比。

脂質(zhì)峰群，包括甲基峰(Lip1，0.9μg/L)、亞甲基峰(Lip2，1.3μg/L)和鄰近羧基及烯屬基團(tuán)的亞甲基峰(Lip3 和Lip4，2.0 及2.8μg/L)，而Lip2 峰是脂質(zhì)峰群中恒定出現(xiàn)、含量最高且易于檢測的代謝物峰，因此備受研究者關(guān)注，且常用作1H -MRS 肝臟檢查的內(nèi)部參照代謝物［4］。Cho 峰位于3.2μg/L 處，是細(xì)胞膜磷脂代謝的成分之一。HCC 由于細(xì)胞增殖活躍和有絲分裂增加導(dǎo)致細(xì)胞膜轉(zhuǎn)換增加，Cho 峰常明顯升高［5，6］。Inglese 等［7］研究表明Cho 含量有助于評估腫瘤細(xì)胞的惡性程度，且隨著腫瘤惡性程度的增加而增加。本研究采用半定量分析Cho/Lip 峰下面積比，結(jié)果顯示病灶組Cho/Lip 峰下面積比高于對照組(n=57)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0. 05)。Kuo等［8］對1H-MRS 活體肝臟腫瘤的研究和董愛生等［9］研究均表明，相對于正常肝臟組織，HCC 的Cho/Lip比值升高，與本研究結(jié)果一致。

2.HCC 腫瘤血管生成的意義:血管生成(angiogenesis)是指從已有的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展而形成新的血管。正常人的血管生成被嚴(yán)格控制在某些特定的生理過程中，如生殖、發(fā)育和創(chuàng)口愈合等;而持續(xù)、失控的血管生成則是某些病理改變?nèi)缒[瘤生長的特征。腫瘤血管形成后不僅為其供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞不可抑制地生長、增殖，而且新生血管多為幼稚血管，管壁僅為一層內(nèi)皮細(xì)胞，缺乏平滑肌細(xì)胞的阻擋，這為其浸潤、轉(zhuǎn)移提供了有利的條件［10］。HCC 是富血供腫瘤，且HCC 的血管生成與其生物學(xué)行為密切相關(guān)，因此定量分析HCC 血管生成至關(guān)重要。研究表明MVD 是目前評價腫瘤血管生成的金標(biāo)準(zhǔn)，目前臨床上也多采用此方法［11］。HCC 中CD34 標(biāo)記的血管非常豐富，因此本研究亦采用此方法。

參與調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的因子很多，其中VEGF被認(rèn)為是作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管生成，特異性最高、功能最強(qiáng)的調(diào)控因子。有研究顯示HCC 中VEGF 陽性和陰性者M(jìn)VD 值差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示VEGF 與MVD 值呈正相關(guān)。本研究分析13 例HCC 病灶MDV 值和VEGF 表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果顯示MVD 與VEGF 表達(dá)的相關(guān)性不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，與之前查閱文獻(xiàn)不一致。分析其原因，一方面是本研究行免疫組化檢查的病例數(shù)過少，另一方面是VEGF 雖是作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生成調(diào)控因子，但腫瘤血管生成還受其他生成因子如黏附因子等的影響，且此過程還受血管抑制素等抑制因子的影響。另外定量分析HCC 血管生成的金標(biāo)準(zhǔn)是MVD，但腫瘤的血管生成還與其血管面積、直徑、成熟情況等有關(guān)。

3.Cho/Lip 峰下面積比與腫瘤血管生成的關(guān)系:HCC 的生長依賴于新生血管，較多研究已證明MVD及VEGF 表達(dá)與HCC 的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)與預(yù)后密切相關(guān)。國內(nèi)已有研究表明，31P -MRS 檢測HCC 各代謝物的變化與血管生成具有一定的關(guān)系，且腫瘤血管生成的異質(zhì)性會影響細(xì)胞的代謝和31P -MRS 的檢測結(jié)果，但兩者之間的關(guān)系還需進(jìn)一步驗證［12，14］。Kuo 等［8］報道腫瘤內(nèi)Cho/Lip 比對于鑒別肝臟良、惡性腫瘤有一定的臨床價值，惡性腫瘤的Cho/Lip 大于良性腫瘤。

本研究首次對HCC 病灶中同一區(qū)域內(nèi)部的MVD 與Cho/Lip 峰下面積比的相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HCC 中MVD 與Cho/Lip 峰下面積比呈正相關(guān)(r=0.719，P=0.006)，這提示HCC 的MVD 可能與腫瘤的細(xì)胞代謝有一定關(guān)系。Lip 峰易于檢測且恒定出現(xiàn)，常用作1H -MRS 肝臟檢查的內(nèi)部參照代謝物，Cho 峰反映了細(xì)胞膜新陳代謝的水平，在生長迅速的腫瘤組織中Cho 峰常升高［8］。MVD 反映了局部組織的血供情況，由于腫瘤生長對血供的依賴，在腫瘤內(nèi)會誘導(dǎo)生成大量的新生毛細(xì)血管［14，15］。

上述3 點反映了腫瘤組織的代謝水平及生長情況，亦解釋了MVD 與Cho/Lip 峰下面積比呈正相關(guān)，臨床工作中可以用Cho/Lip 峰下面積比間接地評估HCC 病灶的MVD。另外，本研究還分析了VEGF 表達(dá)與Cho/Lip 峰下面積比的關(guān)系，結(jié)果顯示差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。原因在于病例過少和取材，無法保證所取組織層面與1H -MRS 所取興趣區(qū)完全一致，有可能所取組織層面不在1H -MRS 檢測的層面，還有部分病例僅用穿刺活檢組織進(jìn)行免疫組化測定，會造成結(jié)果有一定的差異。VEGF 雖是作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生成調(diào)控因子，但并不是血管生成的唯一因素，血管生成還受其他諸多因素的影響，還需要進(jìn)一步研究。

總之，HCC 病灶組Cho/Lip 峰下面積比與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明肝臟1H -MRS 技術(shù)對于HCC 的診斷有較高的臨床應(yīng)用價值。1H -MRS 檢測HCC 病灶的Cho/Lip 峰下面積比與腫瘤組織MVD呈正相關(guān)，測定Cho/Lip 峰下面積比對預(yù)測HCC 腫瘤組織血管生成具有重要的臨床價值，1H -MRS 為動態(tài)監(jiān)測腫瘤血管生成及抗腫瘤血管生成藥物療效的評價提供一種潛在、無創(chuàng)、重復(fù)性好的影像學(xué)檢查方法，同時還能通過測定腫瘤組織MVD 間接地反映腫瘤細(xì)胞的代謝能力。

1 Katz - Brull R，Rofsky NM，Lenkinski RE. Breathhold abdominal and thoracic proton MR spectroscopy at 3T［J］. Magnetic Resonance in Medicine，2003，50(3):461 -467

2 Qayyum A. MR spectroscopy of the liver:principles and clinical applications［J］. Radiographics，2009，29(6):1653 -1664

3 Weidner N. Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer［J］. American Journal of Pathology，1995，147(1):9 -19

4 Wu B，Peng WJ，Wang PJ，et al. In vivo1H magnetic resonance spectroscopy in evaluation of hepatocellular carcinoma and its early response to transcatheter arterial chemoembolization［J］. Chinese Medical Sciences Journal，2006，21(4):258 -264

5 Burtscher I M，Holta?s S. Proton MR spectroscopy in clinical routine［J］. Journal of Magnetic Resonance Imaging，2001，13(4):560 -567

6 Tedeschi G，Lundbom N，Raman R，et al. Increased choline signal coinciding with malignant degeneration of cerebral gliomas:a serial proton magnetic resonance spectroscopy imaging study［J］. Journal of Neurosurgery，1997，87(4):516 -524

7 Inglese M，Li BSY，Rusinek H，et al. Diffusely elevated cerebral choline and creatine in relapsing ‐ remitting multiple sclerosis［J］.Magnetic Resonance in Medicine，2003，50(1):190 -195

8 Kuo YT，Li CW，Chen CY，et al. In vivo proton magnetic resonance spectroscopy of large focal hepatic lesions and metabolite change of hepatocellular carcinoma before and after transcatheter arterial chemoembolization using 3.0 -T MR scanner［J］. Journal of Magnetic Resonance Imaging，2004，19(5):598 -604

9 董愛生，田建明，陸建平，等. 肝臟腫瘤的活體氫質(zhì)子MR 波譜和病理分析［J］. 中華放射學(xué)雜志，2009，43(3):270 -274

10 Yonenaga Y，Mori A，Onodera H，et al. Absence of smooth muscle actin-positive pericyte coverage of tumor vessels correlates with hematogenous metastasis and prognosis of colorectal cancer patients［J］.Oncology，2005，69(2):159 -166

11 Folkman J，Beckner K. Angiogenesis imaging［J］. Academic Radiology，2000，7(10):783 -785

12 于德新，馬祥興，張宗立，等.31P-MRS 無創(chuàng)量化肝細(xì)胞癌細(xì)胞代謝水平及其與血管生成的關(guān)系［J］. 中華肝膽外科雜志，2010，16(4):261 -265

13 于德新，李傳福. 肝細(xì)胞癌腫瘤血管生成及其代謝的功能MR 評價［D］. 濟(jì)南:山東大學(xué)博士畢業(yè)論文，2006

14 Bell JD，Cox IJ，Sargentoni J，et al. A 31P and 1H-NMR investigation in vitro of normal and abnormal human liver［J］. Biochim Biophys Acta，1993，1225(1):71 -77

15 Lim AK，Patel N，Hamilton G，et al. The relationship of in vivo 31PMR spectroscopy to histology in chronic hepatitis C［J］. Hepatology，2003，37(4):788 -794