糖尿病患者脂肪干細胞(ADSCs)的分離、培養(yǎng)及鑒定研究

朱 琳 劉志飛 張 星 王曉軍

糖尿病是長期威脅人類健康的全球性難題，現(xiàn)有治療方法均不甚理想。目前認為，糖尿病慢性并發(fā)癥中血管病變是主要和始發(fā)的致病因素，而血管病變的關(guān)鍵靶組織為內(nèi)皮細胞［1］。通過移植內(nèi)皮細胞或者具有誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細胞能力的干細胞便成為一種極具前景的治療方法。最新研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs 是血管組織工程優(yōu)秀的種子細胞，可被誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細胞。目前，關(guān)于糖尿病患者ADSCs 的研究較少，糖尿病患者ADSCs 是否具有和正常人ADSCs 類似的生物學(xué)特性，是實現(xiàn)糖尿病患者ADSCs 能否自體移植治療的關(guān)鍵問題。本研究目的在于建立糖尿病患者來源ADSCs 的分離、培養(yǎng)流程，并比較其與健康人ADSCs 的差異，為實現(xiàn)糖尿病患者ADSCs 自體移植治療提供理論依據(jù)。

資料與方法

1.材料:(1)實驗試劑:高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(美國GIBCO 公司);Ⅰ型膠原酶、胰酶(美國Sigma 公司);CD29、CD44、CD105 熒光標記抗體(美國BD Bioscience 公司)。(2)脂肪組織:糖尿病患者脂肪組織來源于北京協(xié)和醫(yī)院基本外科合并糖尿病的手術(shù)患者的腹壁脂肪。健康人脂肪組織來源于北京協(xié)和醫(yī)院整形外科吸脂手術(shù)患者。

2.實驗方法:(1)糖尿病患者ADSCs 提取培養(yǎng):①取糖尿病患者腹壁脂肪組織30ml，充分剔除血管、結(jié)締組織，充分剪碎為大小約1mm×1mm×1mm 小塊。將脂肪懸液轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，共3 管，每管加入PBS 洗滌，650r/min 離心，離心后吸出下層洗滌液。3 管分為以下3 組:A 組(2 倍體積0.075%Ⅰ型膠原酶)、B 組(2 倍體積0.10%Ⅰ型膠原酶)、C 組(2 倍體積0.20%Ⅰ型膠原酶)。根據(jù)上述3 管終體積按1∶200比例加入雙抗，封口膜封口后置入37℃恒溫水浴箱振蕩消化60min 并過濾備用;②3 個不同消化濃度的細胞懸液以220r/min 離心，小心吸去上層油脂和上清液，每管沉淀加入PBS 10ml 吹洗后1100r/min 離心，移出上層液體每管沉淀加入DMEM -HG +10%FBS 5ml 吹勻細胞，種植于T-25 培養(yǎng)瓶內(nèi)。于48h 首次換液，之后每72h 換液1 次，達80%細胞融合時傳代。(2)健康人ADSCs 提取培養(yǎng):①取健康人吸脂所得脂肪組織30ml，650r/min 離心后，吸出下層吸脂麻醉藥，PBS 洗滌后再次離心，吸出下層洗滌液后備用。根據(jù)脂肪組織量加入0.3%的膠原酶適量至膠原酶濃度0.075%、0.2%BSA 2ml，雙抗按1∶200比例加入，封口膜封口后置入37℃恒溫水浴箱震蕩消化60min;②其余步驟同糖尿病患者ADSCs 提取培養(yǎng)步驟。(3)流式細胞術(shù)鑒定:P3 代ADSCs 以2.5g/L 胰酶消化，以2 ×105細胞量接種，分別加入CD29、CD44、CD105 抗體，進行流式細胞儀檢測。

結(jié) 果

1.糖尿病患者ADSCs 的分離和培養(yǎng):3 管不同濃度的細胞懸液種植于3 個T-25 培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果如下:(1)A 組:消化結(jié)束后管內(nèi)組織分3 層，表層油滴，中層混合了大塊未消化組織的懸液，下層為微混的消化液。接種于培養(yǎng)瓶后即時鏡下觀察可見大量圓形細胞，由于未使用紅細胞裂解液，培養(yǎng)液中混雜的較小圓形紅細胞比較多，同時還有部分未消化組織和油滴。12h 可見細胞逐漸開始貼壁變形，24 ～48h 后細胞基本變形為短梭形或者卵圓形。9 天后細胞平鋪超過瓶底80%以上，常規(guī)消化傳代，生長特性與正常人ADSCs 基本一致(圖1)。(2)B 組:消化結(jié)果與A 管基本一致，仍存在未消化組織，但細胞數(shù)較多，原代培養(yǎng)經(jīng)過7 天即可傳代(圖2)。(3)C 組:消化結(jié)束后管內(nèi)組織分3 層，表層油滴，中層為大量黃色絮狀組織，未消化顆?；鞠?，下層為消化液。接種后觀察培養(yǎng)瓶內(nèi)基本沒有細胞，主要是未完全清洗干凈的油滴，24h 后亦未見有貼壁細胞，未進行換液傳代(圖3)。

圖1 A 組培養(yǎng)2 天后結(jié)果

圖3 C 組接種后即時觀察結(jié)果

2.健康人ADSCs 的鑒定:詳見表1。

表1 流式細胞儀檢測健康人ADSCs 表面標志物(%)

3.糖尿病患者ADSCs 的鑒定:流式細胞儀檢測結(jié)果見表2。糖尿病患者ADSCs 鑒定可見CD29、CD44、CD105 表達陽性，表明其具有與正常人ADSCs類似的生物學(xué)性質(zhì)。

表2 流式細胞儀檢測糖尿病患者ADSCs 表面標志物(%)

討 論

糖尿病并發(fā)癥是一項全球性的治療難題，研究者們一直致力于尋找一種安全、有效、經(jīng)濟的治療方法。干細胞移植被認為是新的希望。一種合適的干細胞至少應(yīng)該滿足以下幾個標準:①來源廣泛，大量存在;②獲取過程應(yīng)無創(chuàng)或微創(chuàng);③能夠以可調(diào)控和可復(fù)制的方式向多個方向誘導(dǎo)分化;④能夠安全有效的進行自體同源或同種異源移植;⑤能夠以當前組織工程學(xué)流程大量制造［2］。ADSCs 具有大量的優(yōu)勢滿足上述標準:脂肪組織在人體內(nèi)大量存在，脂肪抽吸術(shù)創(chuàng)傷很小，不易造成供體部位病損;1g 脂肪組織可以分離得到5 ×103個細胞，是同質(zhì)量骨髓組織所得間充質(zhì)干細胞的500 倍［3］;在分化性能上，ADSCs 表現(xiàn)尤為出色，具有向大多數(shù)中胚層組織分化的能力，包括成脂、成骨、成軟骨、心肌、骨骼肌、平滑肌等，而對于非中胚層組織，可分化為內(nèi)皮細胞、肝細胞、上皮細胞、神經(jīng)元細胞及胰腺細胞［4］。

目前普遍認為，ADSCs 是來源于脂肪組織的間充質(zhì)干細胞，因此其分離方法沿用了間充質(zhì)干細胞的分離流程:即流式細胞分選法、磁珠分離法、密度梯度離心法和貼壁篩選法。本實驗選擇了反復(fù)貼壁篩選法，并采用了Hiroshi Mizuno 方法，即將脂肪組織洗滌以去除明顯的紅細胞、麻醉液、結(jié)締組織，然后加入0.075%的膠原酶，在37℃消化0.5 ～1.0h［5］。實驗中應(yīng)注意隨時觀察離心管中組織懸液的狀態(tài)，如果分為明顯3 層，則說明消化已基本完成，應(yīng)結(jié)束消化，如果觀察到大量絮狀物質(zhì)，多為消化過度細胞碎裂產(chǎn)生，此時應(yīng)適當縮短消化時間或者降低消化酶的濃度。消化結(jié)束后應(yīng)使用等量的細胞培養(yǎng)基(DMEM +10%FBS)中止消化。在本實驗中并未使用培養(yǎng)基中止，主要出于以下兩點考慮:①大量多次培養(yǎng)需要的培養(yǎng)基較多，實驗經(jīng)費有限;②膠原酶主要作用部位是細胞外基質(zhì)，對于細胞本身的消化作用較胰酶輕，如果消化時間把握較好，消化結(jié)束后可以迅速過濾離心，然后加入PBS 洗滌，那么不加培養(yǎng)基中止消化對最終細胞種植基本沒有影響。

相比于正常人ADSCs，糖尿病患者ADSCs 的差異主要表現(xiàn)在以下兩個方面:(1)供體年齡:一般除了1 型糖尿病以外，大多數(shù)2 型糖尿病患者年齡偏大，而年齡對于ADSCs 的影響目前尚未達成完全共識。一般認為，供者的年齡越小，細胞的黏附增殖活力越好［6，7］。Aust 等［8］研究后認為，ADSCs 的衰老與供體的體重指數(shù)呈負相關(guān)，而與年齡無關(guān)。Harris等［9］將來自不同年齡的ADSCs 進行CD31 的負分選，得到的細胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后檢測CD31 的表達，最終的結(jié)果是認為ADSCs 表現(xiàn)出對年齡的獨立性，后者并不影響ADSCs 向內(nèi)皮細胞的分化。(2)獲取脂肪的方式和部位:正常人的脂肪多數(shù)通過吸脂術(shù)獲取，糖尿病患者脂肪則多數(shù)通過手術(shù)直接取得。吸脂術(shù)本身并不會對ADSCs 造成負面影響，但吸脂針的孔徑會影響脂肪顆粒的大小，進而影響ADSCs 分離的難易程度，而手術(shù)直接獲取脂肪組織雖然對ADSCs 活性不會有影響，但明顯增加了分離的難度［10］。對于脂肪來源部位，Schipper 等［6］研究認為，與腹部、大腿和乳房來源的脂肪組織相比，同等體積的人前臂脂肪組織中含有更多的ADSCs。

在本實驗糖尿病患者ADSCs 的分離中，考慮了以下幾個方面:首先糖尿病患者通過手術(shù)直接獲取的脂肪顆粒明顯較粗，采用正常人一樣的消化程序是否能獲得相當數(shù)量的細胞?其次對于糖尿病本身潛在的對ADSCs 活性的影響，如何優(yōu)化實驗流程?在實際實驗中，首先將獲取的脂肪組織盡可能剪碎，這個步驟在這種非吸脂術(shù)獲取的脂肪組織中很重要，因為足夠細小的脂肪顆粒意味著更多與消化液接觸的表面積，也就意味著更好的消化效果和更短的消化時間。其次設(shè)定了3 個梯度的消化酶濃度，其中0.075%是正常人ADSCs 的分離濃度，而0.10%則是考慮到上述消化難度的增加而設(shè)計，最后0.20%其實是一個試驗性的濃度，觀察在高濃度的消化酶作用下脂肪組織的消化表現(xiàn)，當然也不排除由于消化難度增加使之成為最合適的消化酶濃度的可能。最后的優(yōu)化為放棄使用紅細胞裂解液，考慮如下:①在正常人的ADSCs 培養(yǎng)中，使用紅細胞裂解液仍然會殘留紅細胞，而這些紅細胞通過數(shù)次換液傳代是可以去除的，對細胞生長影響不大;②紅細胞裂解液中普遍含EDTA，對紅細胞裂解的同時該成分也會對其他細胞產(chǎn)生損傷;③紅細胞裂解的時間較長，對細胞活性也會產(chǎn)生影響。

從結(jié)果來看，0.1%的消化酶濃度獲得了最多的貼壁細胞，傳代也更快，適用于正常人ADSCs 培養(yǎng)、傳代也適用于糖尿病患者ADSCs，而更高的消化酶濃度(0.2%)會導(dǎo)致細胞破壞。最終總結(jié)得出以下結(jié)論:①采用和正常人ADSCs 類似的分離方法，可以分離得到來自糖尿病患者自身的ADSCs;②分離中盡可能剪碎組織很重要;③原代培養(yǎng)中放棄使用紅細胞裂解液不會對ADSCs 的培養(yǎng)產(chǎn)生不利影響。

在本實驗相同的培養(yǎng)條件下，并未發(fā)現(xiàn)糖尿病患者ADSCs 基質(zhì)細胞相關(guān)標志物與正常人相比存在差異。由脂肪組織初始分離的貼壁細胞其實是一個混合的細胞系，其中包括了多種細胞的集落生成單位，如成纖維細胞、成脂細胞、造血干細胞、成骨細胞等，這找混合的細胞系基質(zhì)細胞相關(guān)標志物的表達率并不高。而經(jīng)過數(shù)代的貼壁培養(yǎng)，其他細胞逐漸凋亡，而間充質(zhì)干細胞依靠強大的復(fù)制更新能力逐漸占據(jù)了主要地位，此時形態(tài)均一的貼壁細胞才成為ADSCs，而基質(zhì)細胞相關(guān)標志物的表達亦逐漸上升。所以，對于ADSCs 進行基質(zhì)細胞相關(guān)標志物的檢測，其實是從另一方面印證了ADSCs 的復(fù)制更新能力。綜合本實驗得出結(jié)論，糖尿病患者自身ADSCs 基質(zhì)細胞相關(guān)標志物與正常人相比沒有差異。

在ADSCs 的培養(yǎng)中，實際上影響最終培養(yǎng)結(jié)果的因素較多，而本實驗中限于標本來源有限(首先必須是開腹手術(shù)的糖尿病患者，其次每位患者能夠取的脂肪遠較吸脂術(shù)的少，約5 ～10 毫升/人)，很多應(yīng)該研究的糖尿病患者ADSCs 培養(yǎng)條件都沒能進行，包括不同培養(yǎng)基的選擇，不同的接種密度，不同的胎牛血清濃度。下一步應(yīng)在充足的標本來源情況下，充分設(shè)計實驗分析上述各個條件，進一步建立糖尿病患者ADSCs 最佳的分離和培養(yǎng)流程，并對其生物學(xué)特性展開進一步的研究。

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